Het laden van Drosophila zenuwuiteinden met Calcium-indicatoren
Summary
Calcium is een alomtegenwoordige boodschapper in het zenuwstelsel, essentieel voor het activeren van vrijkomen van neurotransmitters en veranderingen in de synaptische sterkte. Hier laten we zien een techniek voor het laden van Ca 2 +-indicatoren in Drosophila zenuwuiteinden. We tonen ook aan de fabricage van de benodigde apparatuur en benadrukken punten van cruciaal belang voor het succes van de techniek is.
Abstract
Calcium speelt vele rollen in het zenuwstelsel, maar niemand meer indrukwekkend dan als de trigger voor neurotransmitter release, en niemand meer diepgaand dan als de boodschapper van essentieel belang voor de synaptische plasticiteit dat leren en het geheugen ondersteunt. Om verder ophelderen van de moleculaire onderbouwing van Ca 2 +-afhankelijke synaptische mechanismen, is een model-systeem vereist dat zowel genetisch kneedbaar en fysiologisch toegankelijk. Drosophila melanogaster voorziet in een dergelijk model. In dit systeem, genetisch gecodeerde fluorescerende indicatoren zijn beschikbaar om Ca 2 + de opsporing van wijzigingen in de zenuwuiteinden. Echter, deze indicatoren beperkt de gevoeligheid voor Ca 2 + en vertonen vaak een non-lineaire respons. Synthetische fluorescerende indicatoren zijn beter geschikt voor het meten van de snelle Ca 2 + veranderingen die gepaard gaan met de activiteit van de nervus. Hier laten we zien een techniek voor het laden van dextran-geconjugeerde synthetische Ca 2 +-indicatoren in live zenuwuiteinden in Drosophila larven. Bijzondere nadruk wordt gelegd op die aspecten van het protocol het meest kritisch voor het succes van de techniek, zoals hoe je statische elektriciteit ontladingen te voorkomen langs de geïsoleerde zenuwen, het handhaven van de gezondheid van de voorbereiding tijdens lange laad-periodes, en te zorgen voor axon overleven door het verstrekken van Ca 2 + het bevorderen van afdichten van afgehakte axon einde. Lage affiniteit dextran-geconjugeerd Ca 2 +-indicatoren, zoals fluo-4 en Rhod, zijn beschikbaar die een hoge signaal-ruisverhouding zien, terwijl minimaal te verstoren presynaptische Ca 2 + dynamiek. Dextran-conjugatie helpt te voorkomen dat Ca 2 +-indicatoren worden afgezonderd in de organellen, zoals mitochondriën. De laad-techniek kan ook toegepast worden op larven, embryo's en volwassenen.
Protocol
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Schneider’s Insect Medium | Reagent | Sigma | S0146 | must contain L-glutamine and calcium |
| L-glutamic acid monosodium salt hydrate | Reagent | Sigma | G1626 |
Referências
- Macleod, G. T., Hegstrom-Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Fast calcium signals in Drosophila motor neuron terminals. J. Neurophysiol. 88, 2659-2663 (2002).
- Macleod, G. T., Suster, M. L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Single neuron activity in the Drosophila larval CNS detected with calcium indicators. J. Neurosci. Methods. 127, 167-178 (2003).
- Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M. P., Atwood, H. L. Synaptic vesicles: test for a role in presynaptic calcium regulation. J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).
- Reiff, D. F., Thiel, P. R., Schuster, C. M. Differential regulation of active zone density during long-term strengthening of Drosophila neuromuscular junctions. J. Neurosci. 22, 9399-9409 (2002).
- Reiff, D. F., Ihring, A., Guerrero, G., Isacoff, E. Y., Joesch, M., Nakai, J., Borst, A. In vivo performance of genetically encoded indicators of neural activity in flies. J. Neurosci. 25, 4766-4778 (2005).
