We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal – accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.
Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)–accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.
Kolinerge modulering av kretsen oppstemthet bidrar til grunnleggende aspekter av kognisjon, og endret kolinerge modulasjon er en funksjon av nevrodegenerative og nevropsykiatriske lidelser inkludert Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, schizofreni og avhengighet 1-4. En etablert mekanisme av kolinerge tilrettelegging av synaptisk transmisjon i CNS er via direkte aktivering av nAChR lokaliserte på presynaptiske nettsteder. Aktivering av disse pre-synaptiske reseptorer fører til økt intracellulær Ca 2 + ([Ca2 +] i) i presynaptiske terminaler – både direkte, på grunn av det relativt høye kalsium konduktansen av visse nAChR undertyper, og indirekte, via intracellulære signalkaskader 5, og dermed forbedre neurotransmitterfrigjørelse. Faktisk har aktiveringen av pre-synaptiske nAChR vært knyttet til endringer i frigjøring av en rekke neurotransmittere, inkludert glutamat, GABA, ACh, ennd dopamin 6-10. Selv om denne prosessen har vært undersøkt ved hjelp av indirekte metoder på forskjellige elektrofysiologiske synapser, optiske meldere av [Ca2 +] og gjenvinning av synaptiske vesikler tillate mer direkte og timelig nøyaktig måling av presynaptiske fenomener.
Pre-synaptisk lokalisering av nAChR-er er blitt vist overbevisende med direkte immuno-gull merking av nAChR-er ved elektronmikroskopi (EM) nivå 11,12. Flere andre teknikker har også blitt brukt til å adressere nAChR lokalisering indirekte, herunder å detektere plasseringen av nAChR-subunit- fluorescerende protein-kimeras i dyrkede nerveceller 13,14, elektro opptak av nAChR strømmer i synaptiske terminaler 15,16, overvåking nikotin induserte endringer i [Ca 2+] i som synaptiske nerveterminaler av levende celle bildebehandling 17, og indirekte overvåking av neurotransmitterfrigivning på den synaptiske terminalen vedlevende celle imaging teknikker med fluorescerende indikatorer, inkludert eksocytose av synaptiske vesikler så etter styryl amphipathic FM fargestoffer (FM1-43 og FM4-64) og / eller synapto-pHluorin og ved spesifikke fluorescerende neurotransmitter reportere, som CNiFERs for ACH og iGluSnFr for glutamat 18-20. Samlet disse nåværende fremgangsmåter for identifisering av pre-synaptisk lokalisering av nAChR-er kompliserte, og krever spesielle systemer og teknikker for å tillate pålitelig identifisering og overvåkning av fysiologiske pre-synaptisk aktivitet.
Her beskriver vi protokoller og utstyr for en in vitro co-kultur system av en ventral hippocampus (vHipp) – nucleus accumbens (NACC) krets som gir direkte tilgang til å identifisere og analysere både pre- og postsynaptiske komponenter av synaptisk overføring. Vi viser eksempler på presynaptisk lokalisering av nAChR og live cell imaging av nAChR mediert Ca 2+ signal- og neurotransmitterfrigivning along vHipp aksoner. En naturlig (og grei) forlengelse av protokollen som presenteres her er utarbeidelsen av pre- og postsynaptiske kontakter består av nerveceller fra ulike genotyper. På denne måte bidrag av et spesielt genprodukt til pre- og / eller post-synaptiske mekanismer for modulering kan måles direkte.
Utarbeidelse co-kultur beskrevet re-kapitulerer ventral hippocampus-accumbens kretser in vitro. Dette preparatet tillatelser relativt enkel og pålitelig undersøkelse av romlige og tidsmessige profiler der aktivering av presynaptiske nAChR framprovosere forbedrede glutamaterg girkasse 5, 21.
Ko-kulturer er definert som veksten av forskjellige spesifikke celletyper i en skål som kan gi fysiologiske betingelser in vitro for å demonstrere in vivo-lignende</em…
The authors have nothing to disclose.
We thank Yehui Qin and Mallory Myers for technical support. We also thank Dr. Sigismund Huck for providing us the anti-α4-ECD antibody. This work is supported by National Institutes of Health grant NS22061 to L. W. R.
1, Culture Media (50 ml) | |||
Neurobasal | GIBCO | 10888022 | 48 ml |
B-27 Supplements | GIBCO | 0080085-SA | 1 ml |
Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 10908-010 | 0.5 ml |
GlutaMAX Supplement | GIBCO | 35050-061 | 0.5 ml |
Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | GIBCO | 15140-122 | 20 ng/ml |
2, washing media (HBSS, 100 ml) | |||
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | GIBCO | 14175-095 | 99 ml |
HEPES ( 1M) | GIBCO | 15630-130 | 1 ml |
3, HEPES buffered saline (HBS) pH=7.3 | |||
NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
CaCl2, | Sigma | C1016 | 2 mM |
HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
4, HBS Cocktail for live imaging pH=7.3 | |||
NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
CaCl2, | Sigma | C1016 | 2 mM |
HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
tetrodotoxin | Tocris | 1078 | 2 µM |
bicuculline | Tocris | 131 | 10 µM |
D-AP-5 | Tocris | 105 | 50 µM |
CNQX | Tocris | 1045 | 20 µM |
LY341495 | Tocris | 1209 | 10 µM |
5, Calcium-free HBS pH=7.3 | |||
NaCl | Sigma | S9888 | 135 mM |
KCl | Sigma | P9333 | 5 mM |
MgCl2 | Sigma | M8266 | 1 mM |
HEPES | Sigma | H3375 | 10 mM |
Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |
6, 56 mM Potassium ACSF pH=7.4 | |||
NaCl | Sigma | S9888 | 119 mM |
KCl | Sigma | P9333 | 56 mM |
MgSO4.7H | Sigma | M1880 | 1.3 mM |
CaCl2 | Sigma | C1016 | 2.5 mM |
NaH2PO4 | Sigma | S8282 | 1 mM |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | 26.2 mM |
Glucose | Sigma | G0350500 | 10 mM |