من أجل دراسة التعبير الجيني في أنسجة الجناح العذراء من anynana Bicyclus ، نقدم بروتوكول الأمثل لفي الموقع التهجين باستخدام riboprobes. كما نقوم بتوفير مبادئ توجيهية لمزيد من التحسين على هذا البروتوكول لاستخدامها في أجنحة العذراء الأنواع Lepidopteran الأخرى.
Abstract
هنا نقدم ، في شكل شرائط فيديو ، وبروتوكول لالتهجين في الموقع في أجنحة العذراء من anynana Bicyclus فراشة riboprobes به. التهجين في الموقع ، وهي الدعامة الأساسية لعلم الأحياء التطوري ومفيدة لدراسة الأنماط المكانية والزمانية في التعبير الجيني في أنسجة النامية على مستوى النسخ. إذا الأجسام المضادة التي تستهدف منتجات البروتين من النسخ الجيني لم يتم تطويرها ، و / أو وجود نسخ متعددة من الجينات بروتين معين في الخريطة الوراثية البشرية التي لا يمكن أن تكون متباينة باستخدام الاجسام المضادة المتوفرة ، يمكن أن تستخدم في مكان المال بدلا من ذلك. في حين أن الوضع الطبيعي للتقنية أقراص الجناح اليرقات كانت متاحة للمجتمع فراشة لعدة سنوات ، وقد تم تحسين البروتوكول الحالي لأجنحة العذراء أكبر وأكثر هشاشة.
Protocol
DAY 1 إعداد الحلول التالية : 10X PBS 1X PBS 1X PBT DDH 2 O <li style=";text-align:…
Discussion
تعظيم الاستفادة من البروتوكولات القائمة
التهجين في الموقع على أقراص الجناح اليرقات أجريت بنجاح باستخدام أقراص من الفراشات coenia نبذة (كارول وآخرون 1994 ؛. كيز وآخرون 1999 ؛. Weatherbee وآخرون 1999). وقد تم تكييف البروتوكول الحالي من بروتوكول الخطية المفصلة متوفرة ع…
Acknowledgements
نشكر جين Selegue ، هولينجسورث مارغريت ، بيري جين ، Futahashi ريو ، Najmus محفوظ سحر Popadic الكسندر بوب ريد ، روش الدعم الفني للحصول على مساعدة في استكشاف هذا البروتوكول. ونحن نشكر أيضا وليم Piel للحصول على المشورة حول تحرير الفيلم.
Materials
Material Name
Tipo
Company
Catalogue Number
Comment
Fix Buffer
4% Paraformaldehyde in PBS
PBT
0.1% Tween 20 in PBS
Proteinase K solution
2.5g/ml Proteinase K in PBT
Digestion Stop Buffer
2 mg/ml glycine in PBT
Pre-Hybridization Buffer
For 50 ml PHB: 12 ml DEPC treated water + 25 ml Formamide + 12.5 ml 20 x SSC + 50 ul Tween 20 + 500 ul 10 mg/ml salmon sperm (Rnase free, heat denatured prior to addition to solution).
Hybridization Buffer
Add 1 mg/ml glycogen to prehybridization buffer
Block Buffer
50 mM Tris pH 6.8, 150 mM NaCl, 0.5% IGEPAL (NP40), 5 mg/ml BSA