니코틴 유도 칼슘 신호 전달 및 복부 해마 축삭을 따라 신경 전달 물질 방출의 라이브 영상
Summary
We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal – accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.
Abstract
Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)–accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.
Introduction
회로 흥분성의 콜린성 변조인지의 기본적인 양태에 기여하고, 변경된 콜린성 변조는 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 정신 분열증 및 중독 1-4 포함한 신경 퇴행성 질환 및 신경 기능이다. 중추 신경계의 시냅스 전달의 콜린성 촉진의 설립 메커니즘은 사전 시냅스 사이트에서 번역 된 nAChRs 직접 활성화를 통해입니다. 간접적으로 특정 nAChR을 서브 타입, 그리고 상대적으로 높은 칼슘 전도에 직접적으로 인해를 통해 세포 내 신호 폭포 -이 사전 시냅스 수용체의 활성화는 세포 내 칼슘 ([칼슘 2 +] I) 전 시냅스 터미널의 증가에 이르게 5함으로써 신경 전달 물질 방출을 향상. 실제로, 프리 시냅스 nAChRs의 활성화는 글루타메이트 신경 전달 물질을 포함한 다양한, GABA, 아세틸 콜린의 방출의 변화와 연관되어있다차 도파민 6-10. 이 프로세스는 다양한 간접적 시냅스 전기 생리 학적 방법을 이용하여 검토했지만, 광학 기자 [CA는 2+] i 및 시냅스 소포 재활용 프리 시냅스 현상의 직접적인 시간적으로 정확한 측정을 허용한다.
nAChRs의 사전 시냅스 현지화는 전자 현미경 (EM) 레벨 11, 12에 nAChRs 직접 면역 금 표지와 함께 설득력있게 입증되었다. 다른 여러 기술들은 배양 된 신경 세포 (13, 14)에 nAChRs subunit- 형광 단백질 키메라의 위치를 검출 포함한 간접적 nAChR을 현지화를 해결하기 위해 사용되고, 시냅스 말단 (15, 16)에 nAChR을 전류의 전기 생리 학적 기록 [캘리포니아 니코틴 유도 변화를 모니터링 에 의해 시냅스 터미널에서 라이브 세포 이미징 (17), 및 신경 전달 물질 방출의 간접적 인 모니터링에 의한 시냅스 신경 터미널에서 2 +] I스티 릴 양친 매성 FM 염료 (FM1 - 43와 FM4-64) 및 / 또는 synapto-pHluorin에 의해 및 글루타메이트에 대한 아세틸 콜린과 iGluSnFr에 대한 CNiFERs 같은 특정 형광 신경 전달 물질 기자, 볼 시냅스 소포의 세포 외 유출을 포함 형광 지표와 라이브 세포 이미징 기법, 18 ~ 20. 전반적으로, nAChRs의 사전 시냅스 현지화를 식별이 현재의 접근 방법이 복잡하고, 신뢰할 수있는 식별 및 사전 시냅스 활동의 생리 학적 모니터링을 할 수 있도록 특별한 시스템과 기술을 필요로한다.
확인하고 시냅스 전달의 사전 및 사후 시냅스 구성 요소를 모두 분석에 직접 액세스를 제공합니다 핵 중격 의지 (NACC) 회로 – 여기서 우리는 복부 해마 (vHipp)의 체외 공동 문화 시스템에 대한 프로토콜 및 장비에 대해 설명합니다. 우리는 전 시냅스 nAChRs의 현지화 및 칼슘 신호와 신경 전달 물질 방출 ALO 매개 nAChR을의 라이브 세포 이미징의 예를 보여NG vHipp 축삭. 여기에 제시된 프로토콜 천연 (및 간단한) 확장은 다른 유전자형으로부터 뉴런 구성된 전후 시냅스 접촉의 제조이다. 이러한 방식으로 변조 전 및 / 또는 후 – 시냅스 메커니즘 특정 유전자 산물의 기여는 직접 평가할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
공동 배양 제제는 기재된 재 저항하는 것을 시험 관내 복부 해마-중격 의지 회로. 프리 시냅스 nAChRs의 활성화는 글루타메이트 변속기 (5), (21)를 강화 유도하는 공간 및 시간 프로파일이 제조 허가 비교적 간단하고 신뢰성 시험.
공동 배양 생체 -like 함수를 보여주는 시험 관내에서 생리적 조건을 제공 할 수있는 하나의 접시에 다른 특정 세?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Yehui Qin and Mallory Myers for technical support. We also thank Dr. Sigismund Huck for providing us the anti-α4-ECD antibody. This work is supported by National Institutes of Health grant NS22061 to L. W. R.
Materials
| 1, Culture Media (50 ml) | |||
| Neurobasal | GIBCO | 10888022 | 48 ml |
| B-27 Supplements | GIBCO | 0080085-SA | 1 ml |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 10908-010 | 0.5 ml |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | 0.5 ml |
| Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | GIBCO | 15140-122 | 20 ng/ml |
| 2, washing media (HBSS, 100 ml) | |||
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | GIBCO | 14175-095 | 99 ml |
| HEPES ( 1M) | GIBCO | 15630-130 | 1 ml |
| 3, HEPES buffered saline (HBS) pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| CaCl2, | Sigma | C1016 | 2 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| 4, HBS Cocktail for live imaging pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| CaCl2, | Sigma | C1016 | 2 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| tetrodotoxin | Tocris | 1078 | 2 µM |
| bicuculline | Tocris | 131 | 10 µM |
| D-AP-5 | Tocris | 105 | 50 µM |
| CNQX | Tocris | 1045 | 20 µM |
| LY341495 | Tocris | 1209 | 10 µM |
| 5, Calcium-free HBS pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| 6, 56 mM Potassium ACSF pH=7.4 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 119 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 56 mM |
| MgSO4.7H | Sigma | M1880 | 1.3 mM |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | 2.5 mM |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | 1 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | 26.2 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
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