Summary

Imágenes en vivo de nicotina señalización de calcio inducido y neurotransmisor lanzamiento Junto ventrales hipocampo axones

Published: June 24, 2015
doi:

Summary

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal – accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

Abstract

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)–accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

Introduction

Modulación de la excitabilidad colinérgica circuito contribuye a aspectos fundamentales de la cognición, y alterado modulación colinérgica es una característica de trastornos neurodegenerativos y neuropsiquiátricos incluyendo la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, la esquizofrenia y la adicción 1-4. Un mecanismo establecido de la facilitación de la transmisión sináptica colinérgica en el sistema nervioso central es a través de la activación directa de nAChR localizadas en los sitios pre-sinápticas. La activación de estos receptores presinápticos conduce a un aumento de Ca2 + intracelular ([Ca 2 +] i) en los terminales presinápticos – tanto de forma directa, debido a la relativamente alta conductancia de calcio de ciertos subtipos de nAChR, e indirectamente, a través de cascadas de señalización intracelular 5, mejorando de este modo la liberación de neurotransmisores. De hecho, la activación de nAChR pre-sinápticos se ha relacionado con los cambios en la liberación de una amplia variedad de neurotransmisores incluyendo glutamato, GABA, ACh, unand dopamina 6-10. Aunque este proceso se ha estudiado indirectamente usando métodos electrofisiológicos en varias sinapsis, los reporteros ópticas de [Ca2 +] i y el reciclado de vesículas sinápticas permiten una medición más directa y temporalmente precisa de los fenómenos pre-sinápticos.

Localización presináptica de nAChR se ha demostrado de forma convincente con el etiquetado inmuno-oro directa de nAChR en el microscopio electrónico (EM) nivel de 11,12. Varias otras técnicas también se han utilizado para tratar la localización nAChR indirectamente, incluyendo la detección de lugares de nAChRs subunit- quimeras de proteínas fluorescentes en neuronas cultivadas 13,14, registro electrofisiológico de las corrientes de nAChR en las terminales sinápticas 15,16, seguimiento de los cambios inducidos por la nicotina en [Ca 2 +] i en las terminales nerviosas sinápticas de imágenes en vivo de células 17, y la supervisión indirecta de la liberación de neurotransmisores en la terminal sináptica portécnicas de imagen de células vivas con indicadores fluorescentes, incluyendo exocitosis de vesículas sinápticas vistos por estirilo tintes anfipáticas FM (FM1-43 y FM4-64) y / o synapto-pHluorin y por los reporteros fluorescentes neurotransmisores específicos, como CNiFERs de ACh y iGluSnFr para el glutamato 18-20. En general, estos enfoques actuales para la identificación de la localización presináptica de nAChR son complicados y requieren sistemas y técnicas especiales para permitir la identificación fiable y monitorización fisiológica de la actividad presináptica.

Aquí se describen los protocolos y equipos para un sistema de co-cultivo in vitro de un hipocampo ventral (vHipp) – núcleo accumbens (NACC) de circuito que proporciona acceso directo a identificar y analizar los dos componentes pre y post-sinápticos de la transmisión sináptica. Mostramos ejemplos de localización presináptica de nAChR y la imagen de células vivas de nAChR mediada por Ca 2 + de señalización y la liberación de neurotransmisores aloaxones ng vHipp. Una extensión natural (y sencillo) del protocolo que se presenta aquí es la preparación de los contactos pre y post-sináptica compuestos por neuronas de diferentes genotipos. De esta manera la contribución de un producto génico particular, a la pre y / o post-sinápticas mecanismos de modulación se puede evaluar directamente.

Protocol

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (NIH Publicaciones Nº 80-23, revisado 2012) y los estudios fueron aprobados por Institucional Cuidado de Animales y el uso de los Comités de Investigación en Stony Brook University (# 1618 y # 1792). 1. vHipp-NACC sinápticas Co-culturas Ratones Sacrificio (día postnatal 0-3, de tipo salvaje (WT) o nAChR α7 línea d…

Representative Results

La preparación empleada consiste en genes quiméricos co-cultivos de circuitos vHipp-NACC in vitro. Las proyecciones que emanan de microslices vHipp, como entrada axonal presináptica, pueden hacer contactos sinápticos con las metas post-sinápticas, las neuronas dispersas de NACC. Indujo un (≥ 30 min) la facilitación sostenida de la transmisión glutamatérgica de las neuronas NACC inervados por vHipp nicotina axones 21 y prolongada de calcio de señalización a lo largo de los axones vHipp <su…

Discussion

La preparación de co-cultivo describe re-capitula circuitos del hipocampo ventral-accumbens in vitro. Este examen permite la preparación relativamente sencillo y fiable de los perfiles espaciales y temporales por el cual la activación de nAChR pre-sinápticos obtener mejor transmisión glutamatérgica 5, 21.

Co-culturas se definen como el crecimiento de diferentes tipos de células específicas en un plato que puede proporcionar condiciones fisiológicas in vitro</…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Yehui Qin and Mallory Myers for technical support. We also thank Dr. Sigismund Huck for providing us the anti-α4-ECD antibody. This work is supported by National Institutes of Health grant NS22061 to L. W. R.

Materials

1, Culture Media (50 ml)
Neurobasal  GIBCO 10888022 48 ml
B-27 Supplements GIBCO 0080085-SA 1 ml
Penicillin-Streptomycin GIBCO 10908-010 0.5 ml
GlutaMAX Supplement GIBCO 35050-061 0.5 ml
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) GIBCO 15140-122 20 ng/ml
2, washing media (HBSS, 100 ml)
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red  GIBCO 14175-095 99 ml
HEPES ( 1M) GIBCO 15630-130 1 ml
3, HEPES buffered saline  (HBS)   pH=7.3
NaCl Sigma S9888  135 mM
KCl Sigma P9333  5 mM
MgCl2 Sigma M8266  1 mM
CaCl2, Sigma C1016  2 mM
HEPES Sigma H3375  10 mM
Glucose Sigma G0350500  10 mM
4, HBS Cocktail for live imaging pH=7.3
NaCl Sigma S9888  135 mM
KCl Sigma P9333  5 mM
MgCl2 Sigma M8266  1 mM
CaCl2, Sigma C1016  2 mM
HEPES Sigma H3375  10 mM
Glucose Sigma G0350500  10 mM
tetrodotoxin  Tocris 1078 2 µM
bicuculline Tocris 131 10 µM
D-AP-5 Tocris 105 50 µM
CNQX Tocris 1045 20 µM
LY341495 Tocris 1209 10 µM
5, Calcium-free  HBS   pH=7.3
NaCl Sigma S9888  135 mM
KCl Sigma P9333  5 mM
MgCl2 Sigma M8266  1 mM
HEPES Sigma H3375  10 mM
Glucose Sigma G0350500  10 mM
6, 56 mM Potassium ACSF pH=7.4
NaCl Sigma S9888 119 mM
KCl Sigma P9333 56 mM
MgSO4.7H Sigma M1880 1.3 mM
CaCl2 Sigma C1016 2.5 mM
NaH2PO4 Sigma S8282 1 mM
NaHCO3 Sigma S5761 26.2 mM
Glucose Sigma G0350500  10 mM

Referências

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Citar este artigo
Zhong, C., Talmage, D. A., Role, L. W. Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons. J. Vis. Exp. (100), e52730, doi:10.3791/52730 (2015).

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