产生和回收的β-细胞的细胞球体从逐步增长的PEG-肽水凝胶
Summary
下面的协议提供了用于封装在逐步增长的PEG-肽水凝胶形成的硫醇 – 烯照片点击反应胰腺β-细胞的技术。这种材料平台不仅提供了细胞相容性的微环境，细胞封装，但也允许用户控制的快速恢复细胞结构内形成的水凝胶。
Abstract
水凝胶是亲水性的交联的聚合物提供了一个三维的组织类似用于培养的治疗相关的细胞或组织的弹性和高渗透性的微环境。从聚（乙二醇）（PEG）衍生物制备的水凝胶被越来越多地用于各种组织工程应用，部分由于其可调和细胞相容性属性。在这个协议中，我们使用硫醇 – 烯逐步增长photopolymerizations的的制造PEG-肽水凝胶封装胰腺MIN6 B细胞。将凝胶形成了由4 – 臂的PEG – 降冰片烯（PEG4NB）大分子和胰凝乳蛋白酶敏感的肽的交联剂（CGGYC）。的亲水性和非污损性质PEG提供在3D中的细胞存活和增殖的细胞相容性的微环境，而使用糜蛋白酶敏感的肽序列（ÇGGY↓C，箭头表示酶切割位点，而终端囊肿加入EINE残留物硫醇 – 烯交联），可以迅速恢复细胞内形成水凝胶的结构。以下协议阐述技术：（1）在硫醇 – 烯水凝胶封装MIN6β细胞，（2）的定性和定量的细胞生存力分析，以确定细胞存活和增殖;（3）回收细胞球体使用胰凝乳蛋白酶介导的凝胶侵蚀;和（4）的结构和功能分析的回收球体。
Introduction
水凝胶是亲水性的交联的聚合物，作为用于修复和再生组织的脚手架材料具有超常的潜力。1-3的高水含量的水凝胶的允许的氧容易扩散和交换的营养物质和细胞代谢产物，所有这些都是维持细胞活力的关键。此外，水凝胶是控制释放和细胞外，由于其高可调性的优良载体。2合成水凝胶，如制备聚乙二醇（PEG）越来越多地应用于组织工程的应用，主要是由于其细胞相容性，组织状弹性，和高的可调谐性材料的物理和机械性能。4-6
尽管通常使用的水凝胶的平台，研究表明，聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）凝胶由链增长photopolymerizations形成有一种倾向，损坏封装细胞杜里纳克网络交联和原位细胞封装。7细胞损伤主要是由于产生的自由基光引发剂的分子，它通过乙烯基PEGDA传播到水凝胶的交联聚合物链。不幸的是，这些自由基物种也可能导致在细胞封装应力和细胞损伤，尤其是对自由基敏感的细胞，胰腺β-细胞，如8-10为了获得更高的网目尺寸的更好的扩散，和细胞的存活，较高分子量PEGDA常常被用于电池封装。然而，这损害聚合动力学和导致次优凝胶生物物理特性。7,11,12在除了上述缺点外，它是非常困难的源自PEGDA水凝胶由于恢复细胞结构的异质性和非降解性质交联网络。虽然可以掺入蛋白酶敏感的肽到的PEG大分子的骨干，呈现否则惰性的PEGDA水凝胶敏感的酶裂解，结合经常使用昂贵的试剂，并导致网络还含有高度的异质性，由于链增长聚合的性质。13-15
最近，通过逐步增长硫醇-烯光聚合形成的PEG-肽水凝胶已被证明具有超过由链增长光聚合水凝胶形成的细胞封装优惠属性7的硫醇-烯水凝胶的凝胶动力学优于被归因于“点击“自然的反应，巯基和烯的功能。相比链增长聚合PEGDA，硫醇-烯反应是较少的氧抑制16,17硫醇-烯水凝胶也有较高的聚合效率和更好的凝胶相比，链增长PEGDA水凝胶，7的生物物理性质的凝胶速度更快的结果。 18 </ SUP>，这将导致在有限的细胞造成损害的自由基物种在光聚合。
此前，硫醇-烯水凝胶形成由4臂PEG -降冰片烯（PEG4NB）大分子单体和双-含有半胱氨酸的肽的交联剂，如蛋白酶敏感的肽已被用于电池封装。7,18高可调性的PEG水凝胶网络提供灵活的和可控的三维微环境调查细胞的存活和活性，蛋白酶敏感的肽序列，而使用提供温和的方式进行恢复内自然形成的水凝胶的细胞结构。在这个协议中，我们利用逐步增长的光聚合的硫醇 – 烯水凝胶采用4 – 臂的PEG-降冰片烯（PEG4NB）和胰凝乳蛋白酶敏感的肽交联剂（CGGY↓C）用于封装MIN6β-细胞。此协议系统阐述研究MIN6存活，增殖和球体形成的技术在硫醇 – 烯水凝胶的β-细胞。我们还提供β-细胞的的球体恢复和回收的球体的生物学特性的方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
所描述的协议，详细介绍在逐步增长的光聚合形成的巯基烯水凝胶的细胞就容易封装。虽然硫醇官能团的降冰片烯的1:1的化学计量比使用在该协议中，其比例是可以根据实验调整。除了正确的配方，它是重要的是保持在预聚物溶液中的均匀性。特别是，使用温和的移液，以确保细胞以及分布在预聚物溶液中，以避免结块，在凝胶特性的细胞和变更。虽然用于凝胶交联聚合时间为2分钟，硫醇-烯的?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
该项目是由美国国立卫生研究院（R21EB013717）和IUPUI OVCR（RSFG）。作者感谢汉施女士，她的技术援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-arm PEG (20kDa) | Jenkem Technology USA | 4ARM-PEG-20K | |
| Fmoc-amino acids | Anaspec | ||
| Live/Dead cell viability kit | Invitrogen | L3224 | Includes Calcein AM and Ethidium homodimer-1 |
| AlamarBlue reagent | AbD Serotec | BUF012 | |
| CellTiter Glo reagent | Promega | G7570 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| HBSS | Lonza | 10547F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| High Glucose DMEM | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | |
| Trypsin-free α-chymotrypsin | Worthington Biochemical Corp | LS001432 | |
| Mouse Inusin ELISA kit | Mercodia | 10-1247-01 | |
| 1 ml disposable syringe | BD biosciences |
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