Generering och återvinning av β-cell sfäroider från steg-tillväxt PEG-peptid Hydrogeler
Summary
Följande protokoll ger tekniker för inkapsling pankreas β-celler i steg-tillväxt PEG-peptid hydrogeler bildas av tiol-en foto-klick reaktioner. Detta material plattform inte bara erbjuder en cytocompatible mikromiljö för cellinkapsling, utan också tillåter användarstyrd snabb återhämtning av cellstrukturer bildas inom hydrogeler.
Abstract
Hydrogeler är hydrofila tvärbundna polymerer som ger en tredimensionell mikromiljö med vävnads-liknande elasticitet och hög permeabilitet för odling terapeutiskt relevanta celler eller vävnader. Hydrogeler framställda från poly (etylenglykol) (PEG)-derivat används alltmer för en mängd olika tillämpningar vävnadsutvecklingssteg, delvis på grund av deras avstämbara och cytocompatible egenskaper. I detta protokoll används vi tiol-en steg-tillväxt photopolymerizations att tillverka PEG-peptid hydrogeler för inkapsling bukspottkörteln MIN6 B-celler. Gelerna bildades av 4-arm PEG-norbornen (PEG4NB) makromer och en chymotrypsin känslig peptid tvärbindningsmedlet (CGGYC). Den hydrofila och icke-nedsmutsning karaktär av PEG har en cytocompatible mikromiljö för cellöverlevnad och proliferation i 3D, medan användningen av kymotrypsin-känslig peptidsekvens (C-GGY ↓ C indikerar pilen enzym klyvningsställe, medan terminal cystaeine rester lades till tiol-en tvärbindning) tillåter snabb återhämtning av cell konstruktioner som bildar inom hydrogelen. Följande protokoll utvecklar tekniker för: (1) Inkapsling av MIN6 β-celler i tiol-en hydrogeler, (2) Kvalitativa och kvantitativa cellernas viabilitet analyser för att bestämma cellöverlevnad och-proliferation, (3) Återvinning av cell sfäroider med kymotrypsin-medierad gel erosion, och (4) strukturell och funktionell analys av de återvunna sfäroider.
Introduction
Hydrogeler är hydrofila tvärbundna polymerer med exceptionell potential som byggnadsställningar material för reparation och regenerering vävnader. 1-3 Den höga vattenhalten i hydrogeler möjliggör enkel diffusion av syre och utbyte av näringsämnen och cellulära metaboliska produkter, som alla är avgörande för att upprätthålla cellviabiliteten. Dessutom hydrogeler är utmärkta bärare för kontrollerad frisättning och cell leverans på grund sin höga avstämbarhet. 2 Syntetiska hydrogeler såsom de framställs från poly (etylenglykol) (PEG) används alltmer i applikationer vävnadsteknik, till stor del på grund av deras cytocompatibility, vävnads- såsom elasticitet och hög avstämbarhet i material fysikaliska och mekaniska egenskaper. 4-6
Även om en vanligt hydrogel plattform har studier visat att PEG-diakrylat (PEGDA) hydrogeler bildas genom kedje-tillväxt photopolymerizations har en tendens att skada inkapslade celler During-nätverk tvärbindning och in situ cell inkapsling. 7 Det cellulära skadorna till stor del hänföras till radikalspecies genereras av fotoinitiatorn molekyler, som propagerar genom vinylgrupper på PEGDA att tvärbinda polymerkedjor i hydrogeler. Tyvärr är dessa radikalspecies också orsaka spänningar och cellulär skada under cell inkapsling, särskilt för radikal-känsliga celler såsom pankreas β-celler. 8-10 För att erhålla en högre maskstorleken för bättre spridning och cellöverlevnad, högre molekylvikter PEGDA används ofta för cellinkapsling. Detta är dock kompromisser polymerisations kinetik och orsakar suboptimala gel biofysiska egenskaper. 7,11,12 Utöver de ovan nämnda nackdelarna, är det mycket svårt att återvinna cellstrukturer från PEGDA hydrogeler beroende på heterogeniteten och icke-nedbrytbara naturen hos de tvärbundna nätverk. Medan proteaskänsliga peptider kan inkorporerasi PEG makromer ryggraden för att göra annars inerta PEGDA hydrogeler känsliga för enzymatisk klyvning använder konjugering ofta dyra reagens och de resulterande nätverken fortfarande innehåller höga grad av heterogenitet på grund av typen av kedja-tillväxt polymerisation. 13-15
Nyligen, har PEG-peptid hydrogeler bildade via steg-tillväxt tiol-en fotopolymerisation visats uppvisa förmånliga egenskaper för cellinkapsling över hydrogeler bildade genom kedje-tillväxt fotopolymerisation. 7 De överlägsna gelning kinetik tiol-en hydrogeler tillskrivs "klick "natur reaktion mellan tiol och en-funktioner. Jämfört med kedja-tillväxt polymerisation av PEGDA är tiol-en reaktion mindre syre hämmade vilket resulterar i snabbare gelning takt. 16,17 Tiol-en hydrogeler också har högre polymerisa effektivitet och bättre gel biofysiska egenskaper jämfört med kedja-tillväxt PEGDA hydrogeler, 7 , 18 </ Sup> vilket resulterar i begränsad cellulär skada som orsakas av radikala arter under fotopolymerisation.
Tidigare, tiol-en hydrogeler bildas av 4-arm PEG-norbornen (PEG4NB) makromer och bis-cystein innehållande tvärbindare peptid, såsom proteas-känsliga peptider har använts för cellinkapsling. 7,18 Hög avstämbarhet av PEG hydrogel nätverk erbjuder en flexibel och kontrollerbar 3D mikromiljö för undersökning cellöverlevnad och aktivitet, medan användningen av proteas-känslig peptidsekvens ger en mild sätt för återvinning av cell konstruktioner bildade naturligt inom hydrogeler. I detta protokoll använder vi steg-tillväxt fotopolymeriserad tiol-en hydrogeler tillverkade användning av 4-arm PEG-norbornen (PEG4NB) och en chymotrypsin-känslig peptid tvärbindningsmedel (CGGY ↓ C) för inkapsling av MIN6 β-celler. Detta protokoll utvecklar systematiskt tekniker för att studera överlevnad, proliferation och sfäroid bildning av MIN6β-celler i tiol-en-hydrogeler. Vi tillhandahåller ytterligare metod för β-celler sfäroid återhämtning och biologisk karakterisering av återvunna sfäroider.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den beskrivna protokollet ger information om enkel inkapsling av celler i tiol-en hydrogeler bildas genom steg-tillväxt fotopolymerisation. Medan ett stökiometriskt förhållande av 1:1 av norbomen till tiolfunktionella grupper användes i detta protokoll, förhållandet kan justeras beroende på experimenten. Förutom en korrekt formulering, är det viktigt att bibehålla homogenitet i pre-polymer-lösning. I synnerhet kan försiktig pipettering för att säkerställa att celler väl fördelade i pre-polymer-lösning…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta projekt har finansierats av NIH (R21EB013717) och IUPUI gripit över (RSFG). Författaren tackar Ms Han Shih för hennes hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-arm PEG (20kDa) | Jenkem Technology USA | 4ARM-PEG-20K | |
| Fmoc-amino acids | Anaspec | ||
| Live/Dead cell viability kit | Invitrogen | L3224 | Includes Calcein AM and Ethidium homodimer-1 |
| AlamarBlue reagent | AbD Serotec | BUF012 | |
| CellTiter Glo reagent | Promega | G7570 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| HBSS | Lonza | 10547F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| High Glucose DMEM | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | |
| Trypsin-free α-chymotrypsin | Worthington Biochemical Corp | LS001432 | |
| Mouse Inusin ELISA kit | Mercodia | 10-1247-01 | |
| 1 ml disposable syringe | BD biosciences |
References
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103, 655-663 (2009).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative medicine. Pharmaceutical research. 26, 631-643 (2009).
- Lin, C. C., Metters, A. T. Hydrogels in controlled release formulations: network design and mathematical modeling. Advanced drug delivery reviews. 58, 1379-1408 (2006).
- Khetan, S., Burdick, J. A. Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions. Soft Matter. 7, 830-838 (2011).
- Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Human neutrophil elastase responsive delivery from poly(ethylene glycol) hydrogels. Biomacromolecules. 10, 1484-1489 (2009).
- Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled beta-cell microenvironments. Acta biomaterialia. 2, 1-8 (2006).
- Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids. Biomaterials. 32, 9685-9695 (2011).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. Glucagon-like peptide-1 functionalized PEG hydrogels promote survival and function of encapsulated pancreatic beta-cells. Biomacromolecules. 10, 2460-2467 (2009).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. Cell-cell communication mimicry with poly(ethylene glycol) hydrogels for enhancing beta-cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6380-6385 (2011).
- Hui, H., Nourparvar, A., Zhao, X., Perfetti, R. Glucagon-like peptide-1 inhibits apoptosis of insulin-secreting cells via a cyclic 5′-adenosine monophosphate-dependent protein kinase A- and a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Endocrinology. 144, 1444-1445 (2003).
- Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function. Journal of biomedical materials research. Part A. 90, 720-729 (2009).
- Weber, L. M., Hayda, K. N., Haskins, K., Anseth, K. S. The effects of cell-matrix interactions on encapsulated beta-cell function within hydrogels functionalized with matrix-derived adhesive peptides. Biomaterials. 28, 3004-3011 (2007).
- Hsu, C. W., Olabisi, R. M., Olmsted-Davis, E. A., Davis, A. R., West, J. L. Cathepsin K-sensitive poly(ethylene glycol) hydrogels for degradation in response to bone resorption. Journal of biomedical materials research. Part A. 98, 53-62 (2011).
- Leslie-Barbick, J. E., Moon, J. J., West, J. L. Covalently-immobilized vascular endothelial growth factor promotes endothelial cell tubulogenesis in poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels. Journal of biomaterials science. Polymer. 20, 1763-1779 (2009).
- Moon, J. J., Hahn, M. S., Kim, I., Nsiah, B. A., West, J. L. Micropatterning of poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels with biomolecules to regulate and guide endothelial morphogenesis. Tissue engineering. Part A. 15, 579-585 (2009).
- Hoyle, C. E., Bowman, C. N. Thiol-ene click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 49, 1540-1573 (2010).
- Hoyle, C. E., Lowe, A. B., Bowman, C. N. Thiol-click chemistry: a multifaceted toolbox for small molecule and polymer synthesis. Chemical Society reviews. 39, 1355-1387 (2010).
- Fairbanks, B. D., et al. A Versatile Synthetic Extracellular Matrix Mimic via Thiol-Norbornene Photopolymerization. Adv. Mater. 21, 5005 (2009).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30, 6702-6707 (2009).
- Zustiak, S. P., Leach, J. B. Characterization of protein release from hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogels. Biotechnology and bioengineering. 108, 197-206 (2011).
