ステップ成長PEG-ペプチドハイドロゲルからβ細胞のスフェロイドの発生と復旧
Summary
次のプロトコルは、チオール – エン写真クリック反応により形成された段階成長PEG-ペプチドハイドロゲルで、膵β細胞をカプセル化するための技術を提供する。この材料プラットフォームは、細胞のカプセル化のためのcytocompatible微小環境を提供していますが、また、ヒドロゲル内に形成されたセル構造のユーザ制御の迅速な復旧を可能にするだけでなく。
Abstract
ヒドロゲルは、培養治療に関連する細胞または組織のための組織のような弾力性と高透磁率を有する三次元微小環境を提供する親水性架橋ポリマーである。ポリ（エチレングリコール）（PEG）誘導体から調製されたヒドロゲルはますます彼らの同調可能とcytocompatible特性に起因して部分的には、組織工学の様々なアプリケーションに使用されています。このプロトコルでは、B細胞、膵臓MIN6をカプセル化するためにPEG-ペプチドハイドロゲルを作製するために、チオール – エン段階的成長photopolymerizationsを利用した。ゲルは4アームPEG – ノルボルネン（PEG4NB）マクロマー及びキモトリプシン敏感なペプチド架橋剤（CGGYC）によって形成された。 PEGの親水性及び非汚染性の性質は、3Dで細胞の生存と増殖のためcytocompatible微小環境を提供しながら、キモトリプシン感受性のペプチド配列（の使用C GGY↓C、矢印は酵素切断部位を示している一方、端末の嚢胞アイネ残基）はチオール – エン架橋のために追加されたハイドロゲル内に形成細胞構成物の迅速な復旧を可能にします。以下のプロトコルがためのテクニックを詳しく説明します：チオール – エンヒドロゲルでMIN6β細胞の（1）カプセル化、（2）定性的および定量的な細胞生存率アッセイ細胞の生存と増殖を決定するために、（3）細胞スフェロイドの回復は、キモトリプシン媒介ゲルを用い浸食、そして回収されたスフェロイドの（4）の構造と機能の解析。
Introduction
ヒドロゲルは修復および再生組織のための足場材料として非常に優れたポテンシャルを有する親水性架橋ポリマーである。1月3日ヒドロゲルの高含水の栄養素と細胞代謝産物の酸素と交換の容易な拡散を可能にし、これらの全てが細胞の生存を維持するために重要です。また、ヒドロゲルは、彼らのcytocompatibilityが主因、ポリ（エチレングリコール）（PEG）から調製したものとして2合成ヒドロゲルはますます組織工学用途で使用されている。放出制御とその高い同調性による細胞送達のための優れたキャリアである組織のような弾力性、材料の物理的および機械的性質の高い同調性4-6
一般的に使用されるハイドロゲル·プラットフォームが、研究では、連鎖成長photopolymerizationsによって形成されたPEGアクリレート（PEGDA）ヒドロゲルは、カプセル化された細胞をドゥーリを損傷する傾向があることが示されているngのネットワーク架橋および in situ細胞カプセルインチ 7細胞の損傷は、主にヒドロゲルに架橋ポリマー鎖にPEGDA上のビニル基を介して伝播する光開始剤分子によって生成されたラジカル種に起因するものであった。残念ながら、これらのラジカル種は、特にそのような膵β細胞などのラジカル感受性細胞では、細胞のカプセル化中にストレスや細胞の損傷を引き起こす。8-10良く拡散し、細胞生存のためのより高いメッシュサイズを得るためには、より高い分子量はPEGDA多くの場合、細胞のカプセル化に使用されます。しかし、これは、重合速度を損なうと次善ゲル生物物理学的特性を引き起こします。7,11,12は、上記の欠点に加えて、それが原因の異質性と非分解性の性質にPEGDAハイドロゲルからの細胞構造を回復するのは非常に困難である架橋ネットワーク。プロテアーゼ感受性ペプチドを配合することができますが酵素による切断に感受性がそうでなければ不活性PEGDAヒドロゲルをレンダリングするために、PEGマクロマーバックボーンに、結合はしばしば高価な試薬を使用し、結果としてネットワークの中には、依然として、連鎖成長重合の性質による不均質性の高い学位を含む。13-15
最近では、段階成長チオール-エン光重合を介して形成されたPEG-ペプチドハイドロゲルは、連鎖成長重合によって形成されたハイドロゲルを介して細胞のカプセル化のための優先的な性質を示すことが示されている。チオール-エンヒドロゲルの7優れたゲル化動態は"クリックに起因している'チオールとエンの機能との間の反応の性質。 PEGDAの連鎖成長重合に比べて、チオール-エン反応は、より速くゲル化速度が得られる。少ない酸素が16,17チオール-エンヒドロゲルはまた、より高い重合効率と連鎖成長PEGDAヒドロゲル、7と比較してより良いジェル生物物理学的特性を有する阻害される、18 </ sup>の光重合中にラジカル種による限られた細胞の損傷をもたらす。
ペプチド架橋剤を含む4アームPEG -ノルボルネン（PEG4NB）マクロマー及びビス-システインにより形成された以前に、チオール-エンヒドロゲル、プロテアーゼ感受性ペプチドは細胞のカプセル化に利用されているような。のPEGヒドロゲルネットワークの7,18ハイ同調性が提供細胞の生存と活動を調査するための柔軟かつ制御可能な3次元微小環境、プロテアーゼ感受性ペプチド配列の使用はヒドロゲル内で自然に形成された細胞構成体の回復のための穏やかな方法を提供している。このプロトコルでは、4アームPEG-ノルボルネン（PEG4NB）とMIN6β細胞のカプセル化のためのキモトリプシン敏感なペプチド架橋剤（CGGY↓C）を用いて製作段階成長光重チオール – エンハイドロゲルを利用しています。このプロトコルは、体系的にMIN6の生存、増殖およびスフェロイド形成を研究するためのテクニックを詳しく説明チオール – エンヒドロゲルでβ細胞。今後は、β細胞のスフェロイド回収し、回収スフェロイドの生物学的特性評価するための方法を提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
説明されたプロトコルはステップ成長重合によって形成されたチオール – エンハイドロゲル中の細胞の容易なカプセル化の詳細を提示します。チオール官能基ノルボルネンの1:1の化学量論比は、このプロトコルで使用されていたものの、比率は、実験に応じて調整することができる。正しい処方に加えて、それはプレポリマー溶液中で均一性を維持することが重要です。具体的には、細胞が?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトは、NIH（R21EB013717）とIUPUI OVCR（RSFG）によって賄われていた。著者は彼女の技術支援のためにハンさんのShihに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-arm PEG (20kDa) | Jenkem Technology USA | 4ARM-PEG-20K | |
| Fmoc-amino acids | Anaspec | ||
| Live/Dead cell viability kit | Invitrogen | L3224 | Includes Calcein AM and Ethidium homodimer-1 |
| AlamarBlue reagent | AbD Serotec | BUF012 | |
| CellTiter Glo reagent | Promega | G7570 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| HBSS | Lonza | 10547F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| High Glucose DMEM | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | |
| Trypsin-free α-chymotrypsin | Worthington Biochemical Corp | LS001432 | |
| Mouse Inusin ELISA kit | Mercodia | 10-1247-01 | |
| 1 ml disposable syringe | BD biosciences |
References
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103, 655-663 (2009).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative medicine. Pharmaceutical research. 26, 631-643 (2009).
- Lin, C. C., Metters, A. T. Hydrogels in controlled release formulations: network design and mathematical modeling. Advanced drug delivery reviews. 58, 1379-1408 (2006).
- Khetan, S., Burdick, J. A. Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions. Soft Matter. 7, 830-838 (2011).
- Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Human neutrophil elastase responsive delivery from poly(ethylene glycol) hydrogels. Biomacromolecules. 10, 1484-1489 (2009).
- Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled beta-cell microenvironments. Acta biomaterialia. 2, 1-8 (2006).
- Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids. Biomaterials. 32, 9685-9695 (2011).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. Glucagon-like peptide-1 functionalized PEG hydrogels promote survival and function of encapsulated pancreatic beta-cells. Biomacromolecules. 10, 2460-2467 (2009).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. Cell-cell communication mimicry with poly(ethylene glycol) hydrogels for enhancing beta-cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6380-6385 (2011).
- Hui, H., Nourparvar, A., Zhao, X., Perfetti, R. Glucagon-like peptide-1 inhibits apoptosis of insulin-secreting cells via a cyclic 5′-adenosine monophosphate-dependent protein kinase A- and a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Endocrinology. 144, 1444-1445 (2003).
- Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function. Journal of biomedical materials research. Part A. 90, 720-729 (2009).
- Weber, L. M., Hayda, K. N., Haskins, K., Anseth, K. S. The effects of cell-matrix interactions on encapsulated beta-cell function within hydrogels functionalized with matrix-derived adhesive peptides. Biomaterials. 28, 3004-3011 (2007).
- Hsu, C. W., Olabisi, R. M., Olmsted-Davis, E. A., Davis, A. R., West, J. L. Cathepsin K-sensitive poly(ethylene glycol) hydrogels for degradation in response to bone resorption. Journal of biomedical materials research. Part A. 98, 53-62 (2011).
- Leslie-Barbick, J. E., Moon, J. J., West, J. L. Covalently-immobilized vascular endothelial growth factor promotes endothelial cell tubulogenesis in poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels. Journal of biomaterials science. Polymer. 20, 1763-1779 (2009).
- Moon, J. J., Hahn, M. S., Kim, I., Nsiah, B. A., West, J. L. Micropatterning of poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels with biomolecules to regulate and guide endothelial morphogenesis. Tissue engineering. Part A. 15, 579-585 (2009).
- Hoyle, C. E., Bowman, C. N. Thiol-ene click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 49, 1540-1573 (2010).
- Hoyle, C. E., Lowe, A. B., Bowman, C. N. Thiol-click chemistry: a multifaceted toolbox for small molecule and polymer synthesis. Chemical Society reviews. 39, 1355-1387 (2010).
- Fairbanks, B. D., et al. A Versatile Synthetic Extracellular Matrix Mimic via Thiol-Norbornene Photopolymerization. Adv. Mater. 21, 5005 (2009).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30, 6702-6707 (2009).
- Zustiak, S. P., Leach, J. B. Characterization of protein release from hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogels. Biotechnology and bioengineering. 108, 197-206 (2011).
