Живая съемка никотина индуцированной сигнализации кальция и высвобождение нейромедиаторов Наряду вентральной гиппокампа Аксоны
Summary
We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal – accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.
Abstract
Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)–accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.
Introduction
Холинергическая модуляции возбудимости цепи способствует фундаментальных аспектов познания, и изменены холинергическая модуляции особенностью нейродегенеративных и психоневрологических расстройств, включая болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, шизофрения и наркомании 1-4. Установлен механизм холинергической облегчению синаптической передачи в ЦНС с помощью прямой активации nAChRs, локализованных на пресинаптических сайтов. Активация этих пресинаптических рецепторов приводит к увеличению внутриклеточного Са 2+ ([Ca 2+] I), в пресинаптических терминалах – как непосредственно, из-за относительно высокой проводимости кальция определенных подтипов нАХР, так и косвенно, через внутриклеточные сигнальные каскады 5, тем самым повышая высвобождение нейромедиаторов. В самом деле, активация пресинаптических nAChRs был связан с изменениями в выпуске широкого спектра нейротрансмиттеров, включая глутамат, ГАМК, ацетилхолина,й допамина 6-10. Хотя этот процесс был изучен с помощью электрофизиологических косвенно методы в различных синапсов, оптические репортеры [Са 2+] я и переработка синаптических пузырьков позволяют более прямой и временно точное измерение пресинаптических явлений.
Пресинаптических локализации nAChRs была убедительно показал, с прямым иммуно-золота маркировки nAChRs на электронно-микроскопических (ЭМ) уровне 11,12. Некоторые другие методы также были использованы для решения локализацию Nachr косвенно, в том числе определения местоположения nAChRs subunit- флуоресцентный белок химер в культивируемых нейронах 13,14, электрофизиологические записи нАХР токов в синаптических окончаний 15,16, мониторинг никотина индуцированных изменений в [Са 2+] я в синаптических нервных терминалов по живого изображения клеток 17 и косвенного контроля высвобождения нейромедиатора в синаптической терминала поживые методы визуализации клеток с люминесцентными показателей, в том числе экзоцитоза синаптических пузырьков просмотренных стириловых амфипатических красителей FM (FM1-43 и FM4-64) и / или synapto-pHluorin и конкретных флуоресцентных нейромедиаторов журналистами, таких как CNiFERs для АХ и iGluSnFr для глутамата 18-20. В целом, эти современные подходы для выявления пресинаптических локализации nAChRs сложны и требуют специальных систем и методов, чтобы надежно идентифицировать и физиологического мониторинга до синаптической активности.
Здесь мы опишем протоколов и оборудование для в пробирке сокультуры системы брюшной гиппокампа (vHipp) – прилежащем ядре (ССАС) цепи, которая обеспечивает прямой доступ для определения и анализа пред- и пост-синаптические компоненты синаптической передачи. Мы показываем примеры пресинаптической локализации nAChRs и живых клеток визуализации нАХР опосредованной Са 2+ сигнализации и нейромедиатор релиз Алонг vHipp аксоны. Естественно (и простой) расширение протокола, представленного здесь подготовка пред- и пост-синаптических контактов, состоящих из нейронов разных генотипов. Таким образом вклад конкретного генного продукта в пред- и / или постсинаптических механизмов модуляции может быть оценена непосредственно.
Protocol
Representative Results
Discussion
Подготовка совместно культуры описано повторно капитулирует брюшной гиппокампа-прилежащем схем в пробирке. Это позволяет подготовка относительно проста и надежный экспертиза пространственных и временных профилей, с помощью которых активация пресинаптических nAChRs вызывают улу?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Yehui Qin and Mallory Myers for technical support. We also thank Dr. Sigismund Huck for providing us the anti-α4-ECD antibody. This work is supported by National Institutes of Health grant NS22061 to L. W. R.
Materials
| 1, Culture Media (50 ml) | |||
| Neurobasal | GIBCO | 10888022 | 48 ml |
| B-27 Supplements | GIBCO | 0080085-SA | 1 ml |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 10908-010 | 0.5 ml |
| GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | 0.5 ml |
| Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | GIBCO | 15140-122 | 20 ng/ml |
| 2, washing media (HBSS, 100 ml) | |||
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | GIBCO | 14175-095 | 99 ml |
| HEPES ( 1M) | GIBCO | 15630-130 | 1 ml |
| 3, HEPES buffered saline (HBS) pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| CaCl2, | Sigma | C1016 | 2 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| 4, HBS Cocktail for live imaging pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| CaCl2, | Sigma | C1016 | 2 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| tetrodotoxin | Tocris | 1078 | 2 µM |
| bicuculline | Tocris | 131 | 10 µM |
| D-AP-5 | Tocris | 105 | 50 µM |
| CNQX | Tocris | 1045 | 20 µM |
| LY341495 | Tocris | 1209 | 10 µM |
| 5, Calcium-free HBS pH=7.3 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
| HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
| 6, 56 mM Potassium ACSF pH=7.4 | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | 119 mM |
| KCl | Sigma | P9333 | 56 mM |
| MgSO4.7H | Sigma | M1880 | 1.3 mM |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | 2.5 mM |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | 1 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | 26.2 mM |
| Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
Referências
- Changeux, J. P., et al. Brain nicotinic receptors: structure and regulation, role in learning and reinforcement. Brain Res Brain Res Rev. 26 (2-3), 198-216 (1998).
- Levin, E. D. Nicotinic receptor subtypes and cognitive function. J Neurobiol. 53 (4), 633-640 (2002).
- Dani, J. A., Bertrand, D. Nicotinic acetylcholine receptors and nicotinic cholinergic mechanisms of the central nervous system. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 699-729 (2007).
- Mineur, Y. S., Picciotto, M. R. Nicotine receptors and depression: revisiting and revising the cholinergic hypothesis. Trends Pharmacol Sci. 31 (12), 580-586 (2010).
- Zhong, C., Talmage, D. A., Role, L. W. Nicotine elicits prolonged calcium signaling along ventral hippocampal axons. PloS one. 8 (12), e82719 (2013).
- McGehee, D. S., Heath, M. J., Gelber, S., Devay, P., Role, L. W. Nicotine enhancement of fast excitatory synaptic transmission in CNS by presynaptic receptors. Science. 269 (5231), 1692-1696 (1995).
- Gray, R., Rajan, A. S., Radcliffe, K. A., Yakehiro, M., Dani, J. A. Hippocampal synaptic transmission enhanced by low concentrations of nicotine. Nature. 383 (6602), 713-716 (1996).
- Dickinson, J. A., Kew, J. N., Wonnacott, S. Presynaptic alpha 7- and beta 2-containing nicotinic acetylcholine receptors modulate excitatory amino acid release from rat prefrontal cortex nerve terminals via distinct cellular mechanisms. Mol Pharmacol. 74 (2), 348-359 (2008).
- Zappettini, S., Grilli, M., Salamone, A., Fedele, E., Marchi, M. Pre-synaptic nicotinic receptors evoke endogenous glutamate and aspartate release from hippocampal synaptosomes by way of distinct coupling mechanisms. Br J Pharmacol. 161 (5), 1161-1171 (2010).
- Zappettini, S., et al. Presynaptic nicotinic alpha7 and non-alpha7 receptors stimulate endogenous GABA release from rat hippocampal synaptosomes through two mechanisms of action. PloS one. 6 (2), e16911 (2011).
- Fabian-Fine, R., et al. Ultrastructural distribution of the alpha7 nicotinic acetylcholine receptor subunit in rat hippocampus. J Neurosci. 21 (20), 7993-8003 (2001).
- Jones, I. W., Barik, J., O’Neill, M. J., Wonnacott, S. Alpha bungarotoxin-1.4 nm gold: a novel conjugate for visualising the precise subcellular distribution of alpha 7* nicotinic acetylcholine receptors. J Neurosci Methods. 134 (1), 65-74 (2004).
- Nashmi, R., et al. Assembly of alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors assessed with functional fluorescently labeled subunits: effects of localization, trafficking, and nicotine-induced upregulation in clonal mammalian cells and in cultured midbrain neurons. J Neurosci. 23 (37), 11554-11567 (2003).
- Drenan, R. M., et al. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits. Mol Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).
- Wu, J., et al. Electrophysiological, pharmacological, and molecular evidence for alpha7-nicotinic acetylcholine receptors in rat midbrain dopamine neurons. J Pharmacol Exp Ther. 311 (1), 80-91 (2004).
- Parikh, V., Ji, J., Decker, M. W., Sarter, M. Prefrontal beta2 subunit-containing and alpha7 nicotinic acetylcholine receptors differentially control glutamatergic and cholinergic signaling. J Neurosci. 30 (9), 3518-3530 (2010).
- Nayak, S. V., Dougherty, J. J., McIntosh, J. M., Nichols, R. A. Ca(2+) changes induced by different presynaptic nicotinic receptors in separate populations of individual striatal nerve terminals. J Neurochem. 76 (6), 1860-1870 (2001).
- Richards, C. I., et al. Trafficking of alpha4* nicotinic receptors revealed by superecliptic phluorin: effects of a beta4 amyotrophic lateral sclerosis-associated mutation and chronic exposure to nicotine. J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).
- Colombo, S. F., Mazzo, F., Pistillo, F., Gotti, C. Biogenesis, trafficking and up-regulation of nicotinic ACh receptors. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1063-1073 (2013).
- St John, P. A. Cellular trafficking of nicotinic acetylcholine receptors. Acta Pharmacol Sin. 30 (6), 656-662 (2009).
- Zhong, C., et al. Presynaptic type III neuregulin 1 is required for sustained enhancement of hippocampal transmission by nicotine and for axonal targeting of alpha7 nicotinic acetylcholine receptors. J Neurosci. 28 (37), 9111-9116 (2008).
- Jacobowitz, D. M., Abbott, L. C. . Chemoarchitectonic Atlas of the Developing Mouse Brain. , (1998).
- Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
- Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals. Methods Mol Biol. 689, 137-148 (2011).
- Garduno, J., et al. Presynaptic alpha4beta2 nicotinic acetylcholine receptors increase glutamate release and serotonin neuron excitability in the dorsal raphe nucleus. J Neurosci. 32 (43), 15148-15157 (2012).
- Guo, J. Z., Liu, Y., Sorenson, E. M., Chiappinelli, V. A. Synaptically released and exogenous ACh activates different nicotinic receptors to enhance evoked glutamatergic transmission in the lateral geniculate nucleus. J Neurophysiol. 94 (4), 2549-2560 (2005).
- Szabo, S. I., Zelles, T., Vizi, E. S., Lendvai, B. The effect of nicotine on spiking activity and Ca2+ dynamics of dendritic spines in rat CA1 pyramidal neurons. Hippocampus. 18 (4), 376-385 (2008).
