Summary
Burada sunulan deneysel tasarım, lenf nodu (LN) metastazı sırasında antijene özgü CD8+ T hücrelerinin çalışmaları için yararlı bir üreme modeli sağlar, bu da seyirci CD8+ T hücrelerinin bozulmasını dışlar.
Abstract
Drenaj lenf nodlarından tümör antijenine özgü CD8+ T hücreleri, tümör oluşumu sırasında anti-tümör immün yanıtının oluşturulmasında biriken bir önem kazanır. Bununla birlikte, çoğu durumda, kanser hücreleri, uzak organlara daha fazla metastaz yapmadan önce lenf düğümlerinde metastatik lokuslar oluşturur. Lokal ve sistematik CD8+ T hücresi yanıtlarının LN metastazından ne ölçüde etkilendiği belirsizliğini korumaktadır. Bu amaçla, lenfositik koriomenenjit virüsü (LCMV), glikoprotein (GP) ve sınıf I majör histouyumluluk kompleksi (MHC) molekülü H-2Db tarafından sunulan GP kaynaklı peptit GP33-41'e özgü T hücresi reseptörlerini (TCR'ler) barındıran T hücresi reseptörlerini (TCR'ler) barındıran vekil neoantijeni eksprese eden bir B16F10-GP melanom hücre hattı ile birleştirilmiş bir murin LN metastaz modeli oluşturduk. Bu protokol, LN metastazı sırasında antijene özgü CD8+ T hücresi yanıtlarının incelenmesini sağlar. Bu protokolde, C57BL / 6J fareleri deri altına B16F10-GP hücreleri ile implante edildi, ardından saf P14 hücreleri ile evlat edinme transferi yapıldı. Subkutan tümörün çapı yaklaşık 5 mm'ye ulaştığında, primer tümör eksize edildi ve B16F10-GP hücreleri doğrudan tümör drenaj lenf noduna (TdLN) enjekte edildi. Daha sonra, LN metastazı sürecinde CD8+ T hücrelerinin dinamikleri izlendi. Toplu olarak, bu model, LN metastazı sırasında antijene özgü CD8 + T hücresi immün yanıtlarını kesin olarak araştırmak için bir yaklaşım sağlamıştır.
Introduction
Kanser immünoterapisi, özellikle bağışıklık kontrol noktası blokajı (ICB), kanser tedavisinde devrim yarattı1. ICB, tümör mikroçevresindeki (TME) tükenmiş CD8 + T hücrelerinde yüksek oranda eksprese edilen koinhibitör immünoreseptörleri (PD-1, Tim-3, LAG-3 ve TIGIT gibi) bloke eder ve tükenmiş CD8 + T hücrelerinin yeniden canlanmasına yol açar2. Tükenmiş CD8 + T hücrelerinin heterojenliği göz önüne alındığında, biriken kanıtlar, drenaj lenf nodu (dLN) dahil olmak üzere periferden türetilen, ancak TME'de olmayan, tümöre özgü CD8 + T hücrelerinin ICB 3,4,5,6,7,8'in etkinliğine aracılık ettiğini ortaya koymuştur. Son zamanlarda, TdLN'den türetilen TCF-1+TOX- tümöre özgü bellek CD8+ T hücrelerinin (TdLN-TTSM), geleneksel bellek T hücrelerinin çeşitli fonksiyonel özelliklerini içeren ve ICB tedavisi üzerine döl tükenmiş hücrelere daha da genişleyebilen ve farklılaşabilen ICB'ye gerçek yanıt verenler olduğu doğrulandı9. Toplamda, bu bulgular anti-tümör bağışıklığının artmasında LN'nin önemini doğruladı.
Lenf nodu, biyolojik sinyallerin yanı sıra yapısal temel sağlayarak tümöre özgü CD8+ T hücrelerinin hazırlanmasını ve aktivasyonunu kolaylaştırmada kritik bir yer olarak işlev görür10. Çeşitli kanser hücreleri, sistematik yayılımdan önce sıklıkla sentinel lenf nodunu (SLN, primer tümörü boşaltan ilk LN) tohumlar11. SLN metastazının varlığı, insan kanserinde kötü sonuçla bağlantılıdır ve klinik öncesi modeller, TdLN'deki tümör hücrelerinin hem lenfatik damarlar hem dedüğüm 12,13,14,15'in kan damarları yoluyla uzak organlara yayılabileceğini göstermiştir. SLN biyopsisi, birçok solid tümör tipinde sonraki tedavi kararlarına rehberlik etmek için standart bir prosedürü temsil etmektedir ve bu da tutulmamış LN'nin gereksiz rezeksiyonunu önleyebilir16,17. İlgili LN'ye bile, cerrahi rezeksiyonun gerekli olup olmadığı ve ne zaman gerekli olduğu tartışmalıdır, çünkü birkaç çalışma, bölgesel LN'nin çıkarılmasının, bölgesel LN rezeksiyonu olmadan radyasyon veya sistemik tedavi alanlara kıyasla genel sağkalımda iyileşme göstermediğini göstermiştir18,19. Bir yorum, mikroskobik hastalığı olan metastatik LN'nin (mLN), bağışıklık hücrelerini eğitmek ve bazı terapötik faydalar sağlamak için bir miktar kapasiteyi koruyabileceğidir. Bu nedenle, LN metastazının anti-tümör immün yanıtını, özellikle TdLN-TTSM'nin özelliklerini ve fonksiyonlarını nasıl etkilediğini aydınlatmak kritik öneme sahiptir.
Şimdiye kadar, hem klinik öncesi hem de klinik veriler mLN20'de bazı yapısal ve hücresel değişiklikler ortaya koymuştur. Bununla birlikte, LN metastazı sırasında tümöre özgü CD8 + T hücrelerinin dinamik değişiklikleri tanımlanmamıştır. Bu nedenle, daha fazla araştırma için zorlayıcı bir LN metastazı modeli geliştirmeye ihtiyaç vardır. Gerçekten de, birkaç çalışma mLN fare modellerini farklı yollarla bildirmiştir 14,21,22. Örneğin, aksiller LN'lerde spontan metastaz, 4T1 meme kanseri hücrelerinin meme yağ yastığı22'ye implantasyonu yoluyla gerçekleştirildi. Başka bir çalışmada, Reticker-Flynn ve ark. ayrışmış mLN dokularından kültürlenen tümör hücrelerinin seri aşılanması yoluyla deri altı primer tümörden LN'lere yüksek yayılma insidansına sahip melanom hücre hatları üretti (dokuz tur)14. Yaygın olarak kullanılan bir diğer model, tümör hücrelerinin ayak tabanına enjeksiyonu ile hazırlandı ve metastatik lokuslar popliteal LN22'de oluşturulacaktı. Özellikle, müdahalenin kesin zaman noktalarını değerlendirmek zordur, çünkü bu modellerde LN metastazı her zaman sadık değildir.
Bu çalışmada, LCMV virüsü glikoprotein (GP) gen dizisinin B16F10 hücre hattı9'un genomuna CRISPR/Cas9 aracılı eklenmesiyle oluşturulan B16F10-GP hücrelerinin23,24 intranodal enjeksiyonu yoluyla bir murin LN metastatik modeli oluşturulmuştur. Daha sonra, bu fareler, transgenik T hücre reseptörlerini (TCR'ler) barındıran P14 hücreleri ile transfer edildi ve spesifik olarak H-2Db GP33-41 epitop25,26'yı tanıdı ve LN metastazı sırasında antijene özgü CD8+ T hücrelerinin sistemik ve lokal dinamikleri araştırılabildi. Deneysel tasarımımız, immün yanıtların, özellikle de LN metastazı sırasında antijene özgü CD8 + T hücrelerinin, seyirci CD8 + T hücrelerinin pertürbasyonunu dışlayan çalışması için yararlı bir model sunmaktadır. Bu sonuçlar, mLN'nin çıkarılması veya saklanması konusundaki klinik tedavi seçeneklerini etkileyecek ve maksimum terapötik fayda elde etmek için mLN'nin manipülasyonuna yeni bir ışık tutacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kullanılan C57BL/6J fareleri (B6 farelerine atıfta bulunulur) ve saf P14 transgenik fareler 9,27 6-10 haftalıkken 18-22 g ağırlığındaydı. Hem erkek hem de dişi, randomizasyon veya körleme olmadan dahil edildi. Tüm hayvan çalışmaları, Qingdao Ziraat Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin yönergelerine uygun olarak yürütülmüştür.
1. Ortam ve reaktiflerin hazırlanması
- DMEM,% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 1 penisilin / streptomisin,% 1 L-glutamin ve ilave 100 U / mL puromisin ekleyerek D10 (tam DMEM ortamı) olarak adlandırılan B16F10-GP melanom hücre kültürü ortamını hazırlayın. Steril bir D10 bulundurun ve 2-4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.
- % 2 FBS,% 1 penisilin / streptomisin ve% 1 L-glutamin ile RPMI-1640 ekleyerek R2 ortamını (kırmızı kan hücresi lizizinin sonlandırılması için) hazırlayın.
- % 2 FBS ve% 0.01 sodyum azid içeren 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyerek floresanla aktive edilen hücre ayırma (FACS) tamponunu hazırlayın. Sodyum azid ilavesi, 2-4 ° C'de aylarca saklanabilen FACS tamponunun saklama süresini uzatabilir.
- Çift damıtılmış suya 155 mMNH4Cl, 10 mMKHCO3 ve 0.1 mM etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) ekleyerek kırmızı kan hücresi lizis (RBL) tamponu hazırlayın ve pH'ını 7.3'e ayarlayın. RBL tamponunu oda sıcaklığında (RT) saklayın ve 3 aya kadar stabil kalır.
- Anestezik 2,2,2-tribromoetanolü aşağıda tarif edildiği gibi hazırlayın.
- Alüminyum folyo ile sarılmış 50 mL'lik steril konik bir tüpte uygun miktarda 2,2,2-tribromoetanol kristalini tartın. 500 mg / mL konsantrasyonda stok çözeltisini hazırlamak için kristale uygun miktarda 2-metil-2-bütanol ekleyin.
- Tüpü 37 °C'lik bir su banyosunda kristal çözülene kadar karıştırmak ve ısıtmak için döndürün. Tüm kristallerin çözüldüğünden emin olun.
- Çözeltiyi iyice karıştırın. Stok çözeltisini 0,22 μm'lik bir filtre ile steril bir kaba süzün. Stok çözeltisini dondurulmuş, ışıktan korunmuş olarak -20 °C'de saklayın veya PBS ile seyrelterek 12,5 mg/mL konsantrasyonda bir çalışma çözeltisine dönüştürün ve 4 °C'de saklayın.
NOT: Sıvının daha yüksek konsantrasyonları tahriş edici olduğundan, öngörülen konsantrasyonu kullanmak en iyisidir.
2. B16F10-GP hücre süspansiyonunun hazırlanması
- 37 ° C ve% 5 CO2'de bir hücre kültürü inkübatöründe 5 mL D10 içeren 1 x 106 B16F10-GP hücreli bir şişeyi çözün ve kültürleyin. Subkültür hücreleri, aşağıda açıklandığı gibi %80 ila %90 yoğunluğa ulaştıklarında.
- Orijinal kültür ortamını bir pipetleme tabancasıyla aspire ederek atın ve hücreleri PBS ile 2 kez yıkayın. Bir hücre kültürü kabında PBS ile yapışık hücreleri temizlerken, PBS'yi yan duvara taşıyın veya tabağa bırakın.
- PBS aspirasyonundan sonra, hücre kültürü kabına veya şişesine 0.5-1 mL% 0.25 tripsin EDTA çözeltisi ekleyin. Tüm hücre yüzeyini kaplamak için hafifçe sallayın. Hücre kültürü kabını veya şişesini 37 °C'de yaklaşık 1 dakika veya hücreler yuvarlanıp ayrılana kadar RT'de bir inkübatöre yerleştirin. Ters çevrilmiş bir mikroskop yardımıyla hücrelerin pul pul dökülmesini gözlemleyin.
- Tripsin sindirimini sonlandırmak için eşit hacimde taze formüle edilmiş D10 ekleyin. Tüm hücrelerin ayrıldığından emin olmak için hücre kültürü şişesinin alt yüzeyini bir pipetleme tabancasıyla temizleyin.
- B16F10-GP hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve RT'de 4 dakika boyunca 163 x g'de santrifüjleyin.
- Süpernatanı aspire edin ve atın. Çökeltme için hücreleri 1-2 mL D10'da yeniden süspanse edin. B16F10-GP hücre süspansiyonunu 8-10 mL D10 içeren yeni bir hücre kültürü kabına veya şişesine aktarın ve daha sonra 37 ° C'de% 5 CO2'de bir hücre inkübatöründe inkübe edin.
- Tümör implantasyonu gününde, 2.1.1 ila 2.1.4 adımlarında açıklandığı gibi yaklaşık% 90 yoğunluğa sahip B16F10-GP hücrelerini toplayın. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı aspire edin ve atın. Hücre çökeltisini 1 mL PBS'de yeniden süspanse edin.
- % 0.4 tripan mavisi hemositometre kullanarak canlı hücreleri sayın. Hücreyi 100 μL'de 5 x 105 hücreye seyreltmek için PBS ekleyin. Hücreleri kullanana kadar buzun üzerine yerleştirin.
3. Farelerin bilateral kasık bölgesinde B16F10-GP hücrelerinin ektopik inokülasyonu
- 1 mL'lik bir şırınga kullanarak 100 μL hazırlanmış B16F10-GP hücre süspansiyonunu aspire edin. Kabarcıkları yukarı doğru hareket ettirmek için tüp duvarına hafifçe vurun ve üst kabarcığı dışarı çıkarmak için pistonu itin.
- Fareyi sırtüstü pozisyonda tutun ve karnını açığa çıkarın. Farenin sağ arka uzuvuna sırtüstü pozisyonda parmağınızla bastırın, böylece sağ kasık bölgesindeki cilt tamamen açığa çıkar (Sol kasık bölgesi ile aynı).
- Tüy dökücü krem ile karındaki tüyleri çıkarın, ardından iki taraflı karın bölgesini %75 etanol içeren pamukla temizleyin.
- İğneyi batırmadan önce kasık bölgesindeki derinin sıkılaştığından emin olun. İğneyi üst uyluğun kasık bölgesinin deri altı boşluğuna 45°'lik bir açıyla sokun. İğnenin yukarı doğru eğimli olduğundan ve iğnenin derinliğinin 0,5-1 cm olduğundan emin olun.
- Enjeksiyondan önce hafifçe emme uygulayın, kan yoksa, deri altı dokuya yavaşça enjekte edilen hücreleri enjekte edin. Aynı zamanda, deri altı bölgede küçük bir bolus (sıvı cebi oluşumu) gözlemleyin.
- Enjeksiyondan sonra iğneyi çıkarın, keskin kutusuna koyun ve fareyi kafesine geri koyun.
4. P14 T hücrelerinin tümör taşıyan farelere evlat edinici transferi
- Tümör implantasyonundan 6-8 gün sonra, tümörler palpe edilebilir olduğunda (yaklaşık 3-5 mm çapında) tümör taşıyan farelerde evlat edinme transferi gerçekleştirin. Transferden bir gün önce intraperitoneal olarak 4 mg siklofosfamid enjekteedin 28,29,30.
NOT: CTX enjeksiyonunun amacı, çoğalan lenfositleri geçici olarak ortadan kaldırarak evlat edinilen T hücreleri için lenfatik bölmede yer yaratmaktır. - Saf P14 transgenik farelerin dalak ve LN'lerinden lenfositleri aşağıda tarif edildiği gibiizole edin 31,32 (6-10 haftalık, reddetme sorunlarını önlemek için tümör taşıyan farelerle aynı cinsiyet).
NOT: Kesinlikle steril koşulları sağlamak için bir biyogüvenlik kabininde aşağıdaki prosedürleri gerçekleştirin.- İki adet 6 cm'lik tabak hazırlayın ve tabaklardan birine 3 mL R2 ortamı ve diğer tabağa 3 mL RBL tamponu ekleyin. RBL tamponu içeren Petri kabına 70 μm'lik bir hücre filtresi yerleştirin.
- P14 farelerini izofluran içeren hava geçirmez kaplarda ötenazi yapın ve ardından servikal çıkık yapın. P14 farelerinin sayısını, alıcı farelerin sayısına göre ayarlayın.
- Ötenazi yapılan farelerden dalak, inguinal ve aksiller lenf düğümlerini toplayın ve bunları 4 mL R2 ortamı içeren 6 cm'lik kaplara aktarın ve buz üzerine yerleştirin.
- Dalağı 3 mL RBL tamponu ile ıslatılmış bir süzgecin içine yerleştirin, dalağı 1 mL şırınganın içindeki atıcı ile öğütün. Hücreleri RT'de 1-2 dakika inkübe edin, ardından reaksiyonu 3 mL soğuk R2 ortamı ile sonlandırın.
- LN'leri 1 mL'lik şırınganın içindeki atıcı ile 70 μm'lik bir hücre filtreli süzgeçte sadece bağ dokusu kalana kadar öğütün. Filtreyi soğuk R2 ortamıyla durulayın ve hücre süspansiyonunu yeni bir 15 mL santrifüj tüpüne aktarın. Numuneleri 500 x g'da 6 °C'de 4 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve hücreleri 3 mL PBS ile yeniden süspanse edin. Topaklaştırıcı malzemeyi hücre süspansiyonundan çıkarmak için 70 μm'lik bir hücre filtresi kullanın.
- Hücre süspansiyonunu 500 °C'de 6 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Hücreleri 3 mL PBS ile tekrar süspanse edin ve tüpü buzun üzerine yerleştirin. Küçük bir örnek alın, tripan mavisi ile karıştırın ve bir kan hücresi sayma plakası kullanarak hücreleri sayın.
- Akış sitometrisi ile P14 (canlı/ölü-CD45.1+CD8+Vα2+) hücre yüzdesini belirleyin. Transfer edilen donör hücrelerin alıcı farelerle farklı konjenik belirteç sergilediğinden emin olun (tümör taşıyan B6 fareleri CD45.2+'dır). Aktarılan hücrelerin doğru fenotipini doğrulamak için aktarımdan önce boyama yapın.
- 1 mL FACS tamponu içeren 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne 5 x 104- 1 x 105 hücre ekleyin. Hücre süspansiyonunu 500 x g'da 4 °C'de 3 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın, hücreleri dağıtmak için tüpün altını hafifçe vurun ve tüpü buzun üzerine yerleştirin.
- 100 μL FACS tamponu içinde seyreltilmiş aşağıdaki konjuge antikor karışımını 9,32 hazırlayın: anti-CD8, 1:200; anti-TCR Vα2, 1:100; anti-CD45.1, 1:200; Canlı/ölü leke, 1:400. (Malzeme Tablosu).
- Partikülleri toplamak için antikor karışımını 15.000 x g'da 3 dakika santrifüjleyin. Karışımı buzun üzerine yerleştirin ve folyoya sararak ışıktan koruyun. Parçacıkların aspirasyonunu önlemek için sadece süpernatanı alın.
- Hücreleri 100 μL antikor karışımında yeniden süspanse edin ve tüp duvarına hafifçe vurarak iyice karıştırın. Kalay folyoya sardıktan sonra, tüpü buz üzerinde 30 dakika inkübe edin.
- Hücreleri FACS tamponu ile 2 kez yıkayın. Tüpü 500 x g'da 4 °C'de 3 dakika santrifüjleyin. Hücreleri 200 μL FACS tamponu ile yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu bir akış tüpüne aktarın.
- Canlı / ölü CD45.1 + CD8 + Vα2 + hücrelerin yüzdesini belirlemek için bir akış sitometresinde lekeli hücrelerle akış tüpünü çalıştırın.
NOT: Genel olarak, P14 transgenik farelerden alınan CD8+ T hücrelerinin% 90'ından fazlası, LCMV'nin (lenfositik koryomenenjit virüsü) H-2Db GP33-41 epitopuna özgü Vα2 + TCR'leri barındırıyordu.
- Canlı/ölü-CD45.1+CD8+Vα2+ hücrelerin mutlak sayısını, yüzdesini ve 4.2 ve 4.3. adımlarda elde edilen canlı hücre sayısını çarparak hesaplayın.
- 200 μL P14 hücreli (5 x 105 hücreli ) süspansiyonu 100 U insülin şırıngası ile aspire edin ve kabarcıkları çıkarın. Aktarılan saf P14 hücrelerinin ilk sayısı (5 x 103 - 5 x 105), aktarılan hücrelerin fenotipinietkilemedi 9.
- Fareleri bir kafese yerleştirin ve kuyruk damarını genişletmek için kızılötesi lamba ile 5-10 dakika ısıtın. Uygun boyutta bir fare sabitleyici ile yerinde tutun, kuyruğu düzeltin ve damarları görünür hale getirmek için %75 etanol içeren bir pamuk topuyla silin.
- İğneyi kuyruk damarına paralel olarak yerleştirin ve pistonu yavaşça geri çekin. Şırıngaya kan akıyorsa, hücre süspansiyonunu yavaşça damara itin.
NOT: Enjeksiyon sırasında kuyrukta direnç veya şişlik varsa, enjeksiyon pozisyonunun ayarlanması gerekir. Enjeksiyon bölgesi distal uçta başlamalıdır. - Enjeksiyon tamamlandıktan sonra, iğneyi hızlı bir şekilde dışarı çekin ve enjeksiyon bölgesine bir pamuk top ile hafifçe bastırın. Fareyi yeni ve temiz bir kafese koyun ve herhangi bir olumsuz etki olup olmadığını birkaç dakika yakından gözlemleyin.
5. Primer tümörün rezeksiyonu
NOT: Kullanmadan önce tüm cerrahi aletlerin otoklavlandığından emin olun. Biyogüvenlik kabini içindeki çalışma alanını %75 etanol ile sterilize edin, ardından en az 30 dakika UV ışınlaması uygulayın. Ameliyat sırasında temiz önlükler, şapkalar, maskeler ve steril eldivenler giyin.
- Tümör palpe edilebilir olduğunda (yaklaşık 5 mm çapında), birincil tümörü rezeke edin.
- Fareleri intraperitoneal Ketamin enjeksiyonu (75 mg / kg) ile uyuşturun. Anestezi derecesini değerlendirmek için ayak pedini sıkıştırın, ağrı refleksi yoksa ameliyat için doğru zamanlamayı gösterir. Arka bacaklar geri çekildiyse, 10-30 μL'lik başka bir doz verin.
NOT: Alternatif olarak, intraperitoneal medetomidin (1 mg / kg vücut ağırlığı; Domitor) fareleri uyuşturmak için önerilir. - Kurutma önleyici merhemi fare gözlerine uygulayın. Cerrahi alanı tamamen ortaya çıkarmak için karındaki tüyleri tüy dökücü kremle çıkarın.
- Fareyi bir biyogüvenlik kabinine yerleştirin ve farenin uzunlamasına ekseni deneyciye paralel olacak şekilde sırtüstü pozisyonda temiz emici kağıtla kaplı anatomik bir tahtaya yerleştirin.
NOT: Sıkı steril bir ortam sağlamak için, bir biyogüvenlik kabininde aşağıdaki prosedürler gerçekleştirilmelidir. - Farelerin karnını povidon-iyot içine batırılmış bir pamuk top ile dezenfekte edin. Tümör taşıyan bölgenin yakınındaki cildi steril bir neşter veya oftalmik makasla kesin. Tümörü net bir şekilde ortaya çıkarmak için kapalı makas ucunu insizyona sokun. Cildi keserken kasık lenf bezlerine zarar vermemeye dikkat edin.
- Tümörün çıkarılması sırasında, kapsülü mümkün olduğunca sağlam tutun. Tümöre bitişik bağ dokusunu steril makasla dikkatlice ve nazikçe çıkarın. Tümörü yerinde tamamen çıkarın, aksi takdirde tekrarlayabilir.
6. Kasık lenf nodunda B16F10-GP hücrelerinin intranodal enjeksiyonu
NOT: Bilateral tümör temizlendikten sonra tek taraflı inguinal lenf noduna B16F10-GP hücreleri, diğer tarafa PBS enjekte edildi.
- 100 U insülin şırıngası ile 20 μL (5 x 104 hücre) B16F10-GP hücre süspansiyonunu aspire edin, kabarcıkları çıkarın ve ardından bir kasık lenf düğümüne enjekte edin. Diğer taraftaki kasık lenf noduna eşit miktarda PBS enjekte edin.
- Enjeksiyon sırasında, iğneyi lenf düğümünün distal ucundan sokun ve ardından iğneyi yavaşça lenf düğümünün ortasına yerleştirin. Bu sırada, sıvı lenf düğümüne doğru bir şekilde enjekte edilirse, lenf düğümünün önemli ölçüde şiştiği görülebilir.
NOT: İğne lenf nodunun distal ucundan sokulduğunda, nodu delmemeye dikkat edin.
- Enjeksiyon sırasında, iğneyi lenf düğümünün distal ucundan sokun ve ardından iğneyi yavaşça lenf düğümünün ortasına yerleştirin. Bu sırada, sıvı lenf düğümüne doğru bir şekilde enjekte edilirse, lenf düğümünün önemli ölçüde şiştiği görülebilir.
- 3-0 dikiş kullanarak kesiyi 2-3 dikişle dikin. Yarayı çevreleyen cildi povidon iyot emdirilmiş pamukla dezenfekte edin. Dikiş sırasında lenf düğümlerini atlamaya özen gösterin.
- Fareyi temiz bir kafese yerleştirin ve yanal dekübit konumunda kızılötesi ışık kullanarak sıcak tutun. Bilinç geri gelene kadar sürekli izleyin. Ameliyat geçiren farelerin tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirketine iade edilmediğinden emin olun.
- Postoperatif ağrıyı hafifletmek için ameliyattan sonraki 3 gün boyunca her 4-6 saatte bir buprenorfin verin (0.1-0.5 mg / kg, SQ veya IP dozunda). Farelerin beslenme, içme, hareket ve aktivite alanlarını izleyin. Tipik olarak, fareler cerrahi travmadan 3 gün içinde iyileşir.
NOT: Fareler normal beslenme ve aktivitelere devam edemiyorsa ve herhangi bir enfeksiyon belirtisi gösteriyorsa, müdahale için bir veterinere danışın veya ötenazi yapın. - Fareleri farklı zaman noktalarında kurban edin: tümör hücrelerinin intranodal enjeksiyonundan sonraki 8. gün ve 18. gün. Akış sitometrisi analizini kullanarak aktive edilmiş donör hücrelerini kurtarın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu deneysel tasarımın şematik diyagramı Şekil 1A'da gösterilmiştir. 100 μL PBS'de toplam 5 x 105 B16F10-GP hücresi, CD45.2 C57BL/6J farelerinin bilateral kasık bölgesine subkutan olarak (s.c.) implante edildi. 7 gün sonra, bu tümör taşıyan farelere intraperitoneal (i.p.) 4 mg CTX enjekte edildi, ardından kuyruk intravenöz (i.v.) enjeksiyon yoluyla 5 x 105 CD45.1 + P14 hücrelerinin evlat edinici transferi yapıldı. Tümörler yaklaşık 3-5 mm çapa ulaştığında (P14 hücre transferinden yaklaşık 7 gün sonra) primer tümörler rezeke edildi ve 20 μL PBS'de 5 x 104 B16F10-GP hücresi doğrudan tek taraflı inguinal lenf noduna enjekte edildi. Diğer taraftaki inguinal lenf noduna eşit miktarda PBS enjekte edildi. Belirtilen zaman noktalarında metastatik olmayan lenf nodu (nLN) ve metastatik lenf nodunun (mLN) temsili hematoksilen ve eozin (H&E, 100x) boyanması Şekil 1B'de gösterilmektedir. nLN'nin yapısı sağlamdı. LN metastazının erken evresinde (D8), mLN kısmen tümör hücreleri ile doluydu (siyah ok) ve hala tümör hücreleri tarafından istila edilmemiş lenfositlerin bulunduğu bir alan kaldı (kırmızı ok). LN metastazının geç evresinde (D18) iken mLN, tümör anjiogenezi ve küçük lenfositlerin eşlik ettiği tümör hücreleri ile doludur. TdLN'de geri kazanılan aktive edilmiş P14 hücreleri, GP33-41 peptit stimülasyonundansonra yüksek düzeyde IFN-γ üretti 9,31. Burada, aktive edilmiş P14 hücrelerinin yüzdeleri, farklı zaman noktalarında akış sitometrisi ile analiz edildi ve geçit stratejisi Şekil 2'de gösterilmiştir. Periferik kanda erken evrede (D8) ve geç evrede (D18) antijene özgü CD8+ T hücrelerinin sıklığı sırasıyla %2.81 ve %1.48'dir (Şekil 3A). Tümöre özgü CD8 + T hücrelerinin, tümör oluşumu sırasında kesinlikle dLN'de bulunduğu ve drenaj yapmayan LN'nin geri kazanılmış sınırlı donör hücrelerinde bulunduğu bildirilmiştir33. nLN'deki antijene özgü P14 hücrelerinin yüzdesi, LN metastazı sırasında stabildi. Şaşırtıcı bir şekilde, mLN'deki antijene özgü CD8 + T hücreleri, nLN'ye kıyasla P14 hücrelerinin daha yüksek frekansı ile kanıtlanırken, geç aşamada keskin bir şekilde azalırken, erken aşamada geçici olarak güçlendirildi (Şekil 3B).
Şekil 1: Deney tasarımının şematik diyagramı. (A) C57BL / 6J fareleri (CD45.2+) bilateral kasık bölgesine 5 x 105 B16F10-GP tümör hücresi implante edilir. 7 gün sonra, bu farelere intraperitoneal olarak 4 mg CTX enjekte edilir ve ardından ertesi gün farklı konjenik olarak işaretlenmiş (CD45.1+) P14 hücrelerinin evlat edinici transferi yapılır. Tümörler yaklaşık 3-5 mm çapa ulaştığında (P14 hücre transferinden yaklaşık 7 gün sonra), primer tümörler rezeke edilir, daha sonra 20 μL PBS'deki 5 x 104 B16F10-GP hücreleri doğrudan tek taraflı kasık lenf noduna enjekte edilir ve diğer taraftaki inguinal lenf noduna eşit hacimlerde PBS enjekte edilir. (B) LN'lerin temsili hematoksilen ve eozin (H & E, 100x) boyanması. Kısaltmalar: s.c. = deri altı; CTX= siklofosfamid; i.v. = intravenöz; Sac = fedakarlık; nLN = metastatik olmayan LN; mLN = metastatik LN. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Akış sitometrisi analizi için geçit stratejisi. Donör kaynaklı aktive edilmiş antijene özgü CD8 + T hücrelerini tanımlamak için kullanılan geçit stratejisi. Kısaltmalar: L/D = canlı/ölü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: LN metastazı sırasında antijene özgü CD8+ T hücrelerinin dinamiği. Farklı zaman noktalarında (A) periferik kan, (B) nLN ve mLN'deki antijene özgü CD8+ T hücrelerinin oranı. Kısaltmalar: nLN = metastatik olmayan LN; mLN = metastatik LN. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tümör oluşumu sırasında, antijen sunan hücreler (APC'ler) tümör antijenlerini yutar ve CD8+ T hücrelerini hazırladıkları TdLN'ye göç eder. Hazırlama ve aktivasyondan sonra, CD8 + T hücreleri TdLN'yi terk eder ve tümör hücrelerini öldürmek için tümöre sızar10. TdLN rezeksiyonu ve lenfoid organlardan bağışıklık hücrelerinin çıkışını bloke eden FTY720'nin uygulanması yoluyla, birkaç çalışma TdLN'nin PD-1/PD-L1 kontrol noktası tedavisinin etkinliğini sağlamadaki önemli rolünü göstermiştir34,35. Bununla tutarlı olarak, yakın zamanda tümöre özgü bellek CD8 + T hücrelerinin (TTSM) ağırlıklı olarak TdLN'de bulunduğunu, bu TdLN-TTSM hücrelerinin ICB9'a iyi niyetli yanıtlayıcılar olarak hizmet ettiğini bulduk. Ne yazık ki, çeşitli kanser hücreleri sıklıkla primer tümör bölgelerinden TdLN'lere yayılır ve bu da TdLN'lerde yapısal yeniden doğrulamaya ve bağışıklık hücresi işlev bozukluğuna yol açar. mLN'lerde CD8+ T hücrelerinin bozulmuş miktar ve kalitesi daha önce tanımlanmıştır20,36. Bununla birlikte, CD8+ T hücrelerinin, özellikle tümör antijenine özgü CD8+ T hücrelerinin LN metastatik kaskad sırasındaki dinamik değişiklikleri aydınlatılamamıştır.
Burada, LN metastazı sürecinde sistemik ve lokal antijene özgü CD8+ T hücrelerinin dinamiklerini izlemek için uygun bir fare modeli geliştirdik. B16F10-GP melanom hücreleri, bilateral kasık bölgesine deri altından implante edildi, ardından GP'den türetilen peptit GP33-41 tarafından spesifik olarak aktive edilebilen P14 hücreleri ile evlat edinilerek transfer edildi. Hücre transferinden sonraki 7. günde, inguinal LN'lerdeki P14 hücreleri tam olarak aktive edildiğinde, her iki taraftaki primer tümörler rezeke edildi ve B16F10-GP hücreleri doğrudan tek taraflı inguinal LN'ye enjekte edildi, diğer tarafta eşit hacimlerde PBS ile enjeksiyon yoluyla sahte operasyon yapıldı. Bu dahiyane tasarım, aynı farelerde mLN ve metastatik olmayan LN'deki (nLN) P14 hücrelerinin karşılaştırılmasını sağlar. Eşzamanlı olarak, aynı farelerde perifer kanındaki P14 hücreleri, orbital venin kanamasıyla LN metastazı sırasında farklı zaman noktalarında tespit edildi. Çevre kanındaki P14 hücrelerinin ve TdLN'lerin LN metastazı sırasında farklı aşamalardaki frekanslarının yanı sıra, bu antijene özgü CD8+ T hücrelerinin transkripsiyonel ve epigenetik özellikleri diğer tekniklerle daha fazla incelenebilir.
Dikkat edilmesi gereken, birkaç adımın dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir. İlk olarak, rezidüel tümör hücreleri hızla yeniden büyüyeceğinden, primer tümörler iyice çıkarılmalıdır. İkinci olarak, tümör dokuları, primer tümör rezeksiyonu sırasında genellikle kaçınılmaz olarak kırılan ve masif kanama nedeniyle cerrahi farelerin ölümüne yol açan bol miktarda yeni kan damarı içerdiğinden, operasyon nazikçe yapılmalıdır. Bu nedenle, primer tümör rezeksiyonunun zamanlaması kritik öneme sahiptir. Genel olarak, tümör yaklaşık 5 x 5 mm boyutuna ulaştığında çıkarılması nispeten güvenlidir ve tümör hücreleri, alt veya bitişik dokulardan ziyade LN'ye tam olarak enjekte edilmelidir. Ayrıca, tümör hücresi süspansiyonlarının hacmi 20 μL'nin altında kontrol edilmelidir, aksi takdirde dökülme LN dışında yeni tümör oluşturur. Son olarak, bu protokolün bir sınırlaması, operasyonun travmatik olması ve farelerin iyileşme sürecinde antijene özgü CD8 + T hücrelerinin özelliklerini etkileyecek enfeksiyon yaşayabilmesidir. Bu nedenle, ameliyat sırasında sıkı asepsi sürdürülmesi kritik öneme sahiptir ve antijene özgü CD8 + T hücrelerine enjeksiyonla indüklenen fiziksel hasarın etkisini dışlamak için sahte PBS enjeksiyonu yapılmalıdır.
Genel olarak, LN metastazı sırasında antijene özgü CD8+ T hücrelerini araştırmak için uygun bir model sunuyoruz ve LN metastazı sırasında antijene özgü CD8+ T hücreleri ile diğer immün hücreler veya stroma hücreleri arasındaki etkileşimler de aydınlatılabilir. Ek olarak, diğer birkaç tümör modeline kolayca genişletilebilir. Toplu olarak, bu protokol kanser immünolojisi çalışması için yararlı bir üreme modeli sunar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan etmezler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin'in Seçkin Genç Akademisyenleri için Ulusal Bilim Vakfı (No. 82122028'den LX'e), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 82173094'den LX'e), Chong Qing Doğa Bilimleri Vakfı (No. 2023NSCQ-BHX0087'dan SW'ye) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16-GP cell line | Beijing Biocytogen Co.Ltd, China | Custom | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Cyclophosphamide (CTX) | Sigma | PHR1404 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
References
- Morad, G., Helmink, B. A., Sharma, P., Wargo, J. A. Hallmarks of response, resistance, and toxicity to immune checkpoint blockade. Cell. 184 (21), 5309-5337 (2021).
- Korman, A. J., Garrett-Thomson, S. C., Lonberg, N. The foundations of immune checkpoint blockade and the ipilimumab approval decennial. Nat Rev Drug Discov. 21 (7), 509-528 (2022).
- Chamoto, K., et al. Mitochondrial activation chemicals synergize with surface receptor PD-1 blockade for T cell-dependent antitumor activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (5), E761-E770 (2017).
- Spitzer, M. H., et al. Systemic immunity is required for effective cancer immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
- Yost, K. E., et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nat Med. 25 (8), 1251-1259 (2019).
- Wu, T. D., et al. Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature. 579 (7798), 274-278 (2020).
- Connolly, K. A., et al. A reservoir of stem-like cd8(+) t cells in the tumor-draining lymph node preserves the ongoing antitumor immune response. Sci Immunol. 6 (64), eabg7836 (2021).
- Schenkel, J. M., et al. Conventional type I dendritic cells maintain a reservoir of proliferative tumor-antigen specific Tcf-1+ CD8+ T cells in tumor-draining lymph nodes. Immunity. 54 (10), 2338-2353 (2021).
- Huang, Q., et al. The primordial differentiation of tumor-specific memory cd8(+) t cells as bona fide responders to pd-1/pd-l1 blockade in draining lymph nodes. Cell. 185 (22), 4049-4066 (2022).
- Kanda, Y., Okazaki, T., Katakai, T. Motility dynamics of T cells in tumor-draining lymph nodes: A rational indicator of antitumor response and immune checkpoint blockade. Cancers (Basel). 13 (18), 4616 (2021).
- Karaman, S., Detmar, M.
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
- Reticker-Flynn, N. E., et al. Lymph node colonization induces tumor-immune tolerance to promote distant metastasis. Cell. 185 (11), 1924-1942 (2022).
- Leong, S. P., et al. Impact of nodal status and tumor burden in sentinel lymph nodes on the clinical outcomes of cancer patients. J Surg Oncol. 103 (6), 518-530 (2011).
- Lyman, G. H., et al. Sentinel lymph node biopsy for patients with early-stage breast cancer: American society of clinical oncology clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 35 (5), 561-564 (2017).
- Wong, S. L., et al. Sentinel lymph node biopsy and management of regional lymph nodes in melanoma: American society of clinical oncology and society of surgical oncology clinical practice guideline update. Ann Surg Oncol. 25 (2), 356-377 (2018).
- Faries, M. B., et al. Completion dissection or observation for sentinel-node metastasis in melanoma. N Engl J Med. 376 (23), 2211-2222 (2017).
- Giuliano, A. E., et al. Effect of axillary dissection vs no axillary dissection on 10-year overall survival among women with invasive breast cancer and sentinel node metastasis: The ACOSOG Z0011 (alliance) randomized clinical trial. JAMA. 318 (10), 918-926 (2017).
- du Bois, H., Heim, T. A., Lund, A. W. Tumor-draining lymph nodes: At the crossroads of metastasis and immunity. Sci Immunol. 6 (63), eabg3551 (2021).
- An, S., et al. Locally trapping the c-c chemokine receptor type 7 by gene delivery nanoparticle inhibits lymphatic metastasis prior to tumor resection. Small. 15 (9), e1805182 (2019).
- Lee, C. K., et al. Tumor metastasis to lymph nodes requires yap-dependent metabolic adaptation. Science. 363 (6427), 644-649 (2019).
- Buchwald, Z. S., et al. Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy. J ImmunoTher Cancer. 8 (2), e000867 (2020).
- Siddiqui, I., et al. Intratumoral Tcf1+PD-1+CD8+ T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy. Immunity. 50 (1), 195.e10-211.e10 (2019).
- Ashton-Rickardt, P. G., et al. Evidence for a differential avidity model of T cell selection in the thymus. Cell. 76 (4), 651-663 (1994).
- Manjunath, N., et al. Effector differentiation is not prerequisite for generation of memory cytotoxic T lymphocytes. J Clin Invest. 108 (6), 871-878 (2001).
- Khan, O., et al. TOX transcriptionally and epigenetically programs CD8+ T cell exhaustion. Nature. 571 (7764), 211-218 (2019).
- North, R. J. Cyclophosphamide-facilitated adoptive immunotherapy of an established tumor depends on elimination of tumor-induced suppressor T cells. J Exp Med. 155 (4), 1063-1074 (1982).
- Maine, G. N., Mule, J. J. Making room for T cells. J Clin Invest. 110 (2), 157-159 (2002).
- Xue, G., et al. Adoptive cell therapy with tumor-specific th9 cells induces viral mimicry to eliminate antigen-loss-variant tumor cells. Cancer Cell. 39 (12), 1610.e9-1622.e9 (2021).
- Prokhnevska, N., et al. CD8+ T cell activation in cancer comprises an initial activation phase in lymph nodes followed by effector differentiation within the tumor. Immunity. 56 (1), 107.e5-124.e5 (2023).
- Wang, L., et al. Tumor transplantation for assessing the dynamics of tumor-infiltrating CD8+ T cells in mice. J Vis Exp. (172), e62442 (2021).
- Liu, Q., et al. Tumor-specific memory cd8(+) t cells are strictly resident in draining lymph nodes during tumorigenesis. Cell Mol Immunol. 20 (4), 423-426 (2023).
- Fransen, M. F., et al. Tumor-draining lymph nodes are pivotal in pd-1/pd-l1 checkpoint therapy. JCI Insight. 3 (23), e124507 (2018).
- Francis, D. M., et al. Blockade of immune checkpoints in lymph nodes through locoregional delivery augments cancer immunotherapy. Sci Transl Med. 12 (563), eaay3575 (2020).
- Garner, H., de Visser, K. E. Immune crosstalk in cancer progression and metastatic spread: A complex conversation. Nat Rev Immunol. 20 (8), 483-497 (2020).
