הדמיה חיה של איתות הניקוטין מושרה סידן והשחרור הנוירוטרנסמיטר לאורך האקסונים בהיפוקמפוס הגחון

Summary

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal – accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

Abstract

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)–accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

Introduction

אפנון כולינרגית של רגישות מעגל תורם להיבטים בסיסיים של הכרה, ואפנון כולינרגית שינה הוא תכונה של הפרעות ניווניות ונוירו-פסיכיאטריים, כולל מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, סכיזופרניה והתמכרות ^1-4. מנגנון שנקבע בהנחיית כולינרגית של שידור הסינפטי במערכת העצבים המרכזית הוא באמצעות הפעלה ישירה של nAChRs המקומי באתרים מראש הסינפטי. הפעלה של קולטנים מראש הסינפטי אלה מובילה לעליית ^{2 +} _(i [Ca ^{2 +])} במסופים מראש הסינפטי Ca תאיים – הן במישרין, בשל מוליכות סידן גבוהות יחסית של תת מסוימים nAChR, ובעקיפין, באמצעות מפלי איתות תאיות ^5, ובכך משפרים את שחרור הנוירוטרנסמיטר. למעשה, ההפעלה של nAChRs מראש הסינפטי נקשרה עם שינויים בשחרור של מגוון רחב של נוירוטרנסמיטורים כוללים גלוטמט, GABA, ACH,דופמין ND ^6-10. למרות שתהליך זה נחקר באופן עקיף באמצעות שיטות אלקטרו בהסינפסות שונות, כתבים אופטיים של [Ca ^{2 +]} _i ומחזור שלפוחית ​​סינפטית לאפשר מדידה ישירה ובזמן מדויק יותר של תופעות קדם-סינפטי.

לוקליזציה טרום הסינפטי של nAChRs הודגמה באופן משכנע עם תיוג חיסוני זהב ישיר של nAChRs במיקרוסקופי אלקטרונים (EM) רמת ^11,12. כמה טכניקות אחרות יש גם שימשו לטיפול בלוקליזציה nAChR בעקיפין, לרבות מיקומים של מפלצות חלבון פלואורסצנטי subunit- nAChRs גילוי בנוירונים בתרבית ^13,14, הקלטת אלקטרו של זרמי nAChR במסופים הסינפטי ^15,16, מעקב אחר שינויי ניקוטין מושרה ב[ Ca ^{2 +]} _i במסוף עצב הסינפטי על ידי הדמיה לחיות תא ^17, וניטור עקיף של שחרור הנוירוטרנסמיטר במסוף הסינפטי על ידיטכניקות הדמיה תא חיות עם אינדיקטורים ניאון, כולל exocytosis של שלפוחית ​​סינפטית שנצפה על ידי צבעי styryl amphipathic FM (FM1-43 וFM4-64) ו / או synapto-pHluorin ועל ידי כתבים ספציפיים ניאון עצבי, כגון CNiFERs לאח וiGluSnFr לגלוטמט ^18-20. בסך הכל, גישות הנוכחיות אלה לזיהוי לוקליזציה מראש הסינפטי של nAChRs הן מסובכות, ודורשות מערכות וטכניקות מיוחדות כדי לאפשר זיהוי אמין וניטור פיסיולוגי של פעילות טרום-סינפטי.

כאן אנו מתארים פרוטוקולים וציוד למערכת שיתוף תרבות במבחנה של היפוקמפוס הגחון (vHipp) – גרעין נסמך (nAcc) מעגל המספק גישה ישירה לזהות ולנתח את שני מרכיבים של לפני ואחרי-סינפטי של העברת הסינפטית. אנחנו מראים דוגמאות של לוקליזציה מראש הסינפטי של nAChRs והדמית התא החי של nAChR תיווך Ca ^{2 +} ALO איתות ושחרור הנוירוטרנסמיטרהאקסונים ng vHipp. המשך טבעי (וברור) של הפרוטוקול המובא כאן הוא ההכנה של אנשי קשר לפני ואחרי-סינפטי המורכב מתאי עצב מגנוטיפים שונים. באופן זה את התרומה של מוצר גן מסוים למראש ו / או פוסט-סינפטי מנגנונים של אפנון ניתן להעריך באופן ישיר.

Protocol

כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם למכונים הלאומי לבריאות מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה (NIH פרסומי מס '80-23, מתוקן 2012) ולימודים אושרו על ידי מוסדי טיפול בבעלי חיים והשתמשו לועדות מחקר בסטוני אוניברסיטה ברוק (# -1618 ו# 1792). 1. vHipp-nAcc Syna…

Representative Results

ההכנה המועסקות מורכבת משיתוף תרבויות גן chimeric של מעגלי vHipp-nAcc במבחנה. תחזיות נובעות מmicroslices vHipp, כקלט axonal מראש הסינפטי, יכולות ליצור קשרים סינפטיים עם מטרות פוסט-סינפטי, תאי העצב המפוזרים מnAcc. ניקוטין מושרה סיוע מתמשך (≥ 30 דקות) של שידור glutamatergic מהנוירונים nAcc מעוצבב…

Discussion

הכנת שיתוף התרבות מתוארת מחדש נכנע מעגלים בהיפוקמפוס-נסמכים הגחון במבחנה. בחינת היתרי הכנה פשוטה יחסית ואמינה זה של פרופילי מרחב ובזמן שבו הפעלה של nAChRs מראש הסינפטי לעורר משופרת שידור glutamatergic ^{5, 21.}

שיתוף תרבויות מוגדרו?…

Materials

			1, Culture Media (50 ml)
Neurobasal	GIBCO	10888022	48 ml
B-27 Supplements	GIBCO	0080085-SA	1 ml
Penicillin-Streptomycin	GIBCO	10908-010	0.5 ml
GlutaMAX Supplement	GIBCO	35050-061	0.5 ml
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	GIBCO	15140-122	20 ng/ml
			2, washing media (HBSS, 100 ml)
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red	GIBCO	14175-095	99 ml
HEPES ( 1M)	GIBCO	15630-130	1 ml
			3, HEPES buffered saline  (HBS)   pH=7.3
NaCl	Sigma	S9888	135 mM
KCl	Sigma	P9333	5 mM
MgCl2	Sigma	M8266	1 mM
CaCl2,	Sigma	C1016	2 mM
HEPES	Sigma	H3375	10 mM
Glucose	Sigma	G0350500	10 mM
			4, HBS Cocktail for live imaging pH=7.3
NaCl	Sigma	S9888	135 mM
KCl	Sigma	P9333	5 mM
MgCl2	Sigma	M8266	1 mM
CaCl2,	Sigma	C1016	2 mM
HEPES	Sigma	H3375	10 mM
Glucose	Sigma	G0350500	10 mM
tetrodotoxin	Tocris	1078	2 µM
bicuculline	Tocris	131	10 µM
D-AP-5	Tocris	105	50 µM
CNQX	Tocris	1045	20 µM
LY341495	Tocris	1209	10 µM
			5, Calcium-free  HBS   pH=7.3
NaCl	Sigma	S9888	135 mM
KCl	Sigma	P9333	5 mM
MgCl2	Sigma	M8266	1 mM
HEPES	Sigma	H3375	10 mM
Glucose	Sigma	G0350500	10 mM
			6, 56 mM Potassium ACSF pH=7.4
NaCl	Sigma	S9888	119 mM
KCl	Sigma	P9333	56 mM
MgSO4.7H	Sigma	M1880	1.3 mM
CaCl2	Sigma	C1016	2.5 mM
NaH2PO4	Sigma	S8282	1 mM
NaHCO3	Sigma	S5761	26.2 mM
Glucose	Sigma	G0350500	10 mM