Создание и восстановление β-клетки сфероидов Из Шаг рост PEG-пептида Гидрогели
Summary
Протокол предусматривает следующие методы инкапсуляции панкреатических β-клеток на стадии роста PEG-пептида гидрогелей образована тиоловых-ен фото кнопкой мыши реакций. Этот материал платформа предлагает не только cytocompatible микроокружение для сотовых инкапсуляции, а также позволяет пользователю контролируемого быстрого восстановления клеточных структур, образующихся в гидрогелей.
Abstract
Гидрогели являются гидрофильными сшитые полимеры, которые обеспечивают трехмерное микроокружение с тканью, как эластичность и высокую проницаемость для культивирования терапевтически соответствующие клетки или ткани. Гидрогели получают из поли (этиленгликоль) (ПЭГ) производным все чаще используются для различных областей применения тканевой инженерии, в частности, в связи с их перестраиваемых и cytocompatible свойства. В этом протоколе, мы использовали тиоловых-ен шаг роста photopolymerizations для изготовления PEG-пептида гидрогелей для инкапсуляции панкреатических MIN6 В-клеток. Гели были сформированы 4-руки PEG-норборнен (PEG4NB) макромера и химотрипсин-чувствительных пептида сшивающего агента (CGGYC). Гидрофильные и не загрязнение природы PEG предлагает cytocompatible микроокружения за выживание и пролиферацию клеток в 3D, в то время как использование химотрипсин-чувствительных пептидной последовательности (C GGY ↓ C, стрелка указывает сайт расщепления ферментов, в то время как терминал кистаEine остатки были добавлены для тиоловых-ен сшивание) позволяет быстрое восстановление клеточных конструкций формирования в гидрогель. Следующий протокол разрабатывает методы: (1) Инкапсуляция MIN6 β-клеток в тиоловых-ен гидрогелей; (2) Качественный и количественный анализы жизнеспособность клеток, чтобы определить выживание и пролиферацию клеток; (3) восстановление клеточных сфероидов использовании химотрипсина-опосредованной гель эрозии, и (4) Структурно-функциональный анализ восстановленных сфероидов.
Introduction
Гидрогели являются гидрофильными сшитые полимеры с исключительным потенциалом леса материалы для ремонта и регенерации тканей. 1-3 высоким содержанием воды гидрогелей позволяет легко диффузии кислорода и обмен питательных веществ и клеточных продуктов метаболизма, которые имеют решающее значение для поддержания жизнеспособности клеток. Кроме того, гидрогели являются отличными носителями для контролируемого высвобождения и клеточной доставки из-за их высокой управляемость. 2 Синтетическая гидрогели, такие как изготовленные из поли (этиленгликоль) (ПЭГ) все чаще используются в приложениях тканевой инженерии, в основном из-за их cytocompatibility, ткани как эластичность и высокая управляемость в материалах физические и механические свойства. 4-6
Хотя обычно используется гидрогель платформы, исследования показали, что ПЭГ диакрилат (PEGDA) гидрогели образована цепочка роста photopolymerizations имеют тенденцию к повреждению инкапсулированные клетки Дуринг сшивания сети и на местах инкапсуляции клеток. 7 повреждение клеток была в значительной степени отнести к радикальным видов порожденных фотоинициатора молекул, которые распространяются через виниловых групп на PEGDA для сшивания полимерных цепей в гидрогелей. К сожалению, эти радикалы также вызывают стрессы и повреждение клеток в процессе клеточного инкапсуляции, особенно для радикально-чувствительные клетки поджелудочной железы, таких как β-клеток. 8-10 Для того, чтобы получить более высокий размер ячейки для лучшего распространения и выживания клеток, более высоким молекулярным весом PEGDA часто используется для сотового инкапсуляции. Это, однако, ставит под угрозу кинетики полимеризации и приводит к неоптимальным гель биофизических свойств. 7,11,12 В дополнение к выше недостатки, это очень трудно восстановить клеточные структуры от гидрогелей PEGDA в связи с неоднородностью и неразлагаемых природы сшитый сетей. В то время как протеазы, чувствительных к пептиды могут быть включеныв PEG макромера основой для визуализации в противном случае инертных PEGDA гидрогелей чувствительны к ферментативного расщепления, сопряжение часто использует дорогостоящих реагентов и в результате сетях по-прежнему содержат высокую степень неоднородности в связи с характером цепной полимеризацией. 13-15
Недавно PEG-пептида гидрогели образуются с помощью шаг за ростом тиоловых-ен фотополимеризации было показано, обладают свойствами льготных для сотовых инкапсуляция через гидрогелей образована цепочка роста фотополимеризации. 7 превосходную кинетику гелеобразования тиоловых-ен гидрогелей объясняется "нажмите "характер реакции между тиоловых и ен функций. По сравнению с цепным ростом полимеризации PEGDA, тиоловых-ен реакции меньше кислорода тормозится, что приводит к более быстрой скорости гелеобразования. 16,17 Thiol-ен гидрогели также имеют более высокую эффективность полимеризации и лучше гель биофизические свойства по сравнению с цепным ростом PEGDA гидрогелей, 7 , 18 </ SUP>, что приводит к ограниченной сотовой ущерб, причиненный радикалов во время фотополимеризации.
Ранее тиоловых-ен гидрогелей образована 4-руки PEG-норборнен (PEG4NB) макромера и бис-цистеин содержащих пептидов сшивающие агенты, такие как протеазы, чувствительных к пептиды были использованы для клеточной инкапсуляции. 7,18 Высокая управляемость сетей PEG гидрогель предлагает гибкой и управляемой 3D микросреду для исследования выживаемости клеток и активность, в то время как использование протеаз чувствительных к пептидной последовательности обеспечивает легкий путь для восстановления клеточных конструкций формируется, конечно, в гидрогелей. В этом протоколе мы используем шаг роста фотополимеризованных тиоловых-ен гидрогелей изготовлены с использованием 4-руки PEG-норборнен (PEG4NB) и химотрипсин-чувствительных пептида сшивающего агента (CGGY ↓ C) для инкапсуляции MIN6 β-клеток. Этот протокол систематически разрабатывает методы для изучения выживаемости, пролиферации и сфероида формирования MIN6β-клеток в тиоловых-ен гидрогелей. Мы также обеспечить метод для β-клетку сфероида восстановления и биологических характеристик восстановленных сфероидов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный протокол представляет подробную информацию о легкой инкапсуляции клеток в тиоловых-ен гидрогелей формируется за шагом роста фотополимеризации. В то время как стехиометрических соотношении 1:1 норборнена в тиоловые функциональные группы была использована в данном протокол?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект был профинансирован NIH (R21EB013717) и IUPUI OVCR (RSFG). Автор благодарит г-жа Хан Ши-ей технической помощи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-arm PEG (20kDa) | Jenkem Technology USA | 4ARM-PEG-20K | |
| Fmoc-amino acids | Anaspec | ||
| Live/Dead cell viability kit | Invitrogen | L3224 | Includes Calcein AM and Ethidium homodimer-1 |
| AlamarBlue reagent | AbD Serotec | BUF012 | |
| CellTiter Glo reagent | Promega | G7570 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| HBSS | Lonza | 10547F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| High Glucose DMEM | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | |
| Trypsin-free α-chymotrypsin | Worthington Biochemical Corp | LS001432 | |
| Mouse Inusin ELISA kit | Mercodia | 10-1247-01 | |
| 1 ml disposable syringe | BD biosciences |
References
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103, 655-663 (2009).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative medicine. Pharmaceutical research. 26, 631-643 (2009).
- Lin, C. C., Metters, A. T. Hydrogels in controlled release formulations: network design and mathematical modeling. Advanced drug delivery reviews. 58, 1379-1408 (2006).
- Khetan, S., Burdick, J. A. Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions. Soft Matter. 7, 830-838 (2011).
- Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Human neutrophil elastase responsive delivery from poly(ethylene glycol) hydrogels. Biomacromolecules. 10, 1484-1489 (2009).
- Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled beta-cell microenvironments. Acta biomaterialia. 2, 1-8 (2006).
- Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids. Biomaterials. 32, 9685-9695 (2011).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. Glucagon-like peptide-1 functionalized PEG hydrogels promote survival and function of encapsulated pancreatic beta-cells. Biomacromolecules. 10, 2460-2467 (2009).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. Cell-cell communication mimicry with poly(ethylene glycol) hydrogels for enhancing beta-cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6380-6385 (2011).
- Hui, H., Nourparvar, A., Zhao, X., Perfetti, R. Glucagon-like peptide-1 inhibits apoptosis of insulin-secreting cells via a cyclic 5′-adenosine monophosphate-dependent protein kinase A- and a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Endocrinology. 144, 1444-1445 (2003).
- Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function. Journal of biomedical materials research. Part A. 90, 720-729 (2009).
- Weber, L. M., Hayda, K. N., Haskins, K., Anseth, K. S. The effects of cell-matrix interactions on encapsulated beta-cell function within hydrogels functionalized with matrix-derived adhesive peptides. Biomaterials. 28, 3004-3011 (2007).
- Hsu, C. W., Olabisi, R. M., Olmsted-Davis, E. A., Davis, A. R., West, J. L. Cathepsin K-sensitive poly(ethylene glycol) hydrogels for degradation in response to bone resorption. Journal of biomedical materials research. Part A. 98, 53-62 (2011).
- Leslie-Barbick, J. E., Moon, J. J., West, J. L. Covalently-immobilized vascular endothelial growth factor promotes endothelial cell tubulogenesis in poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels. Journal of biomaterials science. Polymer. 20, 1763-1779 (2009).
- Moon, J. J., Hahn, M. S., Kim, I., Nsiah, B. A., West, J. L. Micropatterning of poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels with biomolecules to regulate and guide endothelial morphogenesis. Tissue engineering. Part A. 15, 579-585 (2009).
- Hoyle, C. E., Bowman, C. N. Thiol-ene click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 49, 1540-1573 (2010).
- Hoyle, C. E., Lowe, A. B., Bowman, C. N. Thiol-click chemistry: a multifaceted toolbox for small molecule and polymer synthesis. Chemical Society reviews. 39, 1355-1387 (2010).
- Fairbanks, B. D., et al. A Versatile Synthetic Extracellular Matrix Mimic via Thiol-Norbornene Photopolymerization. Adv. Mater. 21, 5005 (2009).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30, 6702-6707 (2009).
- Zustiak, S. P., Leach, J. B. Characterization of protein release from hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogels. Biotechnology and bioengineering. 108, 197-206 (2011).
