Agregación celular encapsulada en matriz de membrana basal para investigar la formación de tejido del bazo murino

Summary

Este artículo describe un protocolo para agregar y encapsular células del bazo dentro de una matriz semisólida de membrana basal. Las construcciones de matriz de membrana basal se pueden utilizar en cultivos tridimensionales para estudiar el desarrollo de organoides, o para estudios de trasplante in vivo y regeneración de tejidos.

Abstract

El bazo es un órgano inmunitario que desempeña un papel clave en las respuestas inmunitarias transmitidas por la sangre. La pérdida anatómica o funcional de este tejido aumenta la susceptibilidad a infecciones sanguíneas graves y sepsis. El autotrasplante de cortes de bazo se ha utilizado clínicamente para reemplazar el tejido perdido y restaurar la función inmunitaria. Sin embargo, el mecanismo que impulsa la regeneración robusta e inmunológicamente funcional del tejido del bazo no se ha dilucidado por completo. Aquí, nuestro objetivo es desarrollar un método para agregar y encapsular células del bazo dentro de una matriz semisólida con el fin de investigar los requisitos celulares para la formación de tejido del bazo. Las construcciones celulares encapsuladas en la matriz de la membrana basal son susceptibles tanto para el cultivo in vitro de organoides tridimensionales como para el trasplante bajo la cápsula renal para evaluar directamente la formación de tejido in vivo . Mediante la manipulación de las células de entrada para la agregación y encapsulación, demostramos que las células estromales neonatales derivadas del injerto PDGFRβ⁺MAdCAM-1^– son necesarias para la regeneración del tejido del bazo en modelos de trasplante animal.

Introduction

La rotura traumática del bazo y la aparición de múltiples nódulos esplénicos en el cuerpo fue uno de los primeros indicios de que el tejido del bazo albergaba capacidad regenerativa ^1,2. Posteriormente, se introdujeron en la clínica los autotrasplantes de bazo para preservar el tejido del bazo en pacientes que requerían esplenectomía de urgencia³. Sin embargo, a pesar de ser parte de la práctica clínica durante décadas, se sabe muy poco sobre cómo se regenera el bazo. Los modelos de trasplante animal han proporcionado información sobre múltiples parámetros de la regeneración del bazo y la función inmune ^4,5. En particular, las modificaciones experimentales en el método de preparación del injerto han permitido estudiar con mayor detalle la regeneración tisular a nivel celular y molecular.

Los trasplantes que involucran cortes de bazo entero pasan por una fase de necrosis masiva antes de que se reconstruya una nueva estructura del bazo⁶. La fase inicial de la necrosis del injerto sugiere que la mayor parte del tejido trasplantado consiste en gran parte en glóbulos rojos y blancos y es innecesario para la regeneración del bazo. Esto se investigó experimentalmente mediante la exclusión de células hematopoyéticas de injertos de bazo antes del trasplante bajo la cápsula de riñón de ratón. En este caso, se demostró que la fracción no leucocitaria/no eritrocitaria del bazo, que incluye células estromales y endoteliales, es suficiente para inducir la formación de tejido de novo ⁷. El tejido del estroma del bazo podría procesarse aún más en una suspensión unicelular, lo que permitiría el uso de tecnologías de clasificación celular para manipular la composición del injerto celular. Mediante la eliminación selectiva de tipos de células candidatas, se identificaron dos poblaciones de células estromales CD45-TER-119^– que eran indispensables para el desarrollo del injerto: una población de células CD31⁺CD105⁺MAdCAM-1⁺ de tipo endotelial y una población de células mesenquimales PDGFRβ⁺ más ampliamente definida⁸.

La construcción de injertos a partir de células del bazo varía en términos de materiales de soporte y procesos de carga celular. Los bazos de ingeniería tisular se han preparado previamente cargando unidades esplénicas en un andamio de polímero de ácido poliglicólico/ácido láctico^{poli-L 5,9}. Curiosamente, las células estromales del bazo absorbidas en una esponja de colágeno no lograron injertarse, mientras que las células estromales agregadas y cargadas sobre una lámina de colágeno facilitaron la regeneración del bazo⁸. También se ha demostrado que la resuspensión de células estromales del bazo dentro de una matriz de Matrigel induce la agregación celular en condiciones de cultivo tridimensionales¹⁰. Sin embargo, este método no se ha probado para su uso en modelos de trasplante. El objetivo general del protocolo actual es agregar y encapsular a la fuerza células estromales del bazo directamente dentro de la matriz de la membrana basal, que posteriormente pueden transferirse a un sistema de cultivo de tejidos in vitro tridimensional o utilizarse como vehículo para trasplantes de modelos animales (Figura suplementaria 1).

Protocol

Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos experimentales aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Queensland (UQBR/079/19). 1. Recolección de tejidos y preparación de células estromales Eutanasia de ratones donantes neonatos BALB/c machos y/o hembras de 0,5 días de edad mediante la inducción de la hipotermia envolviendo a los animales dentro del papel de seda y colocándolos bajo hielo picado dur…

Representative Results

La agregación celular es importante para promover el contacto y la señalización de célula a célula. El encerramiento de los agregados celulares dentro de la matriz de la membrana basal apoyó ambos cultivos tridimensionales para la formación de organoides tisulares in vitro y facilitó la entrega mecánica de células en la cápsula renal para el trasplante de injerto. Para establecer estas construcciones, la matriz de la membrana basal se mantuvo primero en un estado fluídico en condiciones heladas. Post…

Discussion

La agregación de células neonatales del bazo dentro de un medio semisólido representa un método viable para generar construcciones de bazo. Se han utilizado protocolos similares basados en matrices de membrana basal para iniciar cultivos tridimensionales de bazo¹⁰. Aquí, demostramos que las construcciones de bazo son igualmente susceptibles a los sistemas de cultivo de organoides in vitro , así como a los modelos de trasplante in vivo . Cabe destacar que el trasplante de or…

Materials

96 Well Polypropylene 1.2 mL Cluster Tubes	Corning	CLS4401	For placing inside a 14 ml conical tube
B-mercaptoethanol	Gibco	21985023	Stock 55 mM, use at 50 uM
Collagenase D	Roche	11088858001
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138	From Clostridium histolyticum
Deoxyribonuclease I (DNase I)	Sigma-Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I from bovine pancreas,Type II-S, lyophilized powder, Protein ≥80 %, ≥2,000 units/mg protein
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	4500 mg/L Glucose, L-Glutamine, and Sodium Bicarbonate, without Sodium Pyruvate, Liquid. Sterile Filtered.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Without calcium chloride and magnesium chloride, sterile-filtered
Eclipse 200 μl Pipette Tips	Labcon	1030-260-000	Bevel Point
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-079	Lot# 1382243
GlutaMAX	Gibco	35050061	Stock 100X, use at 1X
Matrigel	Corning	354263	Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140076	Stock 100X, use at 1X
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122	Stock 10,000 units/ml Penicillin, 10,000 ug/ml Streptomycin
Reversible Cell Strainer	STEMCELL Technologies	27216	70 μm
Ring Tweezers	NAPOX	A-26	Ring size: 3 mm
Rock Inhibitor (Y-27632)	MedChemExpres	HY-10071
Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge	Thermofisher		Acceleration and deceleration speeds were set to 8
Ultra Fine Tweezers	EMS	78340-51S	Style 51S. Antimagnetic/anti-acid SA low carbon austenitic steel tweezers are corrosion resistant. Anti-glare satin finish.
Vicryl 5/0 Suture Ligapak Reel	Ethicon	J283G
Wiretrol II Long Wire Plunger	Drummond	5-000-2002-L	Stainless Steel Plunger, 25 & 50 μL/WRTL II, Long
Wound Clip Applier	MikRon	427630
Wound Clips	MikRon	427631	9 mm