AGRÉGATION DE CELLULES ENCAPSULÉES DANS UNE MATRICE DE MEMBRANE BASALE POUR ÉTUDIER LA FORMATION DE TISSU DE RATE MURIN
Summary
Cet article décrit un protocole d’agrégation et d’encapsulation des cellules de rate dans une matrice de membrane basale semi-solide. Les constructions de matrice de membrane basale peuvent être utilisées en culture tridimensionnelle pour étudier le développement des organoïdes, ou pour des études de transplantation et de régénération tissulaire in vivo .
Abstract
La rate est un organe immunitaire qui joue un rôle clé dans les réponses immunitaires transmissibles par le sang. La perte anatomique ou fonctionnelle de ce tissu augmente la susceptibilité aux infections sanguines graves et à la septicémie. L’auto-transplantation de tranches de rate a été utilisée cliniquement pour remplacer les tissus perdus et restaurer la fonction immunitaire. Cependant, le mécanisme à l’origine d’une régénération robuste et immunologiquement fonctionnelle du tissu de la rate n’a pas été entièrement élucidé. Ici, nous visons à développer une méthode d’agrégation et d’encapsulation de cellules de rate dans une matrice semi-solide afin d’étudier les besoins cellulaires pour la formation du tissu de la rate. Les constructions cellulaires encapsulées dans la matrice de la membrane basale se prêtent à la fois à la culture tissulaire in vitro d’organoïdes tridimensionnels et à la transplantation sous la capsule rénale pour évaluer directement la formation tissulaire in vivo . En manipulant les cellules d’entrée pour l’agrégation et l’encapsulation, nous démontrons que les cellules stromales néonatales PDGFRβ+MAdCAM-1– dérivées du greffon sont nécessaires à la régénération du tissu de la rate dans des modèles de transplantation animale.
Introduction
La rupture traumatique de la rate et l’apparition de multiples nodules spléniques dans le corps ont été l’une des premières indications que le tissu de la rate abritait une capacité de régénération 1,2. Les autotransplantations de rate ont ensuite été introduites en clinique pour préserver le tissu de la rate chez les patients nécessitant une splénectomied’urgence 3. Pourtant, bien qu’elle fasse partie de la pratique clinique depuis des décennies, on sait très peu de choses sur la façon dont la rate se régénère. Les modèles de transplantation animale ont permis de mieux comprendre de multiples paramètres de la régénération de la rate et de la fonction immunitaire 4,5. En particulier, des modifications expérimentales de la méthode de préparation des greffons ont permis d’étudier plus en détail la régénération tissulaire au niveau cellulaire et moléculaire.
Les transplantations impliquant des tranches entières de rate subissent une phase de nécrose massive avant qu’une nouvelle structure de rate ne soit reconstruite6. La phase initiale de la nécrose du greffon suggère que la majeure partie des tissus transplantés est constituée en grande partie de globules rouges et blancs et n’est pas nécessaire à la régénération de la rate. Cela a été étudié expérimentalement en excluant les cellules hématopoïétiques des greffes de rate avant la transplantation sous la capsule rénale de souris. Ici, la fraction non leucocytaire/non érythrocytaire de la rate, qui comprend les cellules stromales et endothéliales, s’est avérée suffisante pour induire la formation de tissu de novo 7. Le tissu stromal de la rate pourrait être transformé en une suspension unicellulaire, permettant l’utilisation de technologies de tri cellulaire pour manipuler la composition du greffon cellulaire. En éliminant sélectivement les types de cellules candidates, deux populations de cellules stromales CD45-TER-119– ont été identifiées qui étaient indispensables au développement du greffon : une population de cellules CD31+CD105+MAdCAM-1+ de type endothélial et une population de cellules mésenchymateuses PDGFRβ+ plus largementdéfinie 8.
La construction des greffons à partir de cellules de rate varie en termes de matériaux de support et de processus de chargement cellulaire. Des rates issues de l’ingénierie tissulaire ont déjà été préparées en chargeant des unités spléniques sur un échafaudage polymère d’acide polyglycolique/polyacide lactiquepoly-L 5,9. Il est intéressant de noter que les cellules stromales de la rate absorbées dans une éponge de collagène n’ont pas réussi à se greffer, tandis que les cellules stromales agrégées et chargées sur une feuille de collagène ont facilité la régénération de la rate8. Il a également été démontré que la remise en suspension des cellules stromales de la rate à l’intérieur d’une matrice Matrigel induit l’agrégation cellulaire dans des conditions de culture tridimensionnelles10. Cependant, cette méthode n’a pas été testée pour une utilisation dans des modèles de transplantation. L’objectif global du protocole actuel est d’agréger et d’encapsuler de force les cellules stromales de la rate directement dans la matrice de la membrane basale, qui peuvent ensuite être transférées dans un système de culture tissulaire in vitro tridimensionnel ou utilisées comme véhicule pour des transplantations de modèles animaux (Figure supplémentaire 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
L’agrégation de cellules de rate néonatale à l’intérieur d’un milieu semi-solide représente une méthode viable pour générer des constructions de rate. Des protocoles similaires basés sur la matrice de la membrane basale ont été utilisés pour initier des cultures tridimensionnelles de rate10. Ici, nous démontrons que les constructions de rate se prêtent aussi bien aux systèmes de culture d’organoïdes in vitro qu’aux modèles de transplantation in vivo . I…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été soutenue par le Conseil national de la santé et de la recherche médicale d’Australie (#GNT1078247).
Materials
| 96 Well Polypropylene 1.2 mL Cluster Tubes | Corning | CLS4401 | For placing inside a 14 ml conical tube |
| B-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Stock 55 mM, use at 50 uM |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | From Clostridium histolyticum |
| Deoxyribonuclease I (DNase I) | Sigma-Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I from bovine pancreas,Type II-S, lyophilized powder, Protein ≥80 %, ≥2,000 units/mg protein |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | 4500 mg/L Glucose, L-Glutamine, and Sodium Bicarbonate, without Sodium Pyruvate, Liquid. Sterile Filtered. |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium chloride and magnesium chloride, sterile-filtered |
| Eclipse 200 μl Pipette Tips | Labcon | 1030-260-000 | Bevel Point |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | Lot# 1382243 |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | Stock 100X, use at 1X |
| Matrigel | Corning | 354263 | Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186 |
| MEM Non-essential Amino Acids | Gibco | 11140076 | Stock 100X, use at 1X |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | Stock 10,000 units/ml Penicillin, 10,000 ug/ml Streptomycin |
| Reversible Cell Strainer | STEMCELL Technologies | 27216 | 70 μm |
| Ring Tweezers | NAPOX | A-26 | Ring size: 3 mm |
| Rock Inhibitor (Y-27632) | MedChemExpres | HY-10071 | |
| Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge | Thermofisher | Acceleration and deceleration speeds were set to 8 | |
| Ultra Fine Tweezers | EMS | 78340-51S | Style 51S. Antimagnetic/anti-acid SA low carbon austenitic steel tweezers are corrosion resistant. Anti-glare satin finish. |
| Vicryl 5/0 Suture Ligapak Reel | Ethicon | J283G | |
| Wiretrol II Long Wire Plunger | Drummond | 5-000-2002-L | Stainless Steel Plunger, 25 & 50 μL/WRTL II, Long |
| Wound Clip Applier | MikRon | 427630 | |
| Wound Clips | MikRon | 427631 | 9 mm |
References
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