Imagerie en direct de la nicotine induit la signalisation du calcium et de la libération de neurotransmetteurs long ventrales hippocampe axones

Summary

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal – accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

Abstract

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)–accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

Introduction

Modulation cholinergique du circuit excitabilité contribue à des aspects fondamentaux de la cognition, et la modulation cholinergique modifié est une caractéristique de neurodégénératives et neuropsychiatriques troubles y compris la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la schizophrénie et la toxicomanie ^1-4. Un mécanisme établi de la facilitation de la transmission synaptique cholinergique dans le SNC est via l'activation directe de nAChRs localisées sur des sites pré-synaptiques. L'activation de ces récepteurs pré-synaptiques entraîne une augmentation de Ca ²⁺ intracellulaire ([Ca2 ^+] _i) dans les terminaux présynaptiques – à la fois directement, en raison de la conductance de calcium relativement élevé de certains sous-types de nAChR, et indirectement, par l'intermédiaire de cascades de signalisation intracellulaires ^5, améliorant ainsi la libération de neurotransmetteurs. En effet, l'activation des nAChR pré-synaptiques a été liée à des changements dans la libération d'une grande variété de neurotransmetteurs, y compris le glutamate, GABA, acétylcholine, une dopamine ^6-10. Bien que ce processus a été étudié indirectement en utilisant des méthodes électrophysiologiques à divers synapses, les journalistes optiques de [Ca ^2+] _i et vésicule synaptique recyclage permettent de mesurer plus directe et temporellement précise des phénomènes pré-synaptiques.

Localisation pré-synaptique de nAChR a été démontré de façon convaincante direct étiquetage immuno-or de nAChRs au microscope électronique (EM) de niveau ^11,12. Plusieurs autres techniques ont également été utilisés pour traiter la localisation nAChR indirectement, y compris la détection de l'emplacement des chimères protéiques fluorescents de nAChR dans des neurones en culture ^13,14, enregistrement électrophysiologique des courants nAChR dans les terminaux synaptiques ^15,16, la surveillance des changements induits par la nicotine en [Ca ^2+] _i dans les terminaisons nerveuses synaptiques par imagerie de cellules vivantes ^17, et la surveillance indirecte de la libération des neurotransmetteurs à la terminaison synaptique partechniques d'imagerie cellulaire en direct avec des indicateurs fluorescents, y compris l'exocytose des vésicules synaptiques vus par les colorants de styryle amphipathiques FM (FM1-43 et FM4-64) et / ou synapto-pHluorin et par des journalistes de neurotransmetteurs fluorescentes spécifiques, tels que CNiFERs pour ACh et iGluSnFr pour le glutamate ^18-20. Globalement, ces approches actuelles pour identifier la localisation pré-synaptique de nAChRs sont complexes, et nécessitent des systèmes et des techniques spéciales pour permettre une identification fiable et surveillance physiologique de l'activité pré-synaptique.

Nous décrivons ici les protocoles et l'équipement pour un système de co-culture in vitro d'un hippocampe ventral (vHipp) – noyau accumbens (NACC) circuit qui offre un accès direct à identifier et analyser les deux composants pré et post-synaptiques de la transmission synaptique. Nous montrons des exemples de localisation pré-synaptique de nAChRs et l'imagerie des cellules vivantes de nAChR médiation Ca ²⁺ signalisation et de la libération de neurotransmetteurs aloaxones ng vHipp. Une extension naturelle (et simple) du protocole présenté ici est la préparation des contacts pré- et post-synaptiques constitués de neurones à partir de différents génotypes. De cette manière, la contribution d'un produit de gène particulier de la pré- et / ou post-synaptiques des mécanismes de modulation peut être évaluée directement.

Protocol

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les National Institutes of Health Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire (NIH Publications n ° 80-23, révisé 2012) et des études ont été approuvés par Institutional Animal Care et à utiliser pour les comités de recherche à Stony Brook University (# 1618 et # 1792). 1. vHipp ANCC synaptiques Co-cultures souris Sacrifice (jour postnatal 0 – 3, de type sauvage (WT) …

Representative Results

La préparation employée se compose de gènes chimère co-cultures de circuits vHipp ANCC in vitro. Projections émanant microslices vHipp, comme entrée axonale pré-synaptique, peuvent faire des contacts synaptiques avec les objectifs post-synaptiques, les neurones dispersés du CNAC. La nicotine induit une (≥ 30 min) la facilitation de la transmission glutamatergique soutenue à partir de neurones CNAC innervés par vHipp axones 21 et prolongée calcium signalisation le long des axones vHipp <s…

Discussion

La préparation de co-culture décrit re-capitule circuits de l'hippocampe-accumbens ventrales in vitro. Cet examen permet de préparation relativement simple et fiable des profils spatiaux et temporels qui activation des nAChR pré-synaptiques susciter améliorée transmission glutamatergique ^{5, 21.}

Co-cultures sont définis comme la croissance de différents types de cellules spécifiques dans un plat qui peut fournir des conditions physiologiques in vitro …

Materials

			1, Culture Media (50 ml)
Neurobasal	GIBCO	10888022	48 ml
B-27 Supplements	GIBCO	0080085-SA	1 ml
Penicillin-Streptomycin	GIBCO	10908-010	0.5 ml
GlutaMAX Supplement	GIBCO	35050-061	0.5 ml
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	GIBCO	15140-122	20 ng/ml
			2, washing media (HBSS, 100 ml)
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red	GIBCO	14175-095	99 ml
HEPES ( 1M)	GIBCO	15630-130	1 ml
			3, HEPES buffered saline  (HBS)   pH=7.3
NaCl	Sigma	S9888	135 mM
KCl	Sigma	P9333	5 mM
MgCl2	Sigma	M8266	1 mM
CaCl2,	Sigma	C1016	2 mM
HEPES	Sigma	H3375	10 mM
Glucose	Sigma	G0350500	10 mM
			4, HBS Cocktail for live imaging pH=7.3
NaCl	Sigma	S9888	135 mM
KCl	Sigma	P9333	5 mM
MgCl2	Sigma	M8266	1 mM
CaCl2,	Sigma	C1016	2 mM
HEPES	Sigma	H3375	10 mM
Glucose	Sigma	G0350500	10 mM
tetrodotoxin	Tocris	1078	2 µM
bicuculline	Tocris	131	10 µM
D-AP-5	Tocris	105	50 µM
CNQX	Tocris	1045	20 µM
LY341495	Tocris	1209	10 µM
			5, Calcium-free  HBS   pH=7.3
NaCl	Sigma	S9888	135 mM
KCl	Sigma	P9333	5 mM
MgCl2	Sigma	M8266	1 mM
HEPES	Sigma	H3375	10 mM
Glucose	Sigma	G0350500	10 mM
			6, 56 mM Potassium ACSF pH=7.4
NaCl	Sigma	S9888	119 mM
KCl	Sigma	P9333	56 mM
MgSO4.7H	Sigma	M1880	1.3 mM
CaCl2	Sigma	C1016	2.5 mM
NaH2PO4	Sigma	S8282	1 mM
NaHCO3	Sigma	S5761	26.2 mM
Glucose	Sigma	G0350500	10 mM