Nikotin Kaynaklı Kalsiyum Sinyali ve ventral Hipokampal Aksonlar boyunca Nörotransmitter Release Canlı Görüntüleme

Summary

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal – accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

Abstract

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)–accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

Introduction

Devre uyarılabilirliğinin Kolinerjik modülasyon biliş temel yönlerine katkıda bulunur ve değişmiş kolinerjik modülasyonu Alzheimer hastalığı, Parkinson hastalığı, şizofreni ve bağımlılık ^1-4 olmak üzere nörodejeneratif ve nöropsikiyatrik bozuklukların bir özelliğidir. CNS'de sinaptik iletim kolinerjik kolaylaştırılması kurulan bir mekanizma, ön-sinaptik olarak lokalize nAChR'lerin doğrudan aktivasyonu yoluyla olmaktadır. Dolaylı olarak bazı nAChR alt tipleri ve nispeten yüksek kalsiyum iletkenlik hem doğrudan, bağlı ile hücre içi sinyal iletim – bu pre-sinaptik reseptörlerinin aktivasyonu, hücre içi Ca ^{+ 2} ([Ca2 ^+] _i) ön-sinaptik terminallerindeki sebep olur ^5, bu şekilde nörotransmitter salgılanmasını zenginleştirmek. Aslında, pre-sinaptik nAChR'lerin aktivasyonu da dahil olmak üzere, glutamat nörotransmitterlerin çok çeşitli GABA, ACh, serbest değişikliklerle bağlantılı olan birnd dopamin ^6-10. Bu işlem, dolaylı, çeşitli sinapslarda elektrofizyolojik yöntemler kullanılarak incelenmiştir, ancak optik habercilerin [Ca2 ^+] _i ve sinaptik vezikül dönüştürme pre-sinaptik olayların daha doğrudan ve zamansal olarak hassas ölçümü sağlar.

NAChR'lerin pre-sinaptik lokalizasyon elektron mikroskobik (EM) düzeyinde ^11,12 olarak nAChR'lerin doğrudan bağışıklık altın etiketleme ile ikna edici kanıtlanmıştır. Birkaç diğer teknikler de kültürlü nöronlar ^13,14 nAChRs subunit- floresan protein kimeralar yerleri tespit da dahil olmak üzere, dolaylı nAChR yerelleştirme hitap için kullanılır olmuştur, sinaptik terminallerde ^15,16 yılında nAChR akımların elektrofizyolojik kayıt, [içinde Ca nikotin kaynaklı değişiklikleri izleme sinaptik terminalinde canlı hücre görüntüleme ¹⁷ ve nörotransmitter salınımı dolaylı izlenmesi sinaptik sinir terminallerinde ^{2 +]} _istiril amfipatik FM boyalar (FM1-43 ve FM4-64) ve / veya synapto-pHluorin ve bu tür glutamat ACH ve iGluSnFr için CNiFERs gibi özel flüoresan nörotransmiter muhabir, tarafından izlendi sinaptik veziküllerin ekzositozu de dahil olmak üzere, floresan göstergesi olan canlı hücre görüntüleme teknikleri ^18-20. Genel olarak, nAChR'lerin pre-sinaptik localisation belirlenmesi için, bu mevcut yaklaşımlar karmaşıktır ve güvenilir bir kimlik ve pre-sinaptik aktivitenin fizyolojik izleme sağlamak için özel bir sistem ve teknikler gerektirir.

Belirlemek ve sinaptik iletim öncesi ve post-sinaptik bileşenleri hem de analiz doğrudan erişim sağlayan nükleus akumbens (NACC) devre – Burada bir ventral hipokampal (vHipp) in vitro ko-kültür sistemi protokolleri ve ekipmanlar açıklar. Biz pre-sinaptik nAChR'lerin lokalizasyonu ve Ca ^{2 +} sinyalizasyon ve nörotransmitter bırakma alo aracılı nAChR'nin canlı hücre görüntüleme örneklerini göstermektedirng vHipp aksonlar. Burada sunulan protokol doğal (ve basit) uzantısı farklı genotipleri gelen nöronların oluşan öncesi ve post-sinaptik temasların hazırlanmasıdır. Bu şekilde, modülasyon öncesi ve / veya post-sinaptik mekanizma belirli bir gen ürününün katkı, doğrudan tespit edilebilir.

Protocol

Tüm hayvan deneyleri (2012 revize NIH Yayınları No. 80-23) Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Sağlık Rehberi National Institutes uyarınca yürütüldü ve çalışmalar Kurumsal Hayvan Bakım tarafından onaylanmış ve Stony Araştırma Komiteleri için kullanın edildi Brook Üniversitesi (# 1618 ve # 1792). 1. vHipp-NACC Sinaptik Co-kültürler Kurban fareleri (doğum sonrası gün 0 – vahşi tip (WT) ya da α7 nAChRs transgenik fare hattı 3) CO2 ile….

Representative Results

kullanılan preparat, in vitro olarak vHipp-NACC devreler gen, kimerik ko-kültürler oluşur. VHipp microslices kaynaklanan Projeksiyonlar, pre-sinaptik akson girdi olarak, post-sinaptik hedefler NACC dağılmış nöronlar ile sinaptik kişileri yapabilirsiniz. VHipp tarafından innerve NACC nöronlardan glutamaterjik iletimin bir sürekli (≥ 30 dk) kolaylaştırma kaynaklı nikotin pre-sinaptik α7 * nAChRs aracılığıyla vHipp aksonlar 5 boyunca sinyal 21 ve uzamış kalsiyum akson…

Discussion

ko-kültür hazırlanması açıklanan yeniden taahhüt eder in vitro ventral hipokampal-accumbens devreleri. pre-sinaptik nAChR'lerin aktivasyon glutamaterjik iletimi ^{5, 21} gelişmiş ortaya çıkaran hangi mekansal ve zamansal profillerin Bu preparat izin oldukça basit ve güvenilir bir sınav.

Co-kültürlerinde in vivo benzeri işlev göstermek için, in vitro olarak fizyolojik koşulları sağlayan bir çanak içinde farklı spesifik h…

Materials

			1, Culture Media (50 ml)
Neurobasal	GIBCO	10888022	48 ml
B-27 Supplements	GIBCO	0080085-SA	1 ml
Penicillin-Streptomycin	GIBCO	10908-010	0.5 ml
GlutaMAX Supplement	GIBCO	35050-061	0.5 ml
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	GIBCO	15140-122	20 ng/ml
			2, washing media (HBSS, 100 ml)
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red	GIBCO	14175-095	99 ml
HEPES ( 1M)	GIBCO	15630-130	1 ml
			3, HEPES buffered saline  (HBS)   pH=7.3
NaCl	Sigma	S9888	135 mM
KCl	Sigma	P9333	5 mM
MgCl2	Sigma	M8266	1 mM
CaCl2,	Sigma	C1016	2 mM
HEPES	Sigma	H3375	10 mM
Glucose	Sigma	G0350500	10 mM
			4, HBS Cocktail for live imaging pH=7.3
NaCl	Sigma	S9888	135 mM
KCl	Sigma	P9333	5 mM
MgCl2	Sigma	M8266	1 mM
CaCl2,	Sigma	C1016	2 mM
HEPES	Sigma	H3375	10 mM
Glucose	Sigma	G0350500	10 mM
tetrodotoxin	Tocris	1078	2 µM
bicuculline	Tocris	131	10 µM
D-AP-5	Tocris	105	50 µM
CNQX	Tocris	1045	20 µM
LY341495	Tocris	1209	10 µM
			5, Calcium-free  HBS   pH=7.3
NaCl	Sigma	S9888	135 mM
KCl	Sigma	P9333	5 mM
MgCl2	Sigma	M8266	1 mM
HEPES	Sigma	H3375	10 mM
Glucose	Sigma	G0350500	10 mM
			6, 56 mM Potassium ACSF pH=7.4
NaCl	Sigma	S9888	119 mM
KCl	Sigma	P9333	56 mM
MgSO4.7H	Sigma	M1880	1.3 mM
CaCl2	Sigma	C1016	2.5 mM
NaH2PO4	Sigma	S8282	1 mM
NaHCO3	Sigma	S5761	26.2 mM
Glucose	Sigma	G0350500	10 mM