Desarrollo de la imagen y el análisis automatizado de pantallas de química de pez cebra.

Summary

Se presenta el desarrollo de un sistema automatizado de imágenes y análisis de pez cebra embriones transgénicos en placas de pocillos múltiples. Esto demuestra la capacidad de medir los efectos dependientes de la dosis de una molécula pequeña, BCI, el crecimiento de fibroblastos la expresión del gen del factor periodista y suministrar tecnología para el establecimiento de alto rendimiento de las pantallas de química de pez cebra.

Abstract

Se demuestra la aplicación de la imagen basada en el contenido de alta selección (HCS) metodología para identificar pequeñas moléculas que pueden modular la vía FGF / RAS / MAPK en embriones de pez cebra. El embrión de pez cebra es un sistema ideal para las pantallas en vivo químicos de alto contenido. El embrión de 1 día es de aproximadamente 1 mm de diámetro y puede ser fácilmente dispuestos en placas de 96 pozos, un formato estándar para la detección de alto rendimiento. Durante el primer día de desarrollo, los embriones son transparentes, con la mayor parte de los órganos actuales más importantes, lo que permite la visualización de la formación de tejidos durante la embriogénesis. La automatización completa de las pantallas de química pez cebra sigue siendo un reto, sin embargo, particularmente en el desarrollo de la adquisición automática de imágenes y análisis. Anteriormente hemos generado una línea reportero transgénico que expresa la proteína verde fluorescente (GFP) bajo el control de la actividad de FGF y ha demostrado su utilidad en las pantallas de productos químicos

Protocol

1) Establecer los apareamientos pez cebra y el tratamiento de la ICC.

1. Dos días antes del tratamiento, identificar los homocigotos masculinos Tg (dusp6: d2eGFP) ^pt6 pez cebra y el lugar de forma individual en ^un tanques de apareamiento. Añadir separador y un tipo de peces silvestres AB * mujer y dejar en las jaulas de apareamiento durante la noche.
2. A la mañana siguiente quitar el separador, y recoger los embriones después de 1 hora. La transferencia de embriones a los platos de 100 mm con E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4), la solución y se incuba a 28 ° C durante 6 horas. Eliminar embriones muertos y sin fertilizar, agregue la solución E3 fresca, y se incuba durante la noche.
3. Ordenar embriones transgénicos para la etapa similar (24hpf) y la expresión de GFP uniforme. Embriones matriz de forma individual en cada pocillo de una placa de 96 pocillos.
4. Retire el exceso de solución E3 con una micropipeta. Agregar 200μl de la solución de E3 con una pipeta de canales múltiples en cada pozo.
5. Añadir los siguientes compuestos como se indica:
   
   

   1

   2

   3

   4

   5

   6

   7

   8

   9

   10

   11

   12

   A

   2μl DMSO

   2μl BCl (0,1 mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1 mM)

   2μl BCl (2 mM)

   2μl BCl (2.5mm)

   2μl BCl (0,1 mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1 mM)

   2μl BCl (2 mM)

   2μl BCl (2.5mm)

   2μl DMSO

   B

   2μl DMSO

   2μl BCl (0,1 mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1 mM)

   2μl BCl (2 mM)

   2μl BCl (2.5mm)

   2μl BCl (0,1 mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1 mM)

   2μl BCl (2 mM)

   2μl BCl (2.5mm)

   2μl DMSO

   C

   2μl DMSO

   2μl BCl (0,1 mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1 mM)

   2μl BCl (2 mM)

   2μl BCl (2.5mm)

   2μl BCl (0,1 mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1 mM)

   2μl BCl (2 mM)

   2μl BCl (2.5mm)

   2μl DMSO

   D

   2μl DMSO

   2μl BCl (0,1 mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1 mM)

   2μl BCl (2 mM)

   2μl BCl (2.5mm)

   2μl BCl (0,1 mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1 mM)

   2μl BCl (2 mM)

   2μl BCl (2.5mm)

   2μl DMSO

   E

   2μl DMSO

   2μl BCl (0,1 mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1 mM)

   2μl BCl (2 mM)

   2μl BCl (2.5mm)

   2μl BCl (0,1 mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1 mM)

   2μl BCl (2 mM)

   2μl BCl (2.5mm)

   2μl DMSO

   F

   2μl DMSO

   2μl BCl (0,1 mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1 mM)

   2μl BCl (2 mM)

   2μl BCl (2.5mm)

   2μl BCl (0,1 mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1 mM)

   2μl BCl (2 mM)

   2μl BCl (2.5mm)

   2μl DMSO

   G

   2μl DMSO

   2μl BCl (0,1 mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1 mM)

   2μl BCl (2 mM)

   2μl BCl (2.5mm)

   2μl BCl (0,1 mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1 mM)

   2μl BCl (2 mM)

   2μl BCl (2,5 millones deM)

   2μl DMSO

   H

   2μl DMSO

   2μl BCl (0,1 mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1 mM)

   2μl BCl (2 mM)

   2μl BCl (2.5mm)

   2μl BCl (0,1 mm)

   2μl BCl (0,5 mm)

   2μl BCl (1 mM)

   2μl BCl (2 mM)

   2μl BCl (2.5mm)

   2μl DMSO

   Las concentraciones finales son 1μM, 5μM, 10μM, 20μM, 25μM BCI en DMSO al 1%. Cubrir la placa con papel de aluminio e incubar durante 6 horas a 28 ° C.

2) automática de imágenes de placas de 96 pozos y el análisis.

1. Añadir 10μl de tricaína (0.61mM) a cada pocillo para anestesiar a los embriones 30hpf.
2. Plato de carga en dispositivos ultra Imagexpress molecular.
3. Abra el software Metaxpress. Elija una configuración con un objetivo de 4x y el diámetro del agujero de alfiler máximo, configurar láser de enfoque automático para detectar la placa inferior, y determinar óptimo plano Z para detectar regiones de interés. Adquirir imágenes en longitudes de onda de excitación / emisión de 488/525 nm (GFP). Establecer como zona de exploración de un sitio único de 2000x2000 pixeles (4 x 4 mm), sin hurgar en la basura. Configure la potencia del láser y la ganancia de tal manera que las regiones brillantes en las imágenes de control positivo no sature. Confirmar la adquisición de una imagen adecuada en varios pocillos de control positivo y negativo.
4. Iniciar la exploración de la placa. El instrumento automáticamente obtener imágenes de todos los pozos y los archivan en una base de datos del servidor SQL.
5. Cargar las imágenes en Definiens desarrollador utilizando el módulo de la aplicación Cellenger y un filtro de importación, que reconoce el formato de imagen y estructura de los archivos generados por la plataforma de dispositivos moleculares Imagexpress Ultra.
6. Procesar imágenes con un algoritmo diseñado a medida Cognition Network Technology (también conocida como un conjunto de reglas). El algoritmo, que a medida desarrollado en base a un conjunto de reglas ha publicado recientemente ^dos, está diseñado para identificar de forma automática embrión, la yema, y la cabeza, y para cuantificar el brillo y el área de las buenas prácticas agrarias que expresan las estructuras de la cabeza. Pozos en los que se detecta ningún embrión o cuando la cabeza no puede ser claramente asignado (por ejemplo, con la toxicidad de los compuestos de alta o fuera de foco imágenes) se excluyeron del análisis. Configure el algoritmo utilizando varias imágenes de control negativo (tratado con vehículo) y una imagen positiva de control (BCI tratados) de tal manera que la cabeza y la yema estén correctamente identificados en ambos. Establecer una "cabeza de las estructuras" umbral de detección como múltiplos de la intensidad media de la yema hasta la detección de las estructuras de la cabeza brillante coincide con la observación visual. Definir los parámetros para la exportación. En este ejemplo, el parámetro más informativo fue el brillo total integrado de GFP-positivas regiones dentro de la cabeza, en adelante denominado "el brillo total de la cabeza las estructuras" (Figura 1).
   
   
   Figura 1
   Gráfico depicitng los efectos dependientes de la dosis de BCI en la expresión de GFP en embriones transgénicos.
7. Ejecutar el algoritmo en todas las imágenes de placas utilizando el planificador de tareas integrado. El software utiliza Definiens computación distribuida en varios procesadores ("motores"), lo que permite el análisis simultáneo de múltiples imágenes. El algoritmo calcula las medidas numéricas sobre la base de los resultados de los análisis de imágenes, que se guardan en la base de datos junto con una copia de la imagen procesada, con el análisis aplicado.

Los resultados representativos:

Después de todas las imágenes son analizadas, los datos pueden ser visualizados en Cellenger o exportarse a software de terceros (Excel, GraphPad Prism) para su posterior análisis y representación gráfica. La figura 2 muestra archivar imágenes escaneadas de un tratado con el vehículo y BCI-tratado bien, con y sin el análisis aplicado de la CNT. Figura 1 Los documentos de un efecto dosis-dependiente de BCI en la expresión del gen GFP reportero en Tg (dusp6: d2EGFP) ^pt6 embriones. La concentración requerida para obtener una respuesta media máxima (EC50) fue de aproximadamente 12 micras.


Figura 2
Captura automática de imágenes y análisis de los embriones de pez cebra transgénica. (A) del vehículo DMSO tratados Tg (dusp6: d2eGFP) ^pt6 embrión en 30hpf. (B) los embriones transgénicos tratados con 20μM BCI mostrar aumentos en la expresión de GFP. (C) Imagen de un embrión a partir de (A) después de ejecutar Definiens conjunto de reglas para encontrar la expresión de GFP en la cabeza. Manchas de color naranja denotan que el software mide la intensidad de las buenas prácticas agrarias. (D) Imagen de un embrión a partir de (B) después de ejecutar Definiens conjunto de reglas para encontrar la expresión de GFP en la cabeza. Manchas de color naranja denotan que el software mide la intensidad de las buenas prácticas agrarias. Tenga en cuenta que el conjunto de reglas fue capaz de encontrar un área más amplia de la expresión de GFP en el embrión tratado.

Discussion

Un factor importante que limita el rendimiento de las pantallas de química pez cebra es la falta de una metodología sistemática para procesar placas de 96 pozos de imágenes y análisis. Como las imágenes de los organismos multicelulares complejos están contraste, baja, y de naturaleza heterogénea, los algoritmos de análisis de imagen no detectar y cuantificar estructuras específicas dentro del organismo. La mayoría de las pantallas de química publicado pez cebra por lo tanto, conlleve el examen visual de los pozos individuales por parte del personal dedicado durante todo el procedimiento. Esto por lo general evita la generación de lecturas numéricas y un completo archivo de imágenes de la pantalla y los datos. Por otra parte, la evaluación manual elimina varias ventajas claves de la imagen basada en detección, es decir, la capacidad de realizar análisis retrospectivos de rendimiento de la pantalla, para examinar los cambios fenotípicos que no eran el foco principal de la campaña de detección (por ejemplo, toxicidad o defectos en el desarrollo) y la cruz de referencia los datos del cribado con pantallas pasado o el futuro uso de la biblioteca de un mismo compuesto.

En este informe se destaca la metodología para la imagen automatizada y el análisis de embriones de pez cebra en placas de pocillos múltiples, sin intervención del usuario. Hemos automatizado de captura de imágenes en un láser confocal de barrido ultra ImageXpress lector (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) a la imagen de Tg (dusp6: d2EGFP) ^pt6 embriones en 96 placas y desarrollado un algoritmo de análisis de imagen basado en la tecnología Definiens 'Cognición de red que las buenas prácticas agrarias cuantificados expresión en las cabezas de los embriones transgénicos. El método de entrega respuestas graduadas y cuantificar la actividad in vivo de una pequeña molécula activadora de la señalización de FGF. Se obtuvieron resultados similares con la II epifluorescencia basado ArrayScan (Cellomics Inc., Pittsburgh PA) la documentación que es posible llevar a cabo la captura automática de imágenes de embriones de pez cebra en una variedad de lectores de placas disponibles en el mercado ^2. El desarrollo de la metodología para analizar automáticamente las imágenes multicelulares organismo elimina la necesidad de puntuación visual por un observador humano y ha permitido la generación y archivo de los datos numéricos e imágenes para el análisis retrospectivo y comparaciones con las pantallas en el futuro.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tricaine (MS222)	Sigma-Aldrich	Cat.# A-5040