マウス脾臓組織形成研究のための基底膜マトリックスカプセル化細胞凝集

Summary

この記事は半固体基底の膜のマトリックス内の脾臓のセルを凝集し、カプセル封入するためのプロトコルを記述する。基底膜マトリックスコンストラクトは、オルガノイド発生の研究、または in vivo 移植および組織再生研究のための三次元培養に使用できます。

Abstract

脾臓は、血液媒介性免疫応答に重要な役割を果たす免疫器官です。この組織の解剖学的または機能的な喪失は、重度の血液感染症および敗血症に対する感受性を高める。脾臓切片の自家移植は、失われた組織を補充し、免疫機能を回復させるために臨床的に使用されています。しかし、堅牢で免疫学的に機能する脾臓組織の再生を促進するメカニズムは完全には解明されていません。本研究では、脾臓細胞を半固体マトリックス内に凝集・カプセル化する方法を開発し、脾臓組織形成に必要な細胞を解明することを目指しています。基底膜マトリックスカプセル化された細胞コンストラクトは、三次元オルガノイドの in vitro 組織培養と、 in vivo 組織形成を直接評価するための腎臓カプセル下移植の両方に適しています。インプット細胞の凝集とカプセル化を操作することで、移植モデル動物移植モデルにおける脾臓組織の再生には、移植片由来のPDGFRβ⁺MAdCAM-1^– 新生児間質細胞が必要であることを実証しました。

Introduction

脾臓の外傷性破裂と体内の複数の脾臓結節の出現は、脾臓組織が再生能力を持っていることを示す最初の兆候の1つでした^1,2。脾臓自家移植は、緊急脾臓摘^{出術を必要とする}患者の脾臓組織を保存するために、後にクリニックに導入されました3。しかし、何十年にもわたって臨床診療の一部となっているにもかかわらず、脾臓がどのように再生するかについてはほとんど知られていません。動物移植モデルは、脾臓の再生と免疫機能の複数のパラメータに関する洞察を与えてきました^4,5。特に、移植片調製法の実験的変更により、組織再生を細胞および分子レベルでより詳細に研究できるようになりました。

脾臓全切片を含む移植は、新しい脾臓構造^{が再構築される前に}、大量壊死の段階を経る6。移植片壊死の初期段階は、移植された組織の大部分が赤血球と白血球で構成されており、脾臓の再生には不要であることを示唆しています。これは、マウス腎臓嚢の下に移植する前に、脾臓移植片から造血細胞を除外することによって実験的に調査されました。ここで、間質細胞と内皮細胞を含む脾臓の非白血球/非赤血球画分は、de novo組織形成を誘導するのに十分であることが示された⁷。脾臓間質組織をさらに単一細胞懸濁液に加工することで、細胞移植片の組成を操作するための細胞選別技術の使用が可能になります。候補細胞型を選択的に除去することにより、移植片の発生に不可欠な2つのCD45-TER-119^–間質細胞集団、すなわち内皮様CD31⁺CD105⁺MAdCAM-1⁺細胞集団と、より広義のPDGFRβ⁺間葉系^{細胞集団が}同定された8。

脾臓細胞からの移植片の構築は、支持体と細胞ローディングプロセスの点で異なります。組織工学的脾臓は、脾臓ユニットをポリグリコール酸/ポリL乳酸ポリマー足場^5,9にロードすることによって以前に調製されてきました。興味深いことに、コラーゲンスポンジに吸収された脾臓間質細胞は生着に失敗し、間質細胞が凝集してコラーゲンシート上にロードされると、脾臓の再生が促進されました⁸。マトリゲル基底膜マトリックス内の脾臓間質細胞の再懸濁も、3次元培養条件下で細胞凝集を誘導することが実証されている¹⁰。ただし、この方法は移植モデルでの使用についてはテストされていません。現在のプロトコルの全体的な目標は、脾臓間質細胞を基底膜マトリックス内に強制的に凝集して直接カプセル化することであり、その後、3次元のin vitro組織培養システムに移したり、動物モデル移植の媒体として使用したりできます(補足図1)。

Protocol

すべての動物実験は、クイーンズランド大学動物倫理委員会(UQBR/079/19)によって承認された実験プロトコルに従って実施されました。 1. 組織採取と間質細胞の調製 0.5〜1.5日齢の雄および/または雌のBALB / c新生児ドナーマウスを、ティッシュペーパーの中に動物を包み、砕いた氷の下に>10分間置くことにより、低体温を誘発して安楽死させます。注:?…

Representative Results

細胞凝集は、細胞間の接触とシグナル伝達を促進するために重要です。基底膜マトリックス内に細胞凝集体を包むことで、 in vitro 組織オルガノイド形成のための3次元培養と、移植片移植のための腎カプセルへの細胞の機械的送達の両方が容易になりました。これらの構造を確立するために、まず基底膜マトリックスを氷冷条件下で流動状態に維持しました。その後、濃縮された細胞?…

Discussion

半固体培地内での新生児脾臓細胞の凝集は、脾臓構築物を生成するための実行可能な方法である。同様の基底膜マトリックスベースのプロトコルが、3次元脾臓培養を開始するために使用されている¹⁰。ここでは、脾臓構造物が in vitro オルガノイド培養システムと in vivo 移植モデルに等しく従順であることを実証します。注目すべきは、 in vitro 培養脾臓?…

Materials

96 Well Polypropylene 1.2 mL Cluster Tubes	Corning	CLS4401	For placing inside a 14 ml conical tube
B-mercaptoethanol	Gibco	21985023	Stock 55 mM, use at 50 uM
Collagenase D	Roche	11088858001
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138	From Clostridium histolyticum
Deoxyribonuclease I (DNase I)	Sigma-Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I from bovine pancreas,Type II-S, lyophilized powder, Protein ≥80 %, ≥2,000 units/mg protein
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	4500 mg/L Glucose, L-Glutamine, and Sodium Bicarbonate, without Sodium Pyruvate, Liquid. Sterile Filtered.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Without calcium chloride and magnesium chloride, sterile-filtered
Eclipse 200 μl Pipette Tips	Labcon	1030-260-000	Bevel Point
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-079	Lot# 1382243
GlutaMAX	Gibco	35050061	Stock 100X, use at 1X
Matrigel	Corning	354263	Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140076	Stock 100X, use at 1X
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122	Stock 10,000 units/ml Penicillin, 10,000 ug/ml Streptomycin
Reversible Cell Strainer	STEMCELL Technologies	27216	70 μm
Ring Tweezers	NAPOX	A-26	Ring size: 3 mm
Rock Inhibitor (Y-27632)	MedChemExpres	HY-10071
Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge	Thermofisher		Acceleration and deceleration speeds were set to 8
Ultra Fine Tweezers	EMS	78340-51S	Style 51S. Antimagnetic/anti-acid SA low carbon austenitic steel tweezers are corrosion resistant. Anti-glare satin finish.
Vicryl 5/0 Suture Ligapak Reel	Ethicon	J283G
Wiretrol II Long Wire Plunger	Drummond	5-000-2002-L	Stainless Steel Plunger, 25 & 50 μL/WRTL II, Long
Wound Clip Applier	MikRon	427630
Wound Clips	MikRon	427631	9 mm