Génération et récupération des cellules β-Sphéroïdes partir de l'étape de croissance peptidiques hydrogels de PEG-
Summary
Le protocole suivant fournit des techniques d'encapsulation du pancréas β-cellules à l'étape de croissance PEG-peptide hydrogels formés par thiol-ène photo-cliquez réactions. Cette plate-forme matérielle offre non seulement un micro-cytocompatible pour l'encapsulation de cellules, mais permet également contrôlé par l'utilisateur récupération rapide des structures cellulaires formés dans les hydrogels.
Abstract
Hydrogels sont les polymères réticulés hydrophiles qui fournissent un micro-environnement en trois dimensions avec des tissus en forme de l'élasticité et de perméabilité élevée pour la culture de cellules ou de tissus thérapeutiquement pertinents. Les hydrogels préparés à partir de poly (éthylène glycol) (PEG) sont dérivés de plus en plus utilisé pour une variété d'applications d'ingénierie tissulaire, en partie en raison de leurs propriétés accordables et cytocompatible. Dans ce protocole, nous avons utilisé thiol-ène-étape de croissance photopolymérisations pour fabriquer des hydrogels de PEG-peptide pour l'encapsulation du pancréas min6 cellules B. Les gels ont été formés par 4-bras PEG-norbornène (PEG4NB) macromère et un agent de réticulation peptide chymotrypsine-sensible (CGGYC). Le caractère hydrophile et non encrassement du PEG offre un microenvironnement cytocompatible pour la survie et la prolifération cellulaire en 3D, tandis que l'utilisation de la séquence peptidique chymotrypsine-sensible (C GGY ↓ C, flèche indique le site de clivage enzymatique, kyste terminal pendanteine résidus ont été ajoutés pour thiol-ène réticulation) permet la récupération rapide des constructions cellulaires formant au sein de l'hydrogel. Le protocole suivant développe des techniques pour: (1) L'encapsulation des cellules β min6 de thiol-ène hydrogels, (2) qualitatifs et quantitatifs des tests de viabilité cellulaire pour déterminer la survie et la prolifération cellulaire; (3) Recouvrement de sphéroïdes de cellules utilisant la chymotrypsine médiation gel l'érosion, et (4) l'analyse structurale et fonctionnelle des sphéroïdes récupérés.
Introduction
Les hydrogels sont des polymères hydrophiles réticulés avec un potentiel exceptionnel en tant que matériaux d'échafaudage pour la réparation et la régénération des tissus. 1-3 La forte teneur en eau des hydrogels permet une diffusion facile d'oxygène et d'échange de nutriments et de produits cellulaires métaboliques, qui sont tous essentiels au maintien de la viabilité cellulaire. En outre, les hydrogels sont porteurs d'excellents pour la libération contrôlée de cellules et la livraison en raison de leur grande accordabilité. 2 hydrogels synthétiques tels que ceux préparés à partir de poly (éthylène glycol) (PEG) sont de plus en plus utilisés dans les applications d'ingénierie tissulaire, en grande partie en raison de leur cytocompatibilité, tissus comme l'élasticité, et l'accordabilité élevé en matière des propriétés physiques et mécaniques 4-6.
Même si une plate-forme d'hydrogel couramment utilisés, des études ont montré que le PEG diacrylate (PEGDA) hydrogels formés par la chaîne de croissance photopolymérisations ont tendance à endommager les cellules encapsulées Duriréticulation du réseau ng et dans l'encapsulation cellulaire in situ. 7 Le dommage cellulaire a été largement attribuable à des espèces radicalaires générées par les molécules photo-initiateurs, qui se propagent à travers les groupes vinyle sur PEGDA de réticulation des chaînes de polymères dans des hydrogels. Malheureusement, ces espèces radicalaires également provoquer des contraintes et des dommages cellulaires au cours de l'encapsulation de cellules, en particulier pour les cellules sensibles radical tel que β-cellules pancréatiques. 8-10 Afin d'obtenir une plus grande taille de maille pour une meilleure diffusion et la survie des cellules, des poids moléculaires supérieurs PEGDA sont souvent utilisés pour l'encapsulation cellulaire. Ceci, cependant, compromet cinétique de polymérisation et provoque propriétés de gel sous-optimales biophysiques. 7,11,12 En plus des inconvénients mentionnés ci-dessus, il est très difficile de récupérer les structures cellulaires à partir d'hydrogels PEGDA raison de la nature hétérogène et non-dégradable les réseaux réticulés. Alors que la protéase sensibles peptides peuvent être incorporésdans macromère PEG squelette de rendre inertes les hydrogels autrement PEGDA sensibles à un clivage enzymatique, la conjugaison utilise souvent des réactifs coûteux et les réseaux résultants contiennent encore des haut degré d'hétérogénéité due à la nature de la chaîne de croissance de polymérisation. 13-15
Récemment, le PEG-peptide hydrogels formés par l'étape de croissance de thiol-ène photopolymérisation a été démontré que présentent des propriétés préférentiels pour l'encapsulation de cellules plus hydrogels formés par la chaîne de croissance de photopolymérisation. 7 Les cinétiques de gélification supérieures de thiol-ène hydrogels est attribué au clic » «la nature de la réaction entre un thiol et fonctionnalités ène. Par rapport à la croissance de la chaîne de polymérisation de PEGDA, thiol-ène réaction est inhibée moins d'oxygène qui en résulte rythme plus rapide gélification. 16,17 thiol-ène hydrogels ont aussi une plus grande efficacité de polymérisation et les propriétés biophysiques de meilleures gel par rapport à la chaîne de croissance PEGDA hydrogels, 7 , 18 </ Sup> qui se traduit par des dommages cellulaires causés par les espèces peu radicales au cours de photopolymérisation.
Auparavant, thiol-ène hydrogels formés par 4-bras PEG-norbornène (PEG4NB) macromère et bis-cystéine peptidiques contenant des agents de réticulation, tels que les protéases sensibles peptides ont été utilisés pour l'encapsulation cellulaire. 7,18 accordabilité haut de réseaux d'hydrogel de PEG offre une flexible et contrôlable microenvironnement 3D pour étudier la survie cellulaire et l'activité, tandis que l'utilisation de la protéase sensible séquence peptidique fournit un moyen doux pour la récupération des constructions cellulaires formés naturellement au sein des hydrogels. Dans ce protocole, nous utilisons l'étape de croissance photopolymérisée thiol-ène hydrogels fabriqués en utilisant 4-bras PEG-norbornène (PEG4NB) et un agent de réticulation sensible à la chymotrypsine peptide (CGGY ↓ C) pour l'encapsulation de cellules β min6. Ce protocole élabore systématiquement des techniques pour étudier la formation de survie, la prolifération et l'ellipsoïde de min6β-cellules dans thiol-ène hydrogels. Nous avons en outre fournir une méthode pour β-cellule de récupération sphéroïde et la caractérisation biologique des sphéroïdes récupérés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit présente des détails sur l'encapsulation de cellules dans facile thiol-ène hydrogels formés par l'étape de croissance de photopolymérisation. Alors qu'un rapport stoechiométrique de 1:1 de norbornène à fonctions thiols a été utilisé dans ce protocole, le ratio peut être ajusté en fonction des expériences. En plus d'une formulation correcte, il est important de maintenir l'homogénéité de la solution de pré-polymère. En particulier, utiliser un léger pipetage p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce projet a été financé par le NIH (R21EB013717) et IUPUI TRCVPB (RSFG). L'auteur remercie Mme Han Shih pour son assistance technique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-arm PEG (20kDa) | Jenkem Technology USA | 4ARM-PEG-20K | |
| Fmoc-amino acids | Anaspec | ||
| Live/Dead cell viability kit | Invitrogen | L3224 | Includes Calcein AM and Ethidium homodimer-1 |
| AlamarBlue reagent | AbD Serotec | BUF012 | |
| CellTiter Glo reagent | Promega | G7570 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| HBSS | Lonza | 10547F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| High Glucose DMEM | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | |
| Trypsin-free α-chymotrypsin | Worthington Biochemical Corp | LS001432 | |
| Mouse Inusin ELISA kit | Mercodia | 10-1247-01 | |
| 1 ml disposable syringe | BD biosciences |
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