Imagens ao vivo de nicotina Induzida Sinalização de Cálcio e Neurotransmitter lançamento Junto ventrais do hipocampo Axons

Summary

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal – accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

Abstract

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)–accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

Introduction

Modulação do circuito colinérgico excitabilidade contribui para os aspectos fundamentais de cognição, e modulação colinérgica alterada é uma característica de distúrbios neurodegenerativos e neuropsiquiátricas incluindo a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esquizofrenia e dependência ^1-4. Um mecanismo estabelecido de facilitação de transmissão sináptica colinérgica no sistema nervoso central é, por activação directa de nAChRs localizadas em locais pré-sinápticos. A activação destes receptores pré-sinápticos leva a um aumento de Ca2 ⁺ intracelular ([Ca ^2+] _i) nos terminais pré-sinápticos – tanto directamente, devido à relativamente elevada condutância de cálcio de certos subtipos de nAChR, e indirectamente, por cascatas de sinalização intracelular ^5, aumentando, assim, a libertação de neurotransmissores. De facto, a activação dos nAChRs pré-sinápticos tem sido associada com mudanças na libertação de uma grande variedade de neurotransmissores, incluindo glutamato, GABA, acetilcolina, umND dopamina ^6-10. Embora este processo tem sido estudada usando métodos electrofisiológicos indirectamente em diversas sinapses, indicadores ópticos de [Ca2 ^+] _i e a reciclagem das vesículas sinápticas permitir uma medição mais directa e temporalmente precisa dos fenómenos pré-sinápticos.

Localização pré-sináptica dos nAChRs foi demonstrada de forma convincente com rotulagem imuno-ouro direta de nAChRs na microscopia eletrônica (EM) nível ^11,12. Várias outras técnicas também têm sido utilizados para tratar a localização do nAChR indirectamente, incluindo a detecção de locais de nAChRs subunit- quimeras de proteína fluorescente em neurónios cultivados ^13,14, electrofisiológico gravação de correntes de nAChR em terminais sinápticos ^15,16, monitorização de nicotina induziu alterações na [Ca ^{2 +]} _i em terminais nervosos sinápticas por imagens ao vivo de células ¹⁷ e monitoramento indireto da liberação do neurotransmissor no terminal sináptico portécnicas de imagem de células vivas com indicadores fluorescentes, incluindo exocitose das vesículas sinápticas vistos por estirilo corantes anfip�icos FM (FM1-43 e FM4-64) e / ou synapto-pHluorin e por repórteres fluorescentes neurotransmissores específicos, como CNiFERs para ACh e iGluSnFr para glutamato ^18-20. No geral, essas abordagens atuais para identificar a localização pré-sináptica dos nAChRs são complicadas e exigem sistemas e técnicas especiais para permitir a identificação confiável e monitorização fisiológica da atividade pré-sináptica.

Aqui nós descrevemos protocolos e equipamentos para um sistema in vitro de co-cultura de um hipocampo ventral (vHipp) – núcleo accumbens (NACC) circuito que fornece acesso direto para identificar e analisar os dois componentes pré e pós-sinápticos de transmissão sináptica. Mostramos exemplos de localização pré-sináptica dos nAChRs ea imagens de células vivas de nAChR mediada sinalização de Ca2 ⁺ e liberação de neurotransmissores aloaxônios ng vHipp. Uma extensão natural (e direta) do protocolo apresentado aqui é a preparação de contatos pré e pós-sinápticos composta de neurônios de diferentes genótipos. Deste modo, a contribuição de um produto de gene em particular para o pré e / ou de mecanismos pós-sinápticos de modulação pode ser avaliada directamente.

Protocol

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (NIH Publications No. 80-23, revisado 2012) e estudos foram aprovados pelo Institutional Animal Care e Use para Comitês de Pesquisa em Stony Brook University (# 1618 e # 1792). 1. vHipp-NACC Synaptic Co-culturas Camundongos Sacrifice (pós-natal dias 0-3, a partir do tipo selvagem (WT) ou nAChRs α7 linha de camundongo transgênic…

Representative Results

A preparação utilizada consiste de gene quimérico co-culturas de circuitos vHipp-NACC in vitro. Projeções que emanam microslices vHipp, como entrada axonal pré-sináptico, pode fazer contatos sinápticos com metas pós-sinápticos, os neurônios dispersos de NACC. A nicotina induziu um (≥ 30 min) facilitação sustentado de transmissão glutamatérgica de neurônios NACC inervados por vHipp axônios sinalização ao longo vHipp axônios 5 via α7 pré-sináptica * nAChRs 21 e prolo…

Discussion

A preparação de co-cultura descrito re-circuitos do hipocampo ventral cede-accumbens in vitro. Esta análise permite preparação relativamente simples e de confiança dos perfis espaciais e temporais pelo qual a activação de nAChRs pré-sinápticos eliciar melhoradas transmissão glutamatérgica ^{5, 21.}

Co-culturas são definidos como o crescimento de diferentes tipos de células específicas em um prato que pode proporcionar condições fisiológicas in vitro par…

Materials

			1, Culture Media (50 ml)
Neurobasal	GIBCO	10888022	48 ml
B-27 Supplements	GIBCO	0080085-SA	1 ml
Penicillin-Streptomycin	GIBCO	10908-010	0.5 ml
GlutaMAX Supplement	GIBCO	35050-061	0.5 ml
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	GIBCO	15140-122	20 ng/ml
			2, washing media (HBSS, 100 ml)
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red	GIBCO	14175-095	99 ml
HEPES ( 1M)	GIBCO	15630-130	1 ml
			3, HEPES buffered saline  (HBS)   pH=7.3
NaCl	Sigma	S9888	135 mM
KCl	Sigma	P9333	5 mM
MgCl2	Sigma	M8266	1 mM
CaCl2,	Sigma	C1016	2 mM
HEPES	Sigma	H3375	10 mM
Glucose	Sigma	G0350500	10 mM
			4, HBS Cocktail for live imaging pH=7.3
NaCl	Sigma	S9888	135 mM
KCl	Sigma	P9333	5 mM
MgCl2	Sigma	M8266	1 mM
CaCl2,	Sigma	C1016	2 mM
HEPES	Sigma	H3375	10 mM
Glucose	Sigma	G0350500	10 mM
tetrodotoxin	Tocris	1078	2 µM
bicuculline	Tocris	131	10 µM
D-AP-5	Tocris	105	50 µM
CNQX	Tocris	1045	20 µM
LY341495	Tocris	1209	10 µM
			5, Calcium-free  HBS   pH=7.3
NaCl	Sigma	S9888	135 mM
KCl	Sigma	P9333	5 mM
MgCl2	Sigma	M8266	1 mM
HEPES	Sigma	H3375	10 mM
Glucose	Sigma	G0350500	10 mM
			6, 56 mM Potassium ACSF pH=7.4
NaCl	Sigma	S9888	119 mM
KCl	Sigma	P9333	56 mM
MgSO4.7H	Sigma	M1880	1.3 mM
CaCl2	Sigma	C1016	2.5 mM
NaH2PO4	Sigma	S8282	1 mM
NaHCO3	Sigma	S5761	26.2 mM
Glucose	Sigma	G0350500	10 mM