Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Cycloheximide ניתוח צ'ייס של פירוק חלבונים ב Published: April 18, 2016 doi: 10.3791/53975
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1
1Department of Biology, Ball State University, 2Bioproduct Research & Development, Eli Lilly and Company

Abstract

הסדרת שפע חלבון חיונית כמעט בכל תהליך הסלולר. שפע חלבון משקף את השילוב של שיעורי סינתזת חלבון פירוק חלבונים. מבחני רבים מדווחים על שפע חלבון (למשל, סופג מערבי נקודה חד פעמי, cytometry זרימה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי, או מבחני כתב מבוסס צמיחה) אינו מאפשרים אפליה של ההשפעות היחסיות של תרגום proteolysis על רמות חלבון. מאמר זה מתאר את השימוש של מרדף cycloheximide ואחריו מערבי סופג כדי לנתח את החלבון שפל במפורש eukaryote unicellular המודל, שמר אפייה (שמרים ניצנים). בהליך זה, תאי שמרים מודגרת בנוכחות cycloheximide מעכב translational. Aliquots של התאים נאספים מיד לאחר ובנקודות זמן מסוים לאחר תוספת של cycloheximide. תאים lysed, ואת lysates מופרדים על ידי אלקטרופורזה polyacrylamide ג'ל FOr ניתוח כתם המערבי של שפע חלבון בכל נקודת זמן. הליך מרדף cycloheximide היתרים להדמיה של קינטיקה השפלה של אוכלוסיית המצב היציבה של מגוון של חלבונים תאיים. ההליך ניתן להשתמש כדי לחקור את הדרישות גנטיות והשפעות סביבתיות על פירוק חלבונים.

Introduction

חלבונים לבצע פעולות מכריעות כמעט בכל תהליך הסלולר. תהליכים פיזיולוגיים רבים דורשים נוכחות של חלבון מסוים (או חלבונים) לתקופה מוגדרת של זמן או בנסיבות מיוחדות. אורגניזמים ולכן לפקח ולהסדיר שפע חלבון כדי לענות על צרכים הסלולר 1. לדוגמא, cyclins (חלבונים השולטים חלוקת תא) נוכח בשלבים מסוימים של מחזור התא, ואת אובדן רמות cyclin המוסדרים נקשר עם היווצרות גידולים ממאירים 2. בנוסף ויסות רמות חלבון כדי לענות על צרכים הסלולר, תאים במנגנוני בקרת איכות degradative לחסל misfolded, מוכנות להרכבה, או סוטות אחרת מולקולות חלבון 3. פיקוח על שפע חלבון כרוך הסדרה הן סינתזת macromolecular (שעתוק ותרגום) ושפלה (ריקבון רנ"א proteolysis). פירוק חלבונים פגומים או מוגזם תורם פתולוגיות מרובים, כולל סרטן, סיסטיק פיברוזיס, תנאים ניווניות, והפרעות קרדיו 4-8. מנגנוני פרוטאוליטים ולכן הם בגדר מטרות טיפוליות מבטיחים עבור מגוון של מחל 9-12.

ניתוח של חלבונים בנקודת זמן אחת (למשל, על ידי כתם המערבי 13, cytometry זרימה 14, או פלואורסצנטי מיקרוסקופיה 15) מספק תמונת מצב של שפע חלבון מצב יציב מבלי לחשוף את התרומה היחסית של סינתזה או השפלה. בדומה לכך, מבחני כתב מבוסס צמיחה לשקף את רמות חלבון מצב יציבות על פני תקופת זמן ממושכת בלי להיפלות בין ההשפעות של סינתזת שפלה 15-20. אפשר להסיק את התרומה של תהליכי degradative לרמות חלבון מצב יציב על ידי השוואת שפע לפני ואחרי עיכוב רכיבים ספציפיים של מנגנון degradative (למשל, על ידי פרמקולוגית inactivating והגנה של המחזורasome 21 או לדפוק את גן שיערו להידרש השפלה 13). לשינוי ברמת חלבון מצב יציב לאחר עיכוב מסלולים degradative מספק ראיות חזקות תרומת proteolysis לשליטת שפע חלבון 13. עם זאת, כגון ניתוח עדיין אינו מספק מידע לגבי קינטיקה של מחזור חלבון. מרדף cycloheximide ואחריו מערבי סופג מתגבר חולשות אלה בכך שהוא מאפשר לחוקרים לחזות פירוק חלבונים לאורך זמן 22-24. יתר על כן, כי גילוי חלבונים לאחר מרדף cycloheximide מבוצע בדרך כלל על ידי מערבי סופג, איזוטופים רדיואקטיביים וצעדי immunoprecipitation ממושכים אינם נדרש עבור מרדף cycloheximide, בניגוד טכניקות מרדף דופק רבות נפוצות, אשר מבוצעות גם לדמיין חלבון שפל 25.

Cycloheximide זוהה לראשונה כמתחם עם אנטי פטרייתי נאהקשרים המיוצר על ידי Streptomyces חיידק חיובי גרם griseus 26,27. זוהי מולקולה התא חדיר המעכבת cytosolic איקריוטיים במיוחד (אבל לא organellar) תרגום על ידי פגיעה ריבוזומלי טרנסלוקציה 28-31. בניסוי מרדף cycloheximide, cycloheximide מתווסף תאים, aliquots של התאים נאספים מיד ובנקודות זמן מסוים לאחר תוספת של תרכובת 22. תאים lysed, ושפע חלבון בכל נקודת זמן מנותח, בדרך כלל על ידי כתם המערבי. ירידות שפע חלבונים לאחר תוספת של cycloheximide ניתן לייחס בבטחה פירוק חלבונים. חלבון יציב יקטן בשפע לאורך זמן, בעוד חלבון יציב יחסית יפגין שינוי קטן בשפע.

מנגנוני פירוק חלבונים סלקטיבית כבר שמורים ביותר ברחבי Eukarya. הרבה ממה שידוע על פירוק חלבונים נודע ראשוןeukaryote unicellular המודל, cerevisiae Saccharomyces (שמרים ניצנים) 25,32-36. מחקרים עם שמרים צפויים להמשיך ולספק תובנה רומן וחשובות לתוך פירוק חלבונים. שיטת מרדף cycloheximide בתאי שמרים ואחריו ניתוח כתם המערבי של שפע חלבון מוצגת כאן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

צמיחה 1. קציר של תאים שמרים

  1. אם לא בניתוח קינטיקה השפלה של חלבון שמרים אנדוגני, להפוך זן שמרים הרצוי (ים) עם פלסמיד המקודד את החלבון של עניין. שיטות אמינות לטרנספורמציה שמרים תוארו בעבר 37.
  2. לחסן שמרים ב 5 מ"ל של המדיום המתאים (למשל, מוגדר סינתטי סלקטיבית (SD) בינוני עבור תחזוקה פלסמיד של התאים שהשתנו או שמרים הלא סלקטיבי לחלץ דקסטרוז-peptone (YPD) בינוני עבור תאים שאינם טרנספורמציה). דגירה לילה בשעה 30 ° C, מסתובבת.
    הערה: 30 ° C היא הטמפרטורה לצמיחה אופטימלית עבור זני שמרים מעבדה wild-type טיפוסי 38. עם זאת, בגלל זני שמרי מוטציה כמה לא גדלים בצורה אופטימלית על 30 מעלות צלזיוס וכמה חלבונים עוברים שפלת טמפרטורה תלויה, הטמפרטורות המשמשות צמיחת שמרי תא ולרדוף cycloheximide צריכות להיקבע באופן אמפירי 39.
  3. מדוד הצפיפות הדואר אופטית ב 600 ננומטר (OD 600) של כל תרבות לילה.
    הערה: תאים עשויים להיות בשלב הצמיחה לוגריתמי או נייח אבל צריך מינימלית הגיעו צפיפות שיאפשר דילול ל OD 600 = 0.2 ב 15 מ"ל של מדיום חדש.
  4. לדלל את התרבויות לילה ערך OD 600 של 0.2 ב 15 מ"ל של מדיום חדש.
  5. דגירה שמרים ב 30 מעלות צלזיוס, רועד עד התאים מגיעים לשלב צמיחת אמצע לוגריתמים (כלומר, OD 600 בין 0.8 ו -1.2).
  6. במהלך גדילת תאים שמרים, לבצע את הפעולות הבאות כהכנת הליך מרדף cycloheximide:
    1. הגדר גוש חום שיכול להכיל 15 מ"ל צינורות חרוטי 30 מעלות צלזיוס במשך הדגירה של תאים בנוכחות cycloheximide. מוסיפים מים עד הבארות של גוש חום לאפשר פיזור חום יעיל לתרבויות. מוסיפים מים היטב כל כך צינור חרוטי 15 מ"ל תגרום מפלס המים לעלות, אבל לא עולה על גדותיו, שפת הבאר.
    2. גדר גוש חום שני שיכול להכיל 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge עד 95 מעלות צלזיוס במשך denaturation חלבונים לאחר תמוגה תא.
    3. מדיום גידול טרי טרום חם (1.1 מיליליטר לכל נקודת זמן לכל תרבות להיות assayed) עד 30 מעלות צלזיוס.
    4. הוסף 50 μl 20x עצור מיקס מראש שכותרתו צינורות microcentrifuge (פעם אחת צינור לכל נקודה לכל תרבות להיות assayed). מניחים צינורות על הקרח.
      זהירות: אזיד הנתרן, מרכיב 20x עצור מיקס, הוא רעיל באמצעות בליעה דרך הפה או מגע עורי. פעל על פי המלצות של יצרן בעת ​​הכנה, אחסון והטיפול יזיד הנתרן. במקרה של חשיפה מקרית, להתייעץ גיליון נתוני בטיחות חומרים הניתנים על ידי היצרן.
  7. כאשר תאים הגיעו צמיחת אמצע לוגריתמים, לאסוף 2.5 OD 600 יחידות של כל תרבות לכל נקודת זמן להיות assayed (למשל, 7.5 OD 600 יחידות לנתח שפע חלבון בשלוש נקודות זמן). צנטריפוגה שנאספו התאים צינורות חרוטי 15 מ"ל ב 3,000 XG בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
    הערה: קישור אחד OD 600 היחידה היא שווה לסכום של שמרים נוכח 1 תרבות מ"ל ב OD של 600 1.0. היקף התרבות (ב מיליליטר) נדרשה למסוק יחידות X OD 600 (V) יכול להיקבע באמצעות המשוואה הבאה: V = X OD 600 יחידות / נמדדת OD 600. לדוגמה, כדי לקצור 7.5 OD 600 יחידות של תרבית תאים שמרים OD של 600 1.0, לאסוף 7.5 OD 600 יחידות / 1.0 = 7.5 מ"ל תרבית שמרים.
  8. Resuspend כל גלולה תא 1 מ"ל של 30 ° C (מחומם מראש) מדיום הגידול טריים לכל 2.5 OD 600 יחידות של תאים (למשל, 3 מ"ל תמורת 7.5 OD 600 יחידות).

2. cycloheximide צ'ייס

  1. לאזן השעיות תא שמרים ידי דגירה במשך 5 דקות בתוך הגוש החום 30 מעלות צלזיוס.
  2. כן טיימר לספור למעלה מ 00:00.
  3. כדי להתחיל את מרדף cycloheximide, לחץ על "התחל" על טיימר. מַהֵר,אבל בזהירות, בצע את הפעולות הבאות:
    1. להוסיף cycloheximide לריכוז סופי של 250 מיקרוגרם / מ"ל ההשעיה תא שמרים הראשונה (למשל, להוסיף 37.5 μl של 20 מ"ג / מ"ל המניות cycloheximide עד 3 מ"ל של תרחיף תאים), מערבולת בקצרה לערבב.
      זהירות: cycloheximide הוא מגרה עורי והוא רעיל באמצעות בליעה דרך הפה. פעל על פי המלצות של יצרן בעת ​​הכנה, אחסון וטיפול cycloheximide. במקרה של חשיפה מקרית, להתייעץ גיליון נתוני בטיחות חומרים הניתנים על ידי היצרן.
    2. מיד לאחר הוספת cycloheximide ו vortexing, להעביר 950 μl (~ 2.4 OD 600 יחידות) של ההשעיה תא שמרים עם הוסיף cycloheximide לצינור microcentrifuge מראש שכותרתו המכיל 50 תמהיל μl קר כקרח 20x להפסיק. וורטקס צינור microcentrifuge, ומניח על קרח עד שכל הדגימות נאספו.
    3. החזר את ההשעיה תא שמרים עד 30 מעלות צלזיוס.
  4. חזור על שלבים 2.3.1 דרך 2.3.3 עבור כל אחד השעיות תא שמרים הנותרים במרווחי זמן קבועים (למשל, כל 30 שניות, כך cycloheximide מתווסף לדוגמא # 1 0:00, לדוגמא # 2 ב- 00:30, לדוגמא # 3 בשעה 1:00 , וכו '.).
  5. בכל נקודת זמן לאחר מכן, השעיות תא מערבולת שמרים העברת 950 μl לצינורות microcentrifuge שכותרתו המכיל 50 μl מראש צונן 20x עצור מיקס. וורטקס ותאי שנאספו ומניחים על קרח. חזור 15 מ"ל צינורות חרוטי 30 ° C בבלוק חום.
    1. לדוגמה, עבור אוסף של תאים 30 דקות לאחר תוספת cycloheximide (בהנחה של 30 שניות במרווחים בין בנוסף cycloheximide כדי השעיות תא שמרים בתחילת הקורס הזמן), מערבולת ולהסיר 950 μl של ההשעיה תא ממדגם # 1 ב- 30:00 . חזור על הפעולה עבור לדוגמא # 2 ב- 30:30, וכן הלאה.
      הערה: כדי למנוע התיישבות של שמרים, השעיות תא מערבולת ב 15 מ"ל צינורות חרוטי בערך כל 5 דקות במהלך הקורס של המרדף. לחלופין, השעית תא שמריםהים עשוי להישמר באמבט מי התססה ברציפות למשך ניסוי מרדף cycloheximide.
  6. כאשר כל הדגימות נאספו, גלולה שנאספו התאים על ידי צנטריפוגה ב 6,500 XG בטמפרטורת החדר למשך 30 שניות. הסר את supernatant ידי pipetting או שאיפה. תאים מוכנים כעת תמוגה אלקליין. לחלופין, הצמד להקפיא תאים pelleted בחנקן נוזלי חנות ב -80 ° C.

3. הפקת חלבון פוסט אלקליין (השתנה מ 16,40)

  1. הוספת 100 μl של מים מזוקקים לכל תא גלול. Resuspend ידי pipetting למעלה ולמטה או vortexing.
  2. הוספת 100 μl של 0.2 M NaOH מדגם זה. מערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה או vortexing.
  3. דגירה תאים מושעה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. בשלב זה, תאי שמרים שלא היה lysed, וחלבונים לא שוחררו 40.
  4. תאים גלולים ידי צנטריפוגה ב 18,000 XG ב מזג בחדרature למשך 30 שניות. הסר supernatant ידי pipetting או שאיפה.
  5. כדי lyse תאים, להוסיף 100 μl של חיץ מדגם Laemmli לכל תא גלול. Resuspend ידי pipetting למעלה ולמטה או vortexing.
    הערה: הדגירה סדרתית של תאים עם חלבונים משחרר חיץ מדגם NaOH ו Laemmli בצורה תואמת ג'ל אלקטרופורזה סולפט-polyacrylamide dodecyl נתרן (SDS-PAGE) באמצעות מערכת חיץ ריצה טריס-גליצין.
  6. לדגור על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי לפגל חלבונים באופן מלא.
    הערה: דגירה על 95 מעלות צלזיוס לא יכולה להיות מתאימה ניתוח של חלבונים כי הם מועדים צבירה (למשל, חלבונים עם כמה קטעים הטרנסממברני). חלבונים אלה עשויים להיות מסיסים כאשר מודגרות בטמפרטורות גבוהות 41. לכן, לצורך ניתוח של חלבונים כאלה, lysates צריך להיות מודגרות בטמפרטורות נמוכות (למשל, 37 ° C - 70 ° C) במשך 10 - 30 דקות, כפי שנקבע באופן אמפירי.
  7. lysates צנטריפוגה ב 18,000 XG ב roטמפרטורת om דקות 1 עד גלולת חומר מסיס. Supernatant (חלבון חילוץ solubilized) מוכן להפרדה על ידי SDS-PAGE וניתוח כתם המערבי לאחר מכן. לחלופין, lysates ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.

4. נציג SDS-PAGE ונוהל המערבי סופג (מעובד מתוך 16)

  1. חלבון טען סטנדרטים משקל מולקולרי ונפח לקבוע באופן אמפירי של lysates על ג'ל SDS-PAGE.
    הערה: בחר את אחוז acrylamide ו bis-acrylamide ב ג'ל SDS-PAGE לפי המשקל המולקולרי של החלבון של עניין. באופן כללי, ג'לים שיעור נמוך מתאימים יותר לפתרון חלבונים בעלי משקל מולקולרי גבוה.
  2. ג'ל לרוץ 200 V עד בחזית לצבוע הגיע לקצה התחתון של ג'ל.
  3. עבר חלבונים מן ג'ל פלואוריד polyvinylidene (PVDF) קרום בהעברה רטובה ב 20 V 60 - 90 דק 'ב 4 ° C..
  4. חסום הממברנה על ידי דוגרי טריס-בופר (TBS) המכיל 5% חלב רזה, נדנדה, בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 או 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    הערה: כדי למנוע התפתחותם של חיידקים בנוכחות קרום מודגרות לילה, מומלץ לכלול אזיד הנתרן הפתרון חוסם בריכוז סופי של 0.02%.
  5. דגירה הממברנה עם נוגדן ראשוני ספציפי לחלבון של עניין TBS עם 0.1% Tween-20 (TBS / T) וחלב 1% דל שומן, נדנדה, בטמפרטורת החדר למשך שעה 1.
  6. לשטוף קרום בטמפרטורת החדר 3 x 5 דקות עם TBS / T, נדנדה.
  7. דגירה הממברנה עם נוגדן משני fluorophore מצומדות מתאים TBS / T עם חלב דל שומן 1% בטמפרטורת חדר למשך שעה 1, נדנדה.
    הערה: fluorophores הוא רגיש לאור. לכן, דילולים של נוגדנים מצומדות כדי fluorophores צריך להיות מוכן בחושך, ו הדגירה של ממברנות בנוכחות נוגדנים מצומדות כדי fluorophores וצעדים לשטוף לאחר מכן אמור להתרחש ב lightproof (למשל, עטופה בנייר כסף) במשותףntainers.
  8. לשטוף קרום בטמפרטורת החדר 3 x 5 דקות עם TBS / T, נדנדה.
  9. קרום תמונה באמצעות LI-COR אודיסיאה CLX ותוכנה סטודיו תמונה (או ציוד הדמיה להשוות ותוכנה), בעקבות המלצות היצרן.
  10. לאחר רכישת התמונה קרום, דגירה הממברנה עם נוגדן ראשוני ספציפי עבור חלבון טעינה מלאה ב TBS / T עם 1% חלב דל שומן בטמפרטורת החדר למשך שעה 1, נדנדה.
  11. לשטוף קרום בטמפרטורת החדר 3 x 5 דקות עם TBS / T, נדנדה.
  12. דגירה הממברנה עם נוגדן משני fluorophore מצומדות מתאים TBS / T עם חלב דל שומן 1% בטמפרטורת חדר למשך שעה 1, נדנדה.
  13. לשטוף קרום בטמפרטורת החדר 3 x 5 דקות עם TBS / T, נדנדה.
  14. קרום תמונה כמו בשלב 4.9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להמחיש מתודולוגיה מרדף cycloheximide, יציבות Deg1 -Sec62 (איור 1), reticulum endoplasmic שמרים מודל (ER) השפלה -associated (ERAD) המצע, נותח 42-44. בשנת ERAD, אנזימי אנזים היוביקוויטין בקרה איכות לצרף קוולנטית שרשרות של היוביקוויטין החלבון הקטן לחלבונים סוטים המקומיים על קרום ER. חלבונים polyubiquitylated כזה ובהמשך יוסרו מן ER ו מושפל על ידי הפרוטאזום, פרוטאז גדול, cytosolic 45. חלבון Deg1 -Sec62 מיועד שפלה לאחר בהתמדה aberrantly מעסיק את translocon, ערוץ המאפשר טרנסלוקציה חלבון לתוך לומן ER או קרום 43. באופן דומה, B אפוליפופרוטאין היונק, מרכיב חלבון של ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה, בהתמדה עוסק המיון translocon ובהמשך עובר שפלה ידי מנגנון הקשור כאשר השפות שלהid שותפים מחייבים נעדרים 46-48. לפיכך, מנתח של השפלה Deg1 -Sec62 בתאי שמרים עשוי להניב תובנות לגבי פירוק של חלבונים כי בהתמדה או aberrantly להעסיק את translocon, כינה זמני ERAD-T (עבור הקשורים translocon) מצעים 43.

מחקרים קודמים הראו כי פונקציות Hrd1 האנזים היוביקוויטין ER-תושב עם Ubc7 אנזים conjugating היוביקוויטין לזרז השפלה של Deg1 -Sec62 16,42-44. החלבון הטרנסממברני Cue1 מעגן Ubc7 קרום ER ומפעיל את האנזים 49-51. עם זאת, דרישה Cue1 ב השפלת Deg1 -Sec62 עוד לא נחקר ישירות. כדי לבדוק את ההשערה כי Cue1, כמו Hrd1 ו Ubc7, נדרש השפלה יעיל של Deg1 -Sec62, סוג-בר בתאי שמרים מוטציה לבטא Deg1 -Sec62 היו נתונים cycloheximide המרדף ווסניתוח כתם שחפייה (איור 2 א). חלבון Deg1 -Sec62 נודד על SDS-PAGE כמו מינים רבים. זה עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים המעידים שינוי שלאחר translational נרחב של החלבון 43,44,52. בתאי שמרים wild-type, Deg1 -Sec62 היה מושפל בקלות. כפי שנצפה קודם לכן, אובדן או Hrd1 או Ubc7 משמעותי התייצב החלבון Deg1 -Sec62 42-44. כצפוי, Deg1 -Sec62 התייצב בהעדר Cue1 (במידה דומה לזו בהעדר Ubc7), המאשר תפקיד החלבון Ubc7-אינטראקציה ERAD-T.

חלקם של חלבון Deg1 -Sec62 הנותר בכל נקודת זמן היה לכמת והוא זמם באיור 2B. נציין כי שיעור ניכר של היעלמות Deg1 -Sec62 ב wild-type תאים עשויה להיות נמוכה מדי של קצב הפירוק של המתהווה Deg1 -Sec62(כלומר, זמן מחצית החיים של החלבון, אשר יכול להיקבע באופן ישיר ביותר על ידי ניתוח מרדף דופק 43). מכיוון שמרים wild-type פעיל לבזות את חלבון Deg1 -Sec62 לפני תוספת cycloheximide, שפע המצב היציב של Deg1 -Sec62 מצטמצם באופן משמעותי בתאים אלה (לעומת התאים בהם השפלה נפגעת). זה יכול להיות מוערך על ידי השוואת שפע של Deg1 -Sec62 בנקודות הזמן הראשוני עבור כל זן ב איור 2 א. יתר על כן, כל תת-אוכלוסייה שפלה עמידה של חלבון המצע (למשל, אם החלבון מצטבר ברכות תאיות שממנו השפלה נמנעת) עשויה להיראות יציבה יחסית wild-type תאים במשך זמן הניסוי.

איור 1
דגם איור 1. ביזוי של Deg1 -Sec62 הבאים אירוסין Aberrant של Translocon (א) תיאור סכמטי של Deg1 -Sec62 Deg1 -Sec62 מכיל את הפריטים הבאים, ברצף:.. Deg1 (חומצות אמינו מסוף 67 אמינו מן מדכא שמרים תעתיק MATα2), דגל (F) epitope, חלבון 2-הטרנסממברני Sec62, ושני עותקים של חלבון Staphylococcus aureus (PRA). (ב) בעקבות החדרה נורמלית שיתוף translational של המגזרים שני הטרנסממברני שלה לתוך reticulum endoplasmic (ER) הקרום, עמותה מתמיד של Deg1 -Sec62 עם translocon מפעילה נורמלי, Deg1 תלוי, שלאחר translational אירוסי translocon. חלק מן התחנה הסופית אמינו cytosolic aberrantly נכנס-ונשאר סביר בתוך-the translocon. (C) בעקבות מעורבות translocon, את האנזים היוביקוויטין Hrd1 ubiquitylates Deg1 -Sec62. Hrd1 נעזרת האנזים conjugating היוביקוויטין Ubc7, המעוגן בקרום ER ידי Cue1. UB, מונומרים חלבון היוביקוויטין. (ד) Ubiquitylated Deg1 -Sec62 מופק הממברנה ER ו מושפל על ידי הפרוטאזום, להקלה על חסימה translocon. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. cycloheximide צ'ייס ואחריו מערבי סופג מציין כי Cue1 נדרש שפלת Deg1 -Sec62 יעילה. (א) תאים שמרים של גנוטיפים הצביע שהוסבו עם קידוד פלסמיד שמרים centromeric Deg1 -Sec62 (pRS416-P MET25 - Deg1 -Flag-Sec62-2xProtA; AmpR / URA3 43) ו נתון ניתוח מרדף cycloheximide. חֶלְבּוֹןs מ בכל נקודת זמן (שווה ערך ל 0.125 OD 600 יחידות) הופרדו על ג'ל 8% SDS-PAGE ו זוהה על ידי המערבי סופג עם נוגדנים משני אנטי עכבר ארנב, המשפיעה ישירות לאגד את אפיטופים חלבון C-terminal של Deg1 - חלבון היתוך Sec62. כביקורת טעינה, הקרום ובהמשך הודגר עם נוגדנים ספציפיים Pgk1. ניסוי זה כבר משוכפל שלוש פעמים; תוצאות נציגים הן בתמונה. (ב) כימות של נתונים (א) בוצע באמצעות תוכנת הדמיה (ראה טבלה של חומרים). עוצמת הקרינה הכוללת של שטח המקיף את חלבון Deg1 -Sec62 נקבעה עבור כל דגימה. רקע עוצמת הקרינה עבור כל דגימה היה להסיק מעוצמת הקרינה הממוצעת של פיקסלים ליד חלבון Deg1 -Sec62. עוצמת קרינת רקע אקסטרפולציה זו מפחיתה את עוצמת הקרינה הכוללת להניב fluoresc המתואם עוצמת ence עבור כל דגימה. quantifications הדומה הכולל, רקע, ואת עוצמות קרינה מתואמות בוצע Pgk1, חלבון טעינה מלא אשר השפע אינו משתנה בתנאי assayed. כדי להשוות את השפע של חלבון Deg1 -Sec62 בקרב מדגמים, יחס של עוצמת האות המותאמת של Deg1 -Sec62 כדי Pgk1 נקבע עבור כל דגימה. יחס Deg1 -Sec62 / Pgk1 הוגדר 100% עבור הנקודה לראשונה (כלומר, מייד לאחר תוספת cycloheximide) עבור כל זן תחת ניתוח. כמות Deg1 -Sec62 הנותרת בנקודות זמן עוקבות (כלומר, יחסי Deg1 -Sec62 / Pgk1) חושבו כאחוז יחס Deg1 -Sec62 / Pgk1 בנקודת הזמן הראשונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

יפ-עם-next.within-page = "תמיד">
מוגדר סינטטי (SD) בינוני שמרים מינימאלי 2% דקסטרוז, בסיס חנקן שמרים 0.67% ללא חומצות אמינו, 0.002% אדנין, אורציל 0.004%, 0.002% ארגינין, 0.001% היסטידין, 0.006% isoleucine, 0.006% לאוצין, 0.004% ליזין, 0.001% מתיונין, 0.006 פנילאלנין%, 0.005 תראונין%, 0.004% טריפטופן. לקבלת בינוני מוצק (צלחת), כולל אגרו 2%. 1. בינוני סלקטיבי הוא הוכן על ידי השמטת חומצת אמינו המתאים (ים) או בסיסים חנקניים.
2. לנוחיותכם, מרכיבים אלו עשויים להיות מתוחזקים ככאלה פתרונות מניות מרוכזים כדלקמן. עשויות להישמר חומצות אמינו כפתרון 100x מניות המכיל את כל חומצות האמינו הרצויות. בסיס חנקן שמרים עשוי להישמר פתרון 20x מניות (13.4%). דקסטרוז עשוי להישמר פתרון המניות 40%. אדנין ו אורציל עשוי להישמר כפתרונות המניה 1% ב 0.1 M NaOH.
3.לעקר בינוני ידי מעוקר.
חלץ-Peptone שמרים דקסטרוז (YPD) ריץ 'שמרים בינוני 1% תמצית שמרים, 2% peptone, 2% דקסטרוז (אופציונלי: 0.002% אדנין). לקבלת בינוני מוצק (צלחת), כולל אגרו 2%. 1. כדי למנוע צמיחה איטית מאפיין צבע אדום של זני שמרים מעבדה בפרט בהעדר (או שפע נמוך) של אדנין, אדנין ניתן להוסיף מדיום הגידול YPD.
2. להנוחיות, כמה מרכיבים עשויים להישמר כמו פתרונות מניות מרוכזים כדלקמן. דקסטרוז עשוי להישמר פתרון המניות 40%. אדנין עשוי להישמר כפתרון מניות 1% ב 0.1 M NaOH.
3. לעקר בינוני ידי מעוקר.
20x העצור Mix 200 מ"מ אזיד הנתרן, 5 מ"ג / מ"ל ​​אלבומין בסרום שור אזיד הנתרן הוא רעיל באמצעות בליעה דרך הפה או מגע עורי. עקוב יצרןהמלצות בעת הכנת, אחסון וטיפול אזיד הנתרן. במקרה של חשיפה מקרית, להתייעץ גיליון נתוני בטיחות חומרים הניתנים על ידי היצרן.
20 מ"ג / מ"ל cycloheximide 1. הכינו באתנול. חנות ב -20 מעלות צלזיוס.
2. cycloheximide הוא מגרה עורי והוא רעיל באמצעות בליעה דרך הפה. פעל על פי המלצות של יצרן בעת ​​הכנה, אחסון וטיפול cycloheximide. במקרה של חשיפה מקרית, להתייעץ גיליון נתוני בטיחות חומרים הניתנים על ידי היצרן.
0.2 M נתרן הידרוקסידי הכן במים. הידרוקסיד הנתרן מגיב עם זכוכית. לכן, עבור אחסון לטווח ארוך, 0.2 M נתרן הידרוקסידי צריך להישמר במכלי פלסטיק.
חיץ מדגם Laemmli 2% SDS, 10% גליצרול, 5% &# 946; -mercaptoethanol, 60 מ"מ טריס HCl pH 6.8, 0.008% bromophenol כחול 1. חיץ מדגם Laemmli לעתים קרובות הוא הוכן על ידי דילול מרוכז יותר (למשל, 5x) מניות.
2. כחול צבע bromophenol ניתן להוסיף בעוצמה הרצויה. A "קמצוץ" (כמות קטנה מאוד טפח מקצה מרית) הוא בדרך כלל מספיק.
Laemmli הפעיל מאגר (5x) 125 מ"מ טריס, 960 גליצין מ"מ, 0.5% SDS כדי להכין 1 ליטר של 1x Laemmli הפעלת מאגר, לדלל 1: 5 ב DH 2 O.
טריס Acetate-SDS העברת חוצץ (5x) 125 מ"מ טריס אצטט (pH 8.8), 960 גליצין מ"מ, 0.05% SDS כדי להכין 20 ליטר של 1x טריס Acetate-SDS עבר הצפה, לשלב 4 ליטר של מניית 5x, 4 ליטר של מתנול, ו -12 ליטר של DH 2 O.
10x טריס שנאגרו מלוחים (TBS) 500 מ"מ טריס, 1.5 M NaCl; pH מותאם 7.5 כדי להכין 1 ליטר של TBS 1x, לדלל 1:10 ב DH 2 O. 1x TBS ניתן להשלים עם Tween-20 חומרי ניקוי חלב דל שומן אבקת, לפי העניין.

פתרונות לוח 1. השתמשו במחקר זה.

שם זנים כינוי גנוטיפ רלוונטי הפניות
VJY42 MHY501 MATα חן et al., 1993
his3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
VJY47 YWO55; MHY507 MATα Jungmann et al, 1993.; רובינשטיין ואח '. 2012
his3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
ubc7Δ :: LEU2
VJY56 YTX105; MHY1364 MATα Biederer ואח ', 1997.; רביד et al., 2006
his3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
cue1Δ :: HIS3
VJY172 MHY6199 MATα מחקר זה
his3-Δ200
leu2-3,112
ura3-52
lys2-801
trp1-1
gal2
hrd1Δ :: kanMX4

טבלה 2. זני שמרים השתמשו במחקר זה. זנים כולם congenic עם MHY500 53. VJY42, VJY47, ו VJY56 תוארו בעבר 49,53,54. דור זן מפורט ואסטרטגית אישור עבור VJY172 (שהוכן עבור מחקר זה) זמין על פי בקשה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במאמר זה, שיטה לניתוח קינטיקה פירוק חלבונים מוצגת. טכניקה זו יכולה בקלות להיות מיושמת מגוון של חלבונים מושפלים על ידי מגוון של מנגנונים. חשוב לציין כי ניסויי cycloheximide מרדף לדווח על קינטיקה השפלה של ברכת המצב היציבה של חלבון נתון. טכניקות אחרות ניתן להשתמש כדי לנתח את קינטיקה השפלה של אוכלוסיות ספציפיות של חלבונים. לדוגמא, גורל degradative של פוליפפטידים המתהווה יכול להיות מועבר על ידי ניתוח מרדף דופק 55. בניסויים כאלה, חלבונים המתהווה הם הדופק שכותרתו בקצרה (למשל, עם חומצות אמינו רדיואקטיבי). שינויי השפע של חלבונים המתהווים שכותרתו (אשר עשוי או לא עשוי לשקף שינויים בשפע חלבון מצב יציב) עשויים להיות במעקב לאורך זמן.

מרדף cycloheximide מתאים לניתוח יציבות חלבון מעל קורס זמן קצר יחסית (כלומר, עד שעתיים). במהלך זמן רב יותר גourses (כלומר, שתי שעות עד ימים), cycloheximide, מעכב העולמי של התרגום, הוא רעיל לתאים, כנראה עקב דלדול של היוביקוויטין 56. יתר על כן, מנתח של יציבות חלבון מעל קורסים כבר זמן יש סיכוי גבוה יותר להיות בסכנה על ידי השפעות עקיפות של סינתזת חלבון לקויה גלובלי על השפלה של החלבון של עניין (למשל, שפלה של חלבון קצר מועד מעורב השפלה של החלבון של ריבית). טכניקות אחרות, כגון ניסויי תיוג דופק מרדף מטבולית, ולכן הם מתאימים יותר ללימוד הפירוק של חלבונים ארוכים חיות ניתן לבצע כדי לאשש תוצאות שהתקבלו בניסויי מרדף cycloheximide.

העיתוי של תוספת של cycloheximide וגביית התאים הוא שיקול חשוב בהליך זה. Precision חשוב במיוחד בניתוח חלבונים מאוד קצרי מועד, כפי סטיות קטנות בזמן שחלף מן addi cycloheximidetion כדי קציר תא יכול להיות השפעה מהותית על קינטיקה שפלה נראית לעין. יתר על כן, ללא תכנית ברורה לביצוע שלבי הזמן רגיש אלה, ניסוי ועובר במהירות לתוך כאוס ותסכול. מסיבה זו, מומלץ להוסיף cycloheximide לתרבויות בבית, במרווחי זמן קבועים המתוכננים. במרווחים של 30 שניות הם הציעו בפרוטוקול זה, אבל העיתוי עשוי להיות מותאם כדי להתאים את רמת הנוחות ומיומנות של החוקר. חוקרי מחשב שניים עלולים למצוא את זה שימושי כדי לכתוב את לוח זמנים של פעמי אוסף מדגם לפני שתזם את הניסוי לחצות את כל גבייה רגילה כפי שהוא מתרחש.

בצעדי 1.7 ו -1.8 של הפרוטוקול המתואר כאן, תרביות תאי שמרים מרוכזות כרכים מופחתים של מדיום גידול על מנת להקל על המניפולציה במהלך הליך מרדף cycloheximide שלאחר מכן. עם זאת, צנטריפוגה של תאים שמרים גורמת תגובות דחק תאיים מסוימות במהירות (למשל, מסלולי איתות כימופעלים על ידי מניעת גלוקוז) 57,58. חוקרים ולכן מוזהרים מפני תקופות ממושכות של צנטריפוגה. כאשר מנתחים את היציבות של חלבונים שעשויות להיות רגיש צנטריפוגה, חוקרים מומלצים להוסיף cycloheximide ישירות תרבויות שלב אמצע יומן ללא צנטריפוגה מוקדמת. במקרים כאלה, יש להוסיף cycloheximide לאותו הריכוז הסופי (250 מיקרוגרם / מ"ל), דגימות תא שמרים ניתן לקצור ידי מתודולוגיות שאינם דורשים צעד צנטריפוגה הראשוני (למשל, סינון מהיר) 57. יתר על כן, צעדים 2.3 - 2.5, דגימות שנאספו בכל נקודת זמן מועברים תמיסה המכילה אזיד הנתרן והניח על הקרח. תנאים אלה אינם מאפשרים המשך פירוק חלבונים למשך המרדף. יצוין כי אזיד מפחית את ריכוז הסלולר של 59 ATP, ובכך במיוחד עיכוב פעילות של פרוטאזות תלוי ATP. בעוד טמפרטורה נמוכה במקרה בוסימפוני להפחית את הקצב שבו הלא תלוי ATP פונקצית תהליכים פרוטאוליטים, חוקרים לומדים חלבונים מושפלים על ידי מנגנונים כאלה יכולים לבחור לחלופין לצלם להקפיא כדורי תא בחנקן נוזלי כמו כל דגימה היא שנקטפה.

פרוטוקול מדגם עבור תמוגה תא פרוטוקול נציג מערבי סופג כלול בכתב היד הזה הותאם מדוחות קודמות 16,40. בשיטת תמוגה שלאחר אלקליין המתואר כאן, מקדים NaOH משפר חילוץ של חלבונים שמרימים על התוספת הבאה של חיץ מדגם Laemmli. המנגנון שבאמצעותו שיפור זה מתרחש גרוע מאופיין 40. עם זאת, סוכרים כמו אלה שנמצאו בקירות תא שמרים הם solubilized בתנאים אלקלי 60. לפיכך הוא מפתה להיכנס להשערות הדגירה כי בנוכחות של NaOH באופן חלקי או מוחלט spheroplasts תאי שמרים (כלומר, מסיר רכיבים דופן התא), ההופך אותן יותר sensitivדואר ועד ימינו דטרגנט SDS למאגר מדגם Laemmli. בגלל חלבונים משתחררים בתנאי denaturing מאוד, מעכבי פרוטאז לא צריכים להיכלל במאגר מדגם Laemmli. השיטה הספציפית של תמוגה תא עשויה להיות שונה בהתאם בניסוי נתון. למשל, שיטת תמוגה שלאחר אלקליין לא יכולה להיות מתאימה חלבונים נמוך שפע או חלבונים מזוהים כהלכה על ידי כתם מערבי. במקרים כאלה, שיטות הכוללות צעד ממטרי חומצת trichloroacetic להתרכז דגימות חלבון עשוי להיות מתאימים ביותר 61. יתר על כן, כמה שיקולים חשובים לגבי בחירת נוגדנים, בחירת טעינה מלאה, ו אמצעים חלופיים איתור (למשל, מערבי סופגים chemiluminescent באמצעות מערכות סרט או הדמיה דיגיטלית) כבר מזמן דברו 16. כימות של שפע חלבונים לאחר טיפול cycloheximide עשויה להתבצע. מערכות הדמיה רבות נמכרות עם חבילות תוכנה המאפשרותניתוח זה.

מרדף cycloheximide יכול להיות מיושם על מנת לנתח את ההשפלה של מגוון של חלבונים שמרים וניתן להתאימו לחקר יציבות חלבון בתאים איקריוטיים אחרים. כפי שתואר בפרוטוקול זה, הטיפול cycloheximide ואחריו תא תמוגה וזיהוי של שפע חלבון על ידי ניתוח כתם המערבי. בהתאם ליישום, אולם שפע חלבונים לאחר טיפול cycloheximide ניתן להעריך על ידי מגוון של טכניקות, בהתאם למטרות מחקר. לדוגמה, אם גודל החלבון אינו גורם רלוונטי לניתוח, lysates תא עשוי להיות חשוף כתם נקודה או assay immunosorbent enzyme-linked (ELISA) ניתוח, אשר מדווחים על שפע חלבונים, אבל לא 62 משקל מולקולרי לעין. עבור חלבונים על פני התא (או fluorescently הפנימי מתויג חלבונים פנימיים), cytometry זרימה ניתן להשתמש כדי לכמת שפע חלבון של דגימות בזמנים שונים לאחר תוספת cycloheximide 51. Fluoטיפול מיקרוסקופיה rescence cycloheximide הבא יספק מידע משני שפע החלבון ולוקליזציה 18. מגוון מצעים, אורגניזמים, או במורד יישומים מקובלים מרדף cycloheximide שהופך את הטכניקה אמצעי צדדי אינפורמטיבי מאוד של לימוד פירוק חלבונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components
Disposable borosilicate glass tubes Fisher Scientific 14-961-32 Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) Dot Scientific 51028068 Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) New Brunswick M1053-0450 A tube roller is recommended to maintain overnight  starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120 V 50/60 H New Brunswick M1053-4004 For use with tube roller
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad 170-2525 Available from a variety of manufacturers
Centrifuge 5430 Eppendorf 5427 000.216  Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 and 50 ml conical tubes
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place Eppendorf F-35-6-30
15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene Sarstedt 62.554.205 Available from a variety of manufacturers
1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes Eppendorf 22364120 Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath Heaters Fisher Scientific 1172011AQ It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 °C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins.
Heating block for 12 x 15 ml conical tubes Fisher Scientific 11-473-70 For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide.
Heating block for 20 x 1.5 ml conical tubes Fisher Scientific 11-718-9Q For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation.
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane Will vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) Li-Cor 9140-01 Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes Fisher Scientific IPFL00010 Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) Life Technologies 459250 Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L)) Life Technologies A-21065 Will vary by lab and application

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jankowska, E., Stoj, J., Karpowicz, P., Osmulski, P. A., Gaczynska, M. The proteasome in health and disease. Cur Pharm Des. 19 (6), 1010-1028 (2013).
  2. Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nat Rev Cancer. 6 (5), 369-381 (2006).
  3. Amm, I., Sommer, T., Wolf, D. H. Protein quality control and elimination of protein waste: the role of the ubiquitin-proteasome system. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 182-196 (2014).
  4. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426 (6968), 895-899 (2003).
  5. Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiol Rev. 92 (2), 537-576 (2012).
  6. Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circ Res. 112 (7), 1046-1058 (2013).
  7. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
  8. Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochem. 8 Suppl 1, S11 (2007).
  9. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 10 (1), 29-46 (2011).
  10. Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Curr Pharm Des. 19 (18), 3175-3189 (2013).
  11. Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30 (11-12), 1172-1184 (2008).
  12. Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opin Ther Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
  13. Crowder, J. J., et al. Rkr1/Ltn1 Ubiquitin Ligase-Mediated Degradation of Translationally Stalled Endoplasmic Reticulum Proteins. J Biol Chem. 290 (30), 18454-18466 (2015).
  14. Gardner, R. G., et al. Endoplasmic reticulum degradation requires lumen to cytosol signaling. Transmembrane control of Hrd1p by Hrd3p. J Cell Biol. 151 (1), 69-82 (2000).
  15. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283 (47), 32302-32316 (2008).
  16. Watts, S. G., Crowder, J. J., Coffey, S. Z., Rubenstein, E. M. Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J Vis Exp. (96), e52428 (2015).
  17. Cohen, I., Geffen, Y., Ravid, G., Ravid, T. Reporter-based growth assay for systematic analysis of protein degradation. J Vis Exp. (93), e52021 (2014).
  18. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25 (3), 533-543 (2006).
  19. Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. J Biol Chem. 283 (24), 16374-16383 (2008).
  20. Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Rep. 5 (7), 692-697 (2004).
  21. Habeck, G., Ebner, F. A., Shimada-Kreft, H., Kreft, S. G. The yeast ERAD-C ubiquitin ligase Doa10 recognizes an intramembrane degron. J Cell Biol. 209 (2), 261-273 (2015).
  22. Tran, J. R., Brodsky, J. L. Assays to measure ER-associated degradation in yeast. Methods Mol Biol. 832, 505-518 (2012).
  23. Kao, S. H., et al. GSK3beta controls epithelial-mesenchymal transition and tumor metastasis by CHIP-mediated degradation of Slug. Oncogene. 33 (24), 3172-3182 (2014).
  24. Hampton, R. Y., Rine, J. Regulated degradation of HMG-CoA reductase, an integral membrane protein of the endoplasmic reticulum, in yeast. J Cell Biol. 125 (2), 299-312 (1994).
  25. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61 (4), 697-708 (1990).
  26. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6 (3), 209-217 (2010).
  27. Whiffen, A. J., Bohonos, N., Emerson, R. L. The Production of an Antifungal Antibiotic by Streptomyces griseus. J Bacteriol. 52 (5), 610-611 (1946).
  28. Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).
  29. Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
  30. Kerridge, D. The effect of actidione and other antifungal agents on nucleic acid and protein synthesis in Saccharomyces carlsbergensis. J Gen Microbiol. 19 (3), 497-506 (1958).
  31. Chakrabarti, S., Dube, D. K., Roy, S. C. Effects of emetine and cycloheximide on mitochondrial protein synthesis in different systems. Biochem J. 128 (2), 461-462 (1972).
  32. Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. EMBO J. 11 (8), 3077-3080 (1992).
  33. Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA. 311 (19), 1969-1970 (2014).
  34. Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. EMBO J. 10 (3), 555-562 (1991).
  35. Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365 (6442), 176-179 (1993).
  36. Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273 (5282), 1725-1728 (1996).
  37. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protoc. 2 (1), 31-34 (2007).
  38. Bergman, L. W. Growth and maintenance of yeast. Methods Mol Biol. 177, 9-14 (2001).
  39. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Degradation of subunits of the Sec61p complex, an integral component of the ER membrane, by the ubiquitin-proteasome pathway. EMBO J. 15 (9), 2069-2076 (1996).
  40. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
  41. Sharma, M., Benharouga, M., Hu, W., Lukacs, G. L. Conformational and temperature-sensitive stability defects of the delta F508 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in post-endoplasmic reticulum compartments. J Biol Chem. 276 (12), 8942-8950 (2001).
  42. Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. EMBO J. 17 (12), 3251-3257 (1998).
  43. Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. J Cell Biol. 197 (6), 761-773 (2012).
  44. Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. J Cell Biol. 181 (7), 1095-1105 (2008).
  45. Thibault, G., Ng, D. T. The endoplasmic reticulum-associated degradation pathways of budding yeast. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (12), (2012).
  46. Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. J Biol Chem. 272 (33), 20427-20434 (1997).
  47. Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. J Biol Chem. 276 (1), 541-550 (2001).
  48. Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35 (43), 13843-13848 (1996).
  49. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Role of Cue1p in ubiquitination and degradation at the ER surface. Science. 278 (5344), 1806-1809 (1997).
  50. Metzger, M. B., et al. A structurally unique E2-binding domain activates ubiquitination by the ERAD E2, Ubc7p, through multiple mechanisms. Mol Cell. 50 (4), 516-527 (2013).
  51. Bazirgan, O. A., Hampton, R. Y. Cue1p is an activator of Ubc7p E2 activity in vitro and in vivo. J Biol Chem. 283 (19), 12797-12810 (2008).
  52. Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. J Cell Biol. 172 (2), 211-219 (2006).
  53. Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74 (2), 357-369 (1993).
  54. Jungmann, J., Reins, H. A., Schobert, C., Jentsch, S. Resistance to cadmium mediated by ubiquitin-dependent proteolysis. Nature. 361 (6410), 369-371 (1993).
  55. Tansey, W. P. Pulse-chase assay for measuring protein stability in yeast. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
  56. Hanna, J., Leggett, D. S., Finley, D. Ubiquitin depletion as a key mediator of toxicity by translational inhibitors. Mol Cell Biol. 23 (24), 9251-9261 (2003).
  57. Wilson, W. A., Hawley, S. A., Hardie, D. G. Glucose repression/derepression in budding yeast: SNF1 protein kinase is activated by phosphorylation under derepressing conditions, and this correlates with a high AMP:ATP ratio. Curr Biol. 6 (11), 1426-1434 (1996).
  58. Ashe, M. P., De Long, S. K., Sachs, A. B. Glucose depletion rapidly inhibits translation initiation in yeast. Mol Biol Cell. 11 (3), 833-848 (2000).
  59. Grant, C. M., MacIver, F. H., Dawes, I. W. Mitochondrial function is required for resistance to oxidative stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 410 (2-3), 219-222 (1997).
  60. Javmen, A., et al. beta-Glucan from Saccharomyces cerevisiae Induces IFN-gamma Production In Vivo in BALB/c Mice. In Vivo. 29 (3), 359-363 (2015).
  61. Link, A. J., LaBaer, J. Trichloroacetic acid (TCA) precipitation of proteins. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (8), 993-994 (2011).
  62. Hornbeck, P. V. Enzyme-Linked Immunosorbent Assays. Curr Protoc Immunol. 110, 2.1.1-2.1.23 (2015).

Tags

ביוכימיה גיליון 110, נבגי שמרים מוטנטים השפלה הרטיקולום הקשורים endoplasmic פירוק חלבונים מרדף cycloheximide translocon מערכת הפרוטאזום היוביקוויטין
Cycloheximide ניתוח צ&#39;ייס של פירוק חלבונים ב<em&gt; שמר האפייה</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Buchanan, B. W., Lloyd, M. E.,… More

Buchanan, B. W., Lloyd, M. E., Engle, S. M., Rubenstein, E. M. Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (110), e53975, doi:10.3791/53975 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter