Basalmembranmatrix Verkapselte Zellaggregation zur Untersuchung der Milzgewebebildung von Mäusen

Summary

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Aggregation und Verkapselung von Milzzellen in einer halbfesten Basalmembranmatrix. Basalmembranmatrix-Konstrukte können in dreidimensionalen Kulturen zur Untersuchung der Organoidentwicklung oder für In-vivo-Transplantations – und Geweberegenerationsstudien verwendet werden.

Abstract

Die Milz ist ein Immunorgan, das eine Schlüsselrolle bei der durch Blut übertragenen Immunantwort spielt. Der anatomische oder funktionelle Verlust dieses Gewebes erhöht die Anfälligkeit für schwere Blutinfektionen und Sepsis. Die Autotransplantation von Milzschnitten wurde klinisch eingesetzt, um verlorenes Gewebe zu ersetzen und die Immunfunktion wiederherzustellen. Der Mechanismus, der eine robuste und immunologisch funktionelle Milzgeweberegeneration antreibt, ist jedoch noch nicht vollständig geklärt. Hier wollen wir eine Methode zur Aggregation und Verkapselung von Milzzellen innerhalb einer halbfesten Matrix entwickeln, um die zellulären Anforderungen für die Bildung von Milzgewebe zu untersuchen. Verkapselte Zellkonstrukte mit Basalmembranmatrix sind sowohl für die In-vitro-Gewebekultur von dreidimensionalen Organoiden als auch für die Transplantation unter der Nierenkapsel geeignet, um die in vivo-Gewebebildung direkt zu beurteilen. Durch die Manipulation der Eingangszellen für die Aggregation und Verkapselung zeigen wir, dass aus Transplantaten gewonnene PDGFRβ⁺MAdCAM-1-neonatale Stromazellen für die Regeneration von Milzgewebe unter Tiertransplantationsmodellen benötigt werden.

Introduction

Ein traumatischer Milzriss und das Auftreten mehrerer Milzknötchen im Körper war einer der ersten Hinweise darauf, dass Milzgewebe eine Regenerationsfähigkeit besitzt ^1,2. Später wurden Milz-Autotransplantationen in die Klinik eingeführt, um Milzgewebe bei Patienten zu erhalten, die eine Notfall-Splenektomie^{benötigten 3}. Doch obwohl sie seit Jahrzehnten Teil der klinischen Praxis ist, ist nur sehr wenig darüber bekannt, wie sich die Milz regeneriert. Tiertransplantationsmodelle haben Einblicke in mehrere Parameter der Milzregeneration und der Immunfunktion gegeben ^4,5. Insbesondere experimentelle Modifikationen der Transplantatpräparationsmethode haben es ermöglicht, die Geweberegeneration auf zellulärer und molekularer Ebene genauer zu untersuchen.

Transplantationen mit ganzen Milzschnitten durchlaufen eine Phase der Massennekrose, bevor eine neue Milzstruktur wieder aufgebaut wird⁶. Die Anfangsphase der Transplantatnekrose deutet darauf hin, dass der Großteil des transplantierten Gewebes größtenteils aus roten und weißen Blutkörperchen besteht und für die Milzregeneration unnötig ist. Dies wurde experimentell untersucht, indem hämatopoetische Zellen aus Milztransplantaten vor der Transplantation unter die Nierenkapsel der Maus ausgeschlossen wurden. Hier wurde gezeigt, dass die Nicht-Leukozyten/Nicht-Erythrozyten-Fraktion der Milz, die Stroma- und Endothelzellen umfasst, ausreicht, um die De-novo-Gewebebildung zu induzieren⁷. Milzstromagewebe könnte zu einer Einzelzellsuspension weiterverarbeitet werden, was den Einsatz von Zellsortiertechnologien zur Manipulation der zellulären Transplantatzusammensetzung ermöglicht. Durch selektive Entfernung von Kandidatenzelltypen wurden zwei CD45-TER-119-Stromazellpopulationen identifiziert, die für die Transplantatentwicklung unerlässlich waren: eine endothelähnliche CD31⁺CD105⁺MAdCAM-1⁺-Zellpopulation und eine weiter gefasste PDGFRβ⁺-mesenchymale Zellpopulation⁸.

Der Aufbau von Transplantaten aus Milzzellen variiert in Bezug auf Stützmaterialien und Zellbeladungsprozesse. Tissue-Züchtungsmilz wurde zuvor durch Laden von Milzeinheiten auf ein Polyglykolsäure/Poly-L-Milchsäure-Polymergerüst ^5,9 hergestellt. Interessanterweise konnten sich Milzstromazellen, die in einen Kollagenschwamm absorbiert wurden, nicht transplantieren, während Stromazellen, die aggregiert und über eine Kollagenschicht geladen wurden, die Milzregeneration erleichterten⁸. Es wurde auch gezeigt, dass die Resuspension von Milzstromazellen innerhalb einer Matrigel-Matrix die Zellaggregation unter dreidimensionalen Kulturbedingungen induziert¹⁰. Diese Methode wurde jedoch nicht für den Einsatz in Transplantationsmodellen getestet. Das übergeordnete Ziel des aktuellen Protokolls besteht darin, Milzstromazellen direkt in der Basalmembranmatrix zwangsweise zu aggregieren und einzukapseln, die anschließend in ein dreidimensionales In-vitro-Gewebekultursystem überführt oder als Vehikel für Tiermodelltransplantationen verwendet werden können (Ergänzende Abbildung 1).

Protocol

Alle Tierversuche wurden nach Versuchsprotokollen durchgeführt, die von der Tierethikkommission der University of Queensland (UQBR/079/19) genehmigt wurden. 1. Gewebeentnahme und Stromazellvorbereitung Einschläferung von 0,5-1,5 Tage alten männlichen und/oder weiblichen neugeborenen BALB/c-Spendermäusen durch Induktion von Unterkühlung, indem die Tiere in das Seidenpapier eingewickelt und für >10 Minuten unter zerstoßenes Eis gelegt werden.HINWEIS: Dieses …

Representative Results

Die Zellaggregation ist wichtig, um den Kontakt und die Signalübertragung von Zelle zu Zelle zu fördern. Die Umhüllung von Zellaggregaten in der Basalmembranmatrix unterstützte sowohl 3-dimensionale Kulturen für die Bildung von In-vitro-Gewebeorganoiden als auch die mechanische Abgabe von Zellen in die Nierenkapsel für die Transplantattransplantation. Um diese Konstrukte zu etablieren, wurde die Basalmembranmatrix zunächst unter eiskalten Bedingungen in einem fluidischen Zustand gehalten. Die Zellaggregat…

Discussion

Die Aggregation von neonatalen Milzzellen in einem halbfesten Medium stellt eine praktikable Methode zur Erzeugung von Milzkonstrukten dar. Ähnliche Protokolle auf Basis der Basalmembranmatrix wurden verwendet, um dreidimensionale Milzkulturen zu initiieren¹⁰. Hier zeigen wir, dass Milzkonstrukte sowohl für in vitro Organoid-Kultursysteme als auch für in vivo Transplantationsmodelle geeignet sind. Bemerkenswert ist, dass die Transplantation von in vitro kultivierten M…

Materials

96 Well Polypropylene 1.2 mL Cluster Tubes	Corning	CLS4401	For placing inside a 14 ml conical tube
B-mercaptoethanol	Gibco	21985023	Stock 55 mM, use at 50 uM
Collagenase D	Roche	11088858001
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138	From Clostridium histolyticum
Deoxyribonuclease I (DNase I)	Sigma-Aldrich	D4513	Deoxyribonuclease I from bovine pancreas,Type II-S, lyophilized powder, Protein ≥80 %, ≥2,000 units/mg protein
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	4500 mg/L Glucose, L-Glutamine, and Sodium Bicarbonate, without Sodium Pyruvate, Liquid. Sterile Filtered.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Without calcium chloride and magnesium chloride, sterile-filtered
Eclipse 200 μl Pipette Tips	Labcon	1030-260-000	Bevel Point
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	26140-079	Lot# 1382243
GlutaMAX	Gibco	35050061	Stock 100X, use at 1X
Matrigel	Corning	354263	Matrigel matrix basement membrane High Concentration, Lot# 7330186
MEM Non-essential Amino Acids	Gibco	11140076	Stock 100X, use at 1X
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122	Stock 10,000 units/ml Penicillin, 10,000 ug/ml Streptomycin
Reversible Cell Strainer	STEMCELL Technologies	27216	70 μm
Ring Tweezers	NAPOX	A-26	Ring size: 3 mm
Rock Inhibitor (Y-27632)	MedChemExpres	HY-10071
Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Centrifuge	Thermofisher		Acceleration and deceleration speeds were set to 8
Ultra Fine Tweezers	EMS	78340-51S	Style 51S. Antimagnetic/anti-acid SA low carbon austenitic steel tweezers are corrosion resistant. Anti-glare satin finish.
Vicryl 5/0 Suture Ligapak Reel	Ethicon	J283G
Wiretrol II Long Wire Plunger	Drummond	5-000-2002-L	Stainless Steel Plunger, 25 & 50 μL/WRTL II, Long
Wound Clip Applier	MikRon	427630
Wound Clips	MikRon	427631	9 mm