쥐 비장 조직 형성을 조사하기 위한 Basement Membrane Matrix Encapsulated Cell Aggregation
Summary
이 기사에서는 반고체 기저막 매트릭스 내에서 비장 세포를 응집하고 캡슐화하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 기저막 매트릭스 구축물은 오가노이드 발달 연구 또는 생체 내 이식 및 조직 재생 연구를 위한 3차원 배양에 사용할 수 있습니다.
Abstract
비장은 혈액 매개 면역 반응에 중요한 역할을 하는 면역 기관입니다. 이 조직의 해부학적 또는 기능적 손실은 심각한 혈액 감염 및 패혈증에 대한 감수성을 증가시킵니다. 비장 절편의 자가 이식은 손실된 조직을 대체하고 면역 기능을 회복하기 위해 임상적으로 사용되었습니다. 그러나 견고하고 면역학적으로 기능하는 비장 조직 재생을 유도하는 메커니즘은 완전히 설명되지 않았습니다. 여기에서 우리는 비장 조직 형성을 위한 세포 요구 사항을 조사하기 위해 반고체 매트릭스 내에서 비장 세포를 응집하고 캡슐화하는 방법을 개발하는 것을 목표로 합니다. 기저막 매트릭스 캡슐화된 세포 구조는 3차원 오가노이드의 체외 조직 배양과 생체 내 조직 형성을 직접 평가하기 위한 신장 캡슐 아래 이식 모두에 적용할 수 있습니다. 응집 및 캡슐화를 위해 입력 세포를 조작함으로써 동물 이식 모델에서 비장 조직 재생에 이식편 유래 PDGFRβ+MAdCAM-1– 신생아 기질 세포가 필요하다는 것을 입증합니다.
Introduction
비장의 외상성 파열과 신체에 다발성 비장 결절의 출현은 비장 조직이 재생 능력을 가지고 있다는 첫 번째 징후중 하나였습니다 1,2. 이후 응급 비장 절제술이 필요한 환자의 비장 조직을 보존하기 위해 비장 자가이식술이 임상에 도입되었다3. 그러나 수십 년 동안 임상 진료의 일부였음에도 불구하고 비장이 어떻게 재생되는지에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 동물 이식 모델은 비장 재생 및 면역 기능의 여러 매개변수에 대한 통찰력을 제공했습니다 4,5. 특히, 이식편 전처리 방법에 대한 실험적 변형을 통해 조직 재생을 세포 및 분자 수준에서 더 자세히 연구할 수 있게 되었습니다.
전체 비장 절편을 포함하는 이식은 새로운 비장 구조가 재건되기 전에 대량 괴사 단계를 거친다6. 이식편 괴사의 초기 단계는 이식된 조직의 대부분이 적혈구와 백혈구로 구성되어 있으며 비장 재생에 필요하지 않다는 것을 시사합니다. 이것은 쥐 신장 캡슐 아래에 이식하기 전에 비장 이식편에서 조혈 세포를 배제하여 실험적으로 조사되었습니다. 여기서, 기질 및 내피 세포를 포함하는 비장의 비-백혈구/비-적혈구 분획은 새로운 조직 형성을 유도하기에 충분한 것으로 나타났다7. 비장 기질 조직은 단일 세포 현탁액으로 추가 처리될 수 있어 세포 분류 기술을 사용하여 세포 이식편 조성을 조작할 수 있습니다. 후보 세포 유형을 선택적으로 제거함으로써 이식편 발달에 필수적인 두 개의 CD45-TER-119– 기질 세포 집단, 즉 내피 유사 CD31+CD105+MAdCAM-1+ 세포 집단과 보다 광범위하게 정의된 PDGFRβ+ 중간엽 세포 집단8을 식별했습니다.
비장 세포에서 이식편을 만드는 것은 지지 재료와 세포 로딩 과정 측면에서 다양합니다. 조직 공학적 비장은 이전에 비장 단위를 폴리글리콜산/폴리-L 젖산 중합체 스캐폴드 5,9에 로딩하여 제조되었습니다. 흥미롭게도, 콜라겐 스펀지에 흡수된 비장 기질 세포는 생착에 실패한 반면, 콜라겐 시트 위에 응집되어 로드된 기질 세포는 비장 재생을 촉진했다8. Matrigel 매트릭스 내부의 비장 기질 세포의 재부유는 또한 3차원 배양 조건 하에서 세포 응집을 유도하는 것으로 입증되었다10. 그러나 이 방법은 이식 모델에 사용하기 위해 테스트되지 않았습니다. 현재 프로토콜의 전반적인 목표는 기저막 매트릭스 내에서 직접 비장 기질 세포를 강제로 응집하고 캡슐화하는 것이며, 이후 3차원 체외 조직 배양 시스템으로 옮기거나 동물 모델 이식을 위한 수단으로 사용할 수 있습니다(보충 그림 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
반고체 배지 내부의 신생아 비장 세포의 응집은 비장 구조를 생성하기 위한 실행 가능한 방법을 나타냅니다. 유사한 기저막 매트릭스 기반 프로토콜이 3차원 비장 배양을 시작하기 위해 사용되어왔다 10. 여기에서 우리는 비장 구조가 in vitro 오가노이드 배양 시스템뿐만 아니라 in vivo 이식 모델에도 동일하게 적용된다는 것을 보여줍니다. 참고로, 체외 배양 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 호주 국립 보건 및 의료 연구 위원회(National Health and Medical Research Council of Australia, #GNT1078247)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 96 Well Polypropylene 1.2 mL Cluster Tubes | Corning | CLS4401 | For placing inside a 14 ml conical tube |
| B-mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Stock 55 mM, use at 50 uM |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | From Clostridium histolyticum |
| Deoxyribonuclease I (DNase I) | Sigma-Aldrich | D4513 | Deoxyribonuclease I from bovine pancreas,Type II-S, lyophilized powder, Protein ≥80 %, ≥2,000 units/mg protein |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | 4500 mg/L Glucose, L-Glutamine, and Sodium Bicarbonate, without Sodium Pyruvate, Liquid. Sterile Filtered. |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | Without calcium chloride and magnesium chloride, sterile-filtered |
| Eclipse 200 μl Pipette Tips | Labcon | 1030-260-000 | Bevel Point |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | Lot# 1382243 |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | Stock 100X, use at 1X |
| Matrigel | Corning | 354263 | Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186 |
| MEM Non-essential Amino Acids | Gibco | 11140076 | Stock 100X, use at 1X |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | Stock 10,000 units/ml Penicillin, 10,000 ug/ml Streptomycin |
| Reversible Cell Strainer | STEMCELL Technologies | 27216 | 70 μm |
| Ring Tweezers | NAPOX | A-26 | Ring size: 3 mm |
| Rock Inhibitor (Y-27632) | MedChemExpres | HY-10071 | |
| Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge | Thermofisher | Acceleration and deceleration speeds were set to 8 | |
| Ultra Fine Tweezers | EMS | 78340-51S | Style 51S. Antimagnetic/anti-acid SA low carbon austenitic steel tweezers are corrosion resistant. Anti-glare satin finish. |
| Vicryl 5/0 Suture Ligapak Reel | Ethicon | J283G | |
| Wiretrol II Long Wire Plunger | Drummond | 5-000-2002-L | Stainless Steel Plunger, 25 & 50 μL/WRTL II, Long |
| Wound Clip Applier | MikRon | 427630 | |
| Wound Clips | MikRon | 427631 | 9 mm |
References
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