Generatie en terugwinning van β-cel sferoïden Van Step-groei PEG-peptide Hydrogelen
Summary
Het volgende protocol biedt technieken voor het inkapselen van pancreatische β-cellen in stap-groei PEG-peptide hydrogels gevormd door thiol-een foto-click reacties. Dit materiaal platform niet alleen een cytocompatible micro voor cel inkapseling, maar maakt ook de gebruiker gecontroleerde snelle herstel van celstructuren gevormd binnen de hydrogels.
Abstract
Hydrogelen hydrofiele verknoopte polymeren die een driedimensionale micro met weefsel-achtige elasticiteit en hoge permeabiliteit voor het kweken van therapeutisch relevante cellen of weefsels te verschaffen. Hydrogelen bereid uit poly (ethyleenglycol) (PEG) derivaten worden steeds meer gebruikt voor een verscheidenheid van tissue engineering toepassingen, mede dankzij hun afstembare en cytocompatible eigenschappen. In dit protocol, gebruikten we thiol-stap-groei photopolymerizations aan PEG-peptide hydrogels fabriceren voor het inkapselen pancreas MIN6 b-cellen. De gels werden gevormd door 4-arm PEG-norborneen (PEG4NB) macromeer en een chymotrypsine-gevoelige peptide crosslinker (CGGYC). De hydrofiele en aangroeiloze aard van PEG biedt cytocompatible micromilieu voor celoverleving en proliferatie in 3D, terwijl het gebruik van chymotrypsine-gevoelige peptidesequentie (C GGY ↓ C, pijl enzym klievingsplaats, terwijl klem cysteeine residuen werden toegevoegd voor thiol-crosslinking) maakt snel herstel van celpreparaten vormt binnen de hydrogel. De volgende protocol uitgewerkt technieken: (1) inkapseling van MIN6 β-cellen in thiol-hydrogels, (2) Kwalitatieve en kwantitatieve cellevensvatbaarheidsassays bepalen celoverleving en proliferatie (3) Herstel van cel Steroiden met chymotrypsine-gemedieerde gel erosie, en (4) Structurele en functionele analyse van de gerecupereerde sferoïden.
Introduction
Hydrogelen hydrofiele verknoopte polymeren uitzonderlijk potentieel steigers materialen voor reparatie en regenererende weefsels. 1-3 De hoge watergehalte van hydrogels maakt eenvoudige diffusie van zuurstof en uitwisseling van voedingsstoffen en cellulaire metabole producten, die cruciaal zijn voor handhaving van cellevensvatbaarheid. Bovendien hydrogelen uitstekende dragers voor gecontroleerde afgifte en cel productietijd wegens hun hoge tunability. Twee synthetische hydrogels zoals die bereid uit poly (ethyleenglycol) (PEG) worden steeds meer gebruikt in tissue engineering toepassingen, voornamelijk vanwege hun cytocompatibility, weefsel- zoals elasticiteit en hoge tunability in materiaal fysische en mechanische eigenschappen. 4-6
Hoewel een veelgebruikte hydrogel-platform, hebben studies aangetoond dat PEG-diacrylaat (PEGDA) hydrogelen gevormd door ketting-groei photopolymerizations de neiging tot schade ingekapseld cellen Duri hebbenng netwerk en verknoping in situ cel inkapseling. 7 De celschade werd grotendeels toegeschreven aan radicalen gegenereerd door de foto-initiator moleculen, die door de vinylgroepen aan PEGDA propageren verknopen polymeerketens in hydrogels. Helaas zijn deze radicalen veroorzaken ook stress en cellulaire beschadiging tijdens cel inkapseling, vooral voor radicaal-gevoelige cellen zoals pancreatische β-cellen. 8-10 Om een hogere maaswijdte verkrijgen betere verspreiding en celoverleving, hogere molecuulgewichten PEGDA worden vaak gebruikt voor cel inkapseling. Dit is echter afbreuk polymerisatiekinetiek en veroorzaakt suboptimale gel biofysische eigenschappen. 7,11,12 Naast de bovengenoemde nadelen, is het zeer moeilijk om celstructuren herstellen van PEGDA hydrogels door de heterogeniteit en niet-afbreekbare aard de verknoopte netwerken. Terwijl protease-gevoelige peptiden kunnen worden opgenomenPEG macromeer in de ruggengraat anders inert PEGDA hydrogels gevoelig voor enzymatische splitsing maken, de conjugatie gebruikt vaak dure reagentia en de resulterende netwerken bevatten nog aanzienlijke heterogeniteit vanwege de aard van ketting-groei polymerisatie. 13-15
Onlangs hebben PEG-peptide hydrogelen gevormd via stap-groei thiol-fotopolymerisatie aangetoond preferentiële eigenschappen voor cel inkapseling vertonen dan hydrogels gevormd door chain groei fotopolymerisatie. 7 De superieure gelering kinetiek van thiol-hydrogels wordt toegeschreven aan de 'click 'aard van de reactie tussen thiol en buteen functionaliteiten. In vergelijking met ketting-groei polymerisatie van PEGDA, thiol-reactie is minder zuurstof geremd wat resulteert in een snellere gelering tarief. 16,17 thiol-hydrogels ook hogere polymerisatie efficiëntie en een betere gel biofysische eigenschappen in vergelijking met ketting-groei PEGDA hydrogels, 7 hebben , 18 </ Sup> wat resulteert in beperkte cellulaire schade veroorzaakt door radicalen tijdens fotopolymerisatie.
Voorheen thiol-hydrogelen gevormd door 4-arm PEG-norborneen (PEG4NB) macromeer en bis-cysteine bevattende peptide crosslinkers, zoals protease-gevoelige peptiden zijn gebruikt voor cel inkapseling. 7,18 High tunability van PEG hydrogel netwerken biedt flexibel en controleerbaar 3D micro-omgeving voor onderzoek celoverleving en activiteit, terwijl het gebruik van protease-gevoelige peptide sequentie is een mild middel voor het terugwinnen van celpreparaten natuurlijk gevormd in hydrogels. In dit protocol gebruiken we stap-groei photopolymerized thiol-hydrogelen gefabriceerd met 4-arm PEG-norborneen (PEG4NB) en een chymotrypsine-gevoelige peptide crosslinker (CGGY ↓ C) voor het inkapselen van MIN6 β-cellen. Dit protocol uitgewerkt systematisch technieken voor het bestuderen van de overleving, proliferatie en bolvormige formatie van MIN6β-cellen in thiol-hydrogels. We Verder dient werkwijze voor β-cel sferoïde herstel en biologische karakterisering van teruggewonnen sferoïden.
Protocol
Representative Results
Discussion
De beschreven protocol bevat details over eenvoudige inkapseling van cellen in thiol-hydrogelen gevormd door stap-groei fotopolymerisatie. Terwijl een stoichiometrische verhouding van 1:1 van norborneen met thiol functionele groepen werd in dit protocol kan de verhouding worden aangepast afhankelijk van de experimenten. Naast een juiste formulering is belangrijk om homogeniteit in de pre-polymeeroplossing. Met name het gebruik zacht pipetteren opdat cellen zijn goed verdeeld in de pre-polymeeroplossing om klonteren voor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit project werd gefinancierd door NIH (R21EB013717) en IUPUI OVCR (RSFG). De auteur dankt mevrouw Han Shih voor haar technische bijstand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-arm PEG (20kDa) | Jenkem Technology USA | 4ARM-PEG-20K | |
| Fmoc-amino acids | Anaspec | ||
| Live/Dead cell viability kit | Invitrogen | L3224 | Includes Calcein AM and Ethidium homodimer-1 |
| AlamarBlue reagent | AbD Serotec | BUF012 | |
| CellTiter Glo reagent | Promega | G7570 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| HBSS | Lonza | 10547F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| High Glucose DMEM | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | |
| Trypsin-free α-chymotrypsin | Worthington Biochemical Corp | LS001432 | |
| Mouse Inusin ELISA kit | Mercodia | 10-1247-01 | |
| 1 ml disposable syringe | BD biosciences |
References
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103, 655-663 (2009).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative medicine. Pharmaceutical research. 26, 631-643 (2009).
- Lin, C. C., Metters, A. T. Hydrogels in controlled release formulations: network design and mathematical modeling. Advanced drug delivery reviews. 58, 1379-1408 (2006).
- Khetan, S., Burdick, J. A. Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions. Soft Matter. 7, 830-838 (2011).
- Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Human neutrophil elastase responsive delivery from poly(ethylene glycol) hydrogels. Biomacromolecules. 10, 1484-1489 (2009).
- Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled beta-cell microenvironments. Acta biomaterialia. 2, 1-8 (2006).
- Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids. Biomaterials. 32, 9685-9695 (2011).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. Glucagon-like peptide-1 functionalized PEG hydrogels promote survival and function of encapsulated pancreatic beta-cells. Biomacromolecules. 10, 2460-2467 (2009).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. Cell-cell communication mimicry with poly(ethylene glycol) hydrogels for enhancing beta-cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6380-6385 (2011).
- Hui, H., Nourparvar, A., Zhao, X., Perfetti, R. Glucagon-like peptide-1 inhibits apoptosis of insulin-secreting cells via a cyclic 5′-adenosine monophosphate-dependent protein kinase A- and a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Endocrinology. 144, 1444-1445 (2003).
- Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function. Journal of biomedical materials research. Part A. 90, 720-729 (2009).
- Weber, L. M., Hayda, K. N., Haskins, K., Anseth, K. S. The effects of cell-matrix interactions on encapsulated beta-cell function within hydrogels functionalized with matrix-derived adhesive peptides. Biomaterials. 28, 3004-3011 (2007).
- Hsu, C. W., Olabisi, R. M., Olmsted-Davis, E. A., Davis, A. R., West, J. L. Cathepsin K-sensitive poly(ethylene glycol) hydrogels for degradation in response to bone resorption. Journal of biomedical materials research. Part A. 98, 53-62 (2011).
- Leslie-Barbick, J. E., Moon, J. J., West, J. L. Covalently-immobilized vascular endothelial growth factor promotes endothelial cell tubulogenesis in poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels. Journal of biomaterials science. Polymer. 20, 1763-1779 (2009).
- Moon, J. J., Hahn, M. S., Kim, I., Nsiah, B. A., West, J. L. Micropatterning of poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels with biomolecules to regulate and guide endothelial morphogenesis. Tissue engineering. Part A. 15, 579-585 (2009).
- Hoyle, C. E., Bowman, C. N. Thiol-ene click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 49, 1540-1573 (2010).
- Hoyle, C. E., Lowe, A. B., Bowman, C. N. Thiol-click chemistry: a multifaceted toolbox for small molecule and polymer synthesis. Chemical Society reviews. 39, 1355-1387 (2010).
- Fairbanks, B. D., et al. A Versatile Synthetic Extracellular Matrix Mimic via Thiol-Norbornene Photopolymerization. Adv. Mater. 21, 5005 (2009).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30, 6702-6707 (2009).
- Zustiak, S. P., Leach, J. B. Characterization of protein release from hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogels. Biotechnology and bioengineering. 108, 197-206 (2011).
