Adım büyüme PEG-peptid Hidrojeller kaynaktan β-hücre sferoidlerin Üretimi ve Kurtarma
Summary
Aşağıdaki protokol tiyol-ene fotoğrafı tıklama reaksiyonlar oluşturduğu adım büyüme PEG-peptid Hidrojellerde pankreatik β-hücreleri encapsulating için teknikler sağlar. Bu malzeme platformu hücre kapsülleme için cytocompatible mikroçevrede sunuyor, ama aynı zamanda hidrojellerin bünyesinde oluşturulan hücre yapılarının kullanıcı kontrollü hızlı iyileşme sağlar sadece.
Abstract
Hidrojeller kültürleme terapötik açıdan anlamlı hücreleri veya dokuları için esneklik ve yüksek düzeyde geçiş doku gibi olan bir üç-boyutlu, çapraz bağlı hidrofilik mikroçevrede sağlamak polimerlerdir. Poli (etilen glikol) (PEG) türevi kullanılarak hazırlanmıştır Hidrojeller giderek artan bir şekilde ayarlanabilir ve cytocompatible özellikleri nedeniyle kısmen, doku mühendisliği çeşitli uygulamalar için kullanılmaktadır. Bu protokol, pankreas MIN6 b-hücrelerinin kapsüllenmesinde PEG-peptid hidrojeller imal tiyol-ene adım büyüme photopolymerizations kullanılmıştır. Jeller 4 kollu PEG-norbornen (PEG4NB) makromer ve kimotripsin duyarlı peptid çaprazbaglayıcı (CGGYC) tarafından oluşturulmuştur. PEG hidrofilik olmayan kirlenme doğa, 3D hücre canlılığı ve çoğalma için cytocompatible mikroçevrede sunarken kimotripsin duyarlı peptid sekansı (kullanımı C GGY ↓ C, ok enzimi bölünme yeri gösterir iken terminali kisteine artıkları) tiol-ene çapraz bağlama için ilave edildi içinde hidrojel oluşturan hücre yapıları hızlı bir iyileşme sağlar. Aşağıdaki protokol için teknikler ayrıntılarına: tiyol-ene hidrojeller olarak MIN6 β-hücrelerinin (1) Kapsülleme, (2) nitel ve nicel hücre canlılığı deneyleri hücre hayatta kalma ve çoğalma belirlemek için, (3) hücre parçacıkları arasında Recovery kimotripsin-aracılı jel kullanılarak erozyon ve kurtarılan sferoidlerin (4) yapısal ve fonksiyonel analiz.
Introduction
Hidrojeller. Tamir ve rejenere dokular için iskele malzemesi olarak olağanüstü potansiyele sahip hidrofilik çapraz polimerlerdir hidrojellerin 1-3 su içeriği yüksek oksijen ve hücre canlılığı korumak için çok önemlidir her hangi besin ve hücresel metabolik ürünlerin, değişimi kolay difüzyon verir. Buna ek olarak, hidrojel kontrollü serbest bırakma ve yüksek tunability bağlı olarak hücre dağıtım için mükemmel taşıyıcılar. Örneğin poli (etilen glikol) (PEG) gibi hazırlanan 2 sentetik hidrojel artan bir şekilde büyük ölçüde onların cytocompatibility için, doku mühendisliği uygulamalarda kullanılır, doku malzemelerin fiziksel ve mekanik özellikleri gibi esneklik ve yüksek tunability. 4-6
Yaygın olarak kullanılan bir hidrojel platformu rağmen, çalışmalar zincir büyüme photopolymerizations oluşturduğu PEG diacrylate (PEGDA) hidrojellerin kapsüllü hücreleri Duri zarar eğilimi olduğunu göstermiştirng ağ çapraz ve yerinde hücre encapsulation. 7 hücresel hasarı büyük ölçüde hidrojeller içine kroslink polimer zincirleri PEGDA üzerine vinil gruplar aracılığıyla yaymak photoinitiator molekülleri tarafından oluşturulan radikal türleri bağlandı. Ne yazık ki, bu radikal türleri de özellikle pankreatik β-hücreleri gibi radikal duyarlı hücreler için, hücre kapsülleme sırasında stres ve hücre hasarına neden. 8-10 amacıyla daha iyi difüzyon ve hücre canlılığı, yüksek molekül ağırlıkları PEGDA için daha yüksek bir mesh boyutu elde etmek için genellikle hücreye yoğunlaştırmak için kullanılır. Bununla birlikte, bu polimerizasyon kinetiğini bozmakta ve sub-optimal jel biyo-fiziksel özelliklere yol açmaktadır. 7,11,12 yukarıda bahsedilen dezavantajlara ek olarak, bağlı bir heterojen ve non-parçalanabilir olmaları PEGDA hidrojeller elde edilen hücre yapıları geri kazanılması için çok zordur Çapraz bağlı ağ. Proteaz-duyarlı peptidler dahil edilebilirkenenzimatik yarılma duyarlı aksi asal PEGDA hidrojeller işlemek için PEG makromer omurga içine, konjugasyon genellikle pahalı reaktifler kullanır ve çıkan ağlar nedeniyle hala zincir polimerleşme doğası heterojenlik yüksek derecede içerir. 13-15
Son zamanlarda, adım-büyüme tiyol-ene fotopolimerizasyon yoluyla oluşmuş PEG-peptid hidrojeller zincir büyüme fotopolimerizasyon oluşan hidrojeller fazla hücre kapsülleme için tercihli özelliklerini gösterdikleri oylandı. Tiyol-ene hidrojellerin 7 üstün jelleşme kinetiği 'tık atfedilir tiyol ve ene işlevleri arasındaki reaksiyon 'doğası. PEGDA zincir-büyüme polimerizasyonu ile karşılaştırıldığında, tiyol-ene reaksiyonu olan hızlı jelleşme oranı ile sonuçlanır. Daha az oksijen 16,17 Tiyol-ene hidrojeller de yüksek polimerizasyon verimi ve zincir-büyüme PEGDA hidrojeller, 7 göre daha iyi jel biyofiziksel özelliklere sahip inhibe edilir , 18 </ Sup> hangi fotopolimerizasyon sırasında radikal türlerinin neden sınırlı hücresel hasar ile sonuçlanır.
Daha önce, tiyol-ene hidrojeller 4-kol, PEG-norbornen (PEG4NB) makromer ve bu gibi bis-sisteyin içeren peptit çapraz bağlayıcılar, oluşan proteaz-duyarlı peptidler hücre kapsülleme için kullanılmıştır. PEG hidrojel ağların 7,18 yüksek tunability bir sunmaktadır hücre canlılığı ve etkinliği araştırmak için esnek ve kontrol edilebilir 3D mikroçevrede, proteaz duyarlı peptid dizisi kullanımı hidrojeller içinde doğal olarak oluşan hücre yapıları kurtarma için hafif bir şekilde sağlıyor. Bu protokolü biz 4-kol PEG-norbornen (PEG4NB) ve MIN6 β-hücre kapsülleme için kimotripsin duyarlı peptid çaprazbaglayıcı (CGGY ↓ C) kullanarak fabrikasyon adım büyüme photopolymerized tiyol-ene hidrojeller kullanmaktadır. Bu protokol sistematik MIN6 hayatta kalma, proliferasyon ve sfero oluşumunu incelemek için teknikler ayrıntılandırdığıtiyol-ene Hidrojellerde β-hücreleri. Biz daha fazla β-hücre spheroid kurtarma ve iyileşti sferoidlerin biyolojik karakterizasyonu için bir yöntem sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Açıklanan protokol adım büyüme fotopolimerizasyon oluşturduğu tiyol-ene hidrojeller hücrelerin kolay kapsülleme ilgili ayrıntılar sunuyor. Tiol fonksiyonel grupların norbornen 1:1 bir stokiyometrik oran bu protokolde kullanılan iken, oran deneyler bağlı olarak ayarlanabilir. Doğru formülasyon ilave olarak, bu ön-polimer solüsyonu içinde homojenlik sağlamak için önemlidir. Özellikle, jel özellikleri hücre ve varyasyon topaklanma önlemek için çok hücre iyi ön polimer çözeltisi içinde dağ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu proje NIH (R21EB013717) ve IUPUI OVCR (RSFG) tarafından finanse edildi. Yazar, teknik yardım için Bayan Han Shih teşekkürler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-arm PEG (20kDa) | Jenkem Technology USA | 4ARM-PEG-20K | |
| Fmoc-amino acids | Anaspec | ||
| Live/Dead cell viability kit | Invitrogen | L3224 | Includes Calcein AM and Ethidium homodimer-1 |
| AlamarBlue reagent | AbD Serotec | BUF012 | |
| CellTiter Glo reagent | Promega | G7570 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| HBSS | Lonza | 10547F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| High Glucose DMEM | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | |
| Trypsin-free α-chymotrypsin | Worthington Biochemical Corp | LS001432 | |
| Mouse Inusin ELISA kit | Mercodia | 10-1247-01 | |
| 1 ml disposable syringe | BD biosciences |
References
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103, 655-663 (2009).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative medicine. Pharmaceutical research. 26, 631-643 (2009).
- Lin, C. C., Metters, A. T. Hydrogels in controlled release formulations: network design and mathematical modeling. Advanced drug delivery reviews. 58, 1379-1408 (2006).
- Khetan, S., Burdick, J. A. Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions. Soft Matter. 7, 830-838 (2011).
- Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Human neutrophil elastase responsive delivery from poly(ethylene glycol) hydrogels. Biomacromolecules. 10, 1484-1489 (2009).
- Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled beta-cell microenvironments. Acta biomaterialia. 2, 1-8 (2006).
- Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids. Biomaterials. 32, 9685-9695 (2011).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. Glucagon-like peptide-1 functionalized PEG hydrogels promote survival and function of encapsulated pancreatic beta-cells. Biomacromolecules. 10, 2460-2467 (2009).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. Cell-cell communication mimicry with poly(ethylene glycol) hydrogels for enhancing beta-cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6380-6385 (2011).
- Hui, H., Nourparvar, A., Zhao, X., Perfetti, R. Glucagon-like peptide-1 inhibits apoptosis of insulin-secreting cells via a cyclic 5′-adenosine monophosphate-dependent protein kinase A- and a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Endocrinology. 144, 1444-1445 (2003).
- Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function. Journal of biomedical materials research. Part A. 90, 720-729 (2009).
- Weber, L. M., Hayda, K. N., Haskins, K., Anseth, K. S. The effects of cell-matrix interactions on encapsulated beta-cell function within hydrogels functionalized with matrix-derived adhesive peptides. Biomaterials. 28, 3004-3011 (2007).
- Hsu, C. W., Olabisi, R. M., Olmsted-Davis, E. A., Davis, A. R., West, J. L. Cathepsin K-sensitive poly(ethylene glycol) hydrogels for degradation in response to bone resorption. Journal of biomedical materials research. Part A. 98, 53-62 (2011).
- Leslie-Barbick, J. E., Moon, J. J., West, J. L. Covalently-immobilized vascular endothelial growth factor promotes endothelial cell tubulogenesis in poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels. Journal of biomaterials science. Polymer. 20, 1763-1779 (2009).
- Moon, J. J., Hahn, M. S., Kim, I., Nsiah, B. A., West, J. L. Micropatterning of poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels with biomolecules to regulate and guide endothelial morphogenesis. Tissue engineering. Part A. 15, 579-585 (2009).
- Hoyle, C. E., Bowman, C. N. Thiol-ene click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 49, 1540-1573 (2010).
- Hoyle, C. E., Lowe, A. B., Bowman, C. N. Thiol-click chemistry: a multifaceted toolbox for small molecule and polymer synthesis. Chemical Society reviews. 39, 1355-1387 (2010).
- Fairbanks, B. D., et al. A Versatile Synthetic Extracellular Matrix Mimic via Thiol-Norbornene Photopolymerization. Adv. Mater. 21, 5005 (2009).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30, 6702-6707 (2009).
- Zustiak, S. P., Leach, J. B. Characterization of protein release from hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogels. Biotechnology and bioengineering. 108, 197-206 (2011).
