Generazione e recupero dei β-cellule Spheroids dal passaggio di crescita PEG-peptide idrogel
Summary
Il seguente protocollo fornisce tecniche per l'incapsulamento pancreatiche β-cellule in fase di crescita PEG-peptide idrogel formati da tiolo-ene foto-click reazioni. Questa piattaforma materiale non solo offre un microambiente cytocompatible per l'incapsulamento delle cellule, ma anche controllato dall'utente consente un rapido recupero delle strutture cellulari formano all'interno dei idrogel.
Abstract
Gli idrogel sono polimeri reticolati idrofili che forniscono un microambiente tridimensionale con tessuto-come elasticità ed elevata permeabilità per coltura di cellule o tessuti terapeuticamente rilevanti. Idrogel preparati da poli (etilene glicole) (PEG) derivati sono sempre più utilizzati per una varietà di applicazioni di ingegneria tissutale, in parte a causa delle loro proprietà e cytocompatible sintonizzabili. In questo protocollo, abbiamo utilizzato tiolo-ene-step crescita photopolymerizations per fabbricare PEG-peptide idrogel per incapsulare pancreatica MIN6 b-cellule. I gel sono stati formati da 4-braccio PEG-norbornene (PEG4NB) e un macromero chimotripsina sensibile reticolante peptide (CGGYC). La natura idrofila e non-fouling di PEG offre un microambiente cytocompatible per la sopravvivenza e la proliferazione cellulare in 3D, mentre l'utilizzo di chimotripsina-sensitive sequenza peptidica (C GGY ↓ C, freccia indica sito di clivaggio enzimatico, mentre cisti terminaleeine residui sono stati aggiunti per tiolo-ene reticolazione) permette un rapido recupero di costruzioni cellulari che formano all'interno del idrogel. Il seguente protocollo elabora tecniche per: (1) Incapsulamento di MIN6 β-cellule nel tiolo-ene idrogel, (2) analisi qualitativa e quantitativa della vitalità cellulare per determinare la sopravvivenza e la proliferazione cellulare, (3) Recupero di sferoidi cellulari usando chimotripsina-mediata gel erosione, e (4) Analisi strutturale e funzionale degli sferoidi recuperati.
Introduction
Gli idrogel sono idrofili polimeri reticolati con un potenziale eccezionale come materiali ponteggi per la riparazione e la rigenerazione dei tessuti. 1-3 L'alto contenuto di acqua degli idrogel permette facile diffusione di ossigeno e di scambio di nutrienti e prodotti del metabolismo cellulare, che sono tutti fondamentale per mantenere la vitalità cellulare. Inoltre, gli idrogel sono vettori eccellenti per rilascio controllato e consegna cellulare dovuta loro sintonizzabilità alta. 2 idrogel sintetici come quelli preparati da poli (etilene glicole) (PEG) sono sempre più utilizzati in applicazioni di ingegneria tissutale, soprattutto a causa della loro citocompatibilità, tessuto- elasticità simile, e sintonizzabilità alta in materiale proprietà fisiche e meccaniche. 4-6
Sebbene una piattaforma idrogel comunemente usato, studi hanno dimostrato che PEG diacrilato (PEGDA) idrogel formato da catene crescita photopolymerizations tendono a danneggiare le cellule incapsulate durireticolazione rete ng e in situ incapsulamento delle cellule. 7 Il danno cellulare è stato largamente attribuito alla specie radicali generati dalle molecole di fotoiniziatore che si propagano attraverso i gruppi vinilici su PEGDA per reticolare catene polimeriche in idrogel. Purtroppo, queste specie radicali anche causare sollecitazioni e danno cellulare durante l'incapsulamento delle cellule, in particolare per radicale cellule sensibili come β-cellule pancreatiche. 8-10 Per ottenere una dimensione di maglia superiore per una migliore diffusione e la sopravvivenza cellulare, maggiore peso molecolare PEGDA vengono spesso utilizzati per l'incapsulamento delle cellule. Questo, tuttavia, compromette cinetica di polimerizzazione e provoca sub-ottimali proprietà biofisiche gel. 7,11,12 Oltre ai suddetti inconvenienti, è molto difficile recuperare strutture cellulari da idrogel PEGDA causa della natura eterogeneità e non degradabile dei le reti reticolati. Mentre proteasi sensibili peptidi possono essere incorporatinel backbone macromero PEG rendere gli idrogel altrimenti inerti PEGDA sensibili alla scissione enzimatica, la coniugazione usa spesso reagenti costosi e le reti risultanti contengono ancora un'elevata eterogeneità a causa della natura della catena crescita polimerizzazione. 13-15
Recentemente, PEG-peptide idrogel formati tramite step-crescita tiolo-ene fotopolimerizzazione hanno dimostrato di esibire proprietà preferenziali per incapsulamento di cellule nel idrogel formati dalla catena crescita fotopolimerizzazione. 7 La cinetica di gelazione superiori di tiolo-ene idrogel è attribuita al 'click 'natura della reazione tra tiolo e funzionalità ene. Rispetto alla catena crescita polimerizzazione di PEGDA, tiolo-ene reazione è inibita meno ossigeno che si traduce in velocità di gelificazione veloce. 16,17 tiolo-ene idrogel hanno anche maggiore efficienza di polimerizzazione e le proprietà biofisiche gel migliori rispetto alla catena crescita PEGDA idrogel, 7 , 18 </ Sup> che si traduce in limitate danni cellulari provocati dai radicali specie durante la fotopolimerizzazione.
Precedentemente, tiolo-ene idrogel formato dal braccio 4-PEG-norbornene (PEG4NB) macromero e bis-cisteina reticolanti contenenti peptidi, come proteasi sensibili peptidi sono stati utilizzati per l'incapsulamento delle cellule. 7,18 sintonizzabilità Massima reti idrogel PEG offre flessibile e controllabile microambiente 3D per indagare la sopravvivenza cellulare e l'attività, mentre l'utilizzo di proteasi sensibile sequenza peptidica fornisce un modo delicato per il recupero dei costrutti cellulari formano naturalmente all'interno di idrogel. In questo protocollo utilizziamo passo-crescita photopolymerized tiolo-ene idrogel fabbricato utilizzando 4-braccio PEG-norbornene (PEG4NB) e chimotripsina sensibile reticolante peptide (CGGY ↓ C) per l'incapsulamento di MIN6 β-cellule. Questo protocollo elabora sistematicamente le tecniche per lo studio della formazione di sopravvivenza, proliferazione e sferoidale di MIN6β-cellule tiolo-ene idrogel. Abbiamo inoltre fornisce metodo per β-cellule recupero sferoide e caratterizzazione biologica di sferoidi recuperati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descritto presenta dettagli facile incapsulamento di cellule in tiolo-ene idrogel formati da passo-crescita fotopolimerizzazione. Mentre un rapporto stechiometrico di 1:1 di norbornene a tiolo gruppi funzionali è stato utilizzato in questo protocollo, il rapporto può essere regolata a seconda delle esperienze. Oltre a una corretta formulazione, è importante mantenere omogeneità nella pre-polimero soluzione. In particolare, utilizzare pipettaggio delicato per garantire che le cellule sono ben distribuit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo progetto è stato finanziato dal NIH (R21EB013717) e IUPUI OVCR (RSFG). L'autore ringrazia la signora Han Shih per la sua assistenza tecnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-arm PEG (20kDa) | Jenkem Technology USA | 4ARM-PEG-20K | |
| Fmoc-amino acids | Anaspec | ||
| Live/Dead cell viability kit | Invitrogen | L3224 | Includes Calcein AM and Ethidium homodimer-1 |
| AlamarBlue reagent | AbD Serotec | BUF012 | |
| CellTiter Glo reagent | Promega | G7570 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| HBSS | Lonza | 10547F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| High Glucose DMEM | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | |
| Trypsin-free α-chymotrypsin | Worthington Biochemical Corp | LS001432 | |
| Mouse Inusin ELISA kit | Mercodia | 10-1247-01 | |
| 1 ml disposable syringe | BD biosciences |
References
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103, 655-663 (2009).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative medicine. Pharmaceutical research. 26, 631-643 (2009).
- Lin, C. C., Metters, A. T. Hydrogels in controlled release formulations: network design and mathematical modeling. Advanced drug delivery reviews. 58, 1379-1408 (2006).
- Khetan, S., Burdick, J. A. Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions. Soft Matter. 7, 830-838 (2011).
- Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Human neutrophil elastase responsive delivery from poly(ethylene glycol) hydrogels. Biomacromolecules. 10, 1484-1489 (2009).
- Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled beta-cell microenvironments. Acta biomaterialia. 2, 1-8 (2006).
- Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids. Biomaterials. 32, 9685-9695 (2011).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. Glucagon-like peptide-1 functionalized PEG hydrogels promote survival and function of encapsulated pancreatic beta-cells. Biomacromolecules. 10, 2460-2467 (2009).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. Cell-cell communication mimicry with poly(ethylene glycol) hydrogels for enhancing beta-cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6380-6385 (2011).
- Hui, H., Nourparvar, A., Zhao, X., Perfetti, R. Glucagon-like peptide-1 inhibits apoptosis of insulin-secreting cells via a cyclic 5′-adenosine monophosphate-dependent protein kinase A- and a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Endocrinology. 144, 1444-1445 (2003).
- Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function. Journal of biomedical materials research. Part A. 90, 720-729 (2009).
- Weber, L. M., Hayda, K. N., Haskins, K., Anseth, K. S. The effects of cell-matrix interactions on encapsulated beta-cell function within hydrogels functionalized with matrix-derived adhesive peptides. Biomaterials. 28, 3004-3011 (2007).
- Hsu, C. W., Olabisi, R. M., Olmsted-Davis, E. A., Davis, A. R., West, J. L. Cathepsin K-sensitive poly(ethylene glycol) hydrogels for degradation in response to bone resorption. Journal of biomedical materials research. Part A. 98, 53-62 (2011).
- Leslie-Barbick, J. E., Moon, J. J., West, J. L. Covalently-immobilized vascular endothelial growth factor promotes endothelial cell tubulogenesis in poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels. Journal of biomaterials science. Polymer. 20, 1763-1779 (2009).
- Moon, J. J., Hahn, M. S., Kim, I., Nsiah, B. A., West, J. L. Micropatterning of poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels with biomolecules to regulate and guide endothelial morphogenesis. Tissue engineering. Part A. 15, 579-585 (2009).
- Hoyle, C. E., Bowman, C. N. Thiol-ene click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 49, 1540-1573 (2010).
- Hoyle, C. E., Lowe, A. B., Bowman, C. N. Thiol-click chemistry: a multifaceted toolbox for small molecule and polymer synthesis. Chemical Society reviews. 39, 1355-1387 (2010).
- Fairbanks, B. D., et al. A Versatile Synthetic Extracellular Matrix Mimic via Thiol-Norbornene Photopolymerization. Adv. Mater. 21, 5005 (2009).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30, 6702-6707 (2009).
- Zustiak, S. P., Leach, J. B. Characterization of protein release from hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogels. Biotechnology and bioengineering. 108, 197-206 (2011).
