Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

التنبؤ والتحقق من جين تنظيم عناصر المنشط خلال الريتينويك حمض المستحثة الجنينية الجذعية تمايز الخلايا

Published: June 21, 2016 doi: 10.3791/53978
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1,2,3
1Sanford-Burnham-Prebys Medical Discovery Institute at Lake Nona, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Research Center for Molecular Medicine, Medical and Health Science Center, University of Debrecen, 3MTA-DE “Lendulet” Immunogenomics Research Group, University of Debrecen
* These authors contributed equally

Abstract

التطور الجنيني هي عملية متعددة الخطوات التي تنطوي على التنشيط وقمع العديد من الجينات. ومن المعروف أن عناصر محسن في الجينوم للمساهمة في الأنسجة والخلايا من نوع قواعد محددة في التعبير الجيني أثناء تمايز الخلايا. وهكذا، وتحديد وإجراء مزيد من التحقيق مهم من أجل فهم كيفية تحديد مصير الخلية. تكامل البيانات التعبير الجيني (على سبيل المثال، ميكروأري أو RNA وما يليها)، ونتائج لونين مناعي (رقاقة) المستندة إلى دراسات الجينوم على نطاق (رقاقة وما يليها) يسمح بتحديد نطاق واسع في هذه المناطق التنظيمية. ومع ذلك، التحقق من صحة وظيفية من الخلايا من نوع القدرة محددة يتطلب المزيد في المختبر والإجراءات التجريبية الجسم الحي. نحن هنا تصف كيف يمكن تحديد القدرة الفعالة والتحقق من صحتها تجريبيا. وينص هذا البروتوكول على سير العمل خطوة بخطوة تشمل ما يلي: 1) تحديد المناطق التنظيمية من خلال تحليل البيانات الشذرة وما يليها، 2) الاستنساخ وEXPERالتحقق من صحة imental من الإمكانات التنظيمية المفترضة للتسلسل الجينوم المحددة في مقايسة مراسل، و 3) تحديد النشاط محسن في الجسم الحي عن طريق قياس مستوى نسخة محسن الحمض النووي الريبي. وترد تفاصيل بروتوكول قدمت ما يكفي لمساعدة أي شخص لإعداد هذا العمل في المختبر. وجدير بالذكر أن بروتوكول يمكن أن تتكيف بسهولة واستخدامها في أي نظام نموذجي الخلوية.

Protocol

1. محسن الاختيار على أساس تحليل رقاقة وما يليها

  1. تحميل RXR رقاقة وما يليها ملف الخام fastq البيانات (mm_ES_RXR_24h_ATRA.fastq.gz) من http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
  2. تحميل واستخراج ملف الفهرس التحالف اللازمة لمحاذاة (في حالتنا: Mus_musculus_UCSC_mm10).(ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/Mus_musculus/UCSC/mm10/Mus_musculus_UCSC_mm10.tar.gz
    ملاحظة: زيارة لhttps://github.com/ahorvath/Bioinformatics_scripts لمزيد من المعلومات حول خطوات تحليل المعلومات البيولوجية ولتحميل البرامج النصية المستخدمة أدناه.
  3. محاذاة ملف سبيل المثال fastq إلى الجينوم MM10 (استخدام البرنامج النصي: perform_alignment.sh). هذا سيخلق مجلد مع ملف .bam وإحصائيات والمحاذاة. محاذاة RXR البيانات الشذرة وما يليها (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam)، وملف الفهرس المطابق (.bai) متوفرة هنا:
    http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
    ملاحظة: التحالف هو مجموعة من البرامج التي تؤيد RELAتسلسل قصيرة نسبيا (على سبيل المثال، رقاقة وما يليها النتائج) إلى قاعدة بيانات تسلسل، مثل الجينوم إشارة الماوس (على سبيل المثال، MM10) 13.
  4. تشغيل البرنامج النصي (callpeaks.sh) لذروة الدعوة ودي نوفو تحليل عزر. استخدام ملف .bam كإدخال. ويستند البرنامج النصي على هوميروس findPeaks 14.
    ملاحظة: ملفات الإخراج تعطينا معلومات حول العدد الإجمالي للقمم، والإثراء من الزخارف، نسبة للخلفية، وتسلسل الهدف بزخارف، وما إلى ذلك. (الشكل 1). وعادة ما يتم سرد عدة زخارف في ترتيب أهميتها.
  5. إعادة رسم خريطة رقم 1 في المرتبة عزر (NR نصف `AGGTCA`) (استخدام البرنامج النصي: remap_motif.sh)
    ملاحظة: ونتيجة لذلك، والسيناريو بإنشاء ملف .bed التي سوف تظهر التي الشذرة قمم تغطي مناطق الجينوم التي تحتوي على الموقع الكنسي ملزم للعامل النسخ من الفائدة.
  6. تحميل وتصور نتائج RXR يقرأ رقاقة وما يليها الانحياز (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam (أيضا تحميل .bai)) وتواجد AGGTCA عزر (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) من خلال التكاملية الجينوم عارض (IGV) 15 لتحديد RAR المفترضة / مواقع الربط RXR (الشكل 2 والشكل 3).
    ملاحظة: سوف دمج مختلف البيانات الشذرة وما يليها يساعد على التنبؤ بدقة أكثر والقدرة على مرشح جيدة 16،17. وكشفت الدراسات الحديثة أن القدرة النشطة عادة المخصب لP300 وترتبط مع H3K4me1 وH3K27ac، وتقع في المناطق ونين مفتوحة، وبالتالي عرض الدناز-I فرط الحساسية ويوصى أيضا 18-21.
  7. استخدام "تحديد المنطقة ذات الاهتمام" في IGV 15 للحصول على 200-400 تسلسل الغليان في المنطقة الجينومية المحدد واستخدام هذه المتتاليات للتصاميم التمهيدي لاحقة.

2. مراسل الفحص

ملاحظة: يتم استخدام نظام وسيفيرين / وسيفيرازكما مقايسة مراسل حساس جدا لتنظيم النسخي. اعتمادا على انزيم وسيفيراز النشاط محسن هو أنتج من شأنها أن تحفز أكسدة وسيفيرين إلى oxyluciferin مما أدى إلى bioluminescense، والتي يمكن الكشف عنها. وكخطوة أولى، ينبغي subcloned تحديد تسلسل محسن المفترضة في ناقلات مراسل (على سبيل المثال، TK-luciferase المراسل 22، pGL3 أو NanoLuc).

  1. التصميم التمهيدي
    1. الاشعال تصميم PCR لتضخيم من 200-400 نقطة أساس من المناطق محسن المفترضة التي كتبها Primer3 (متوفر هنا: http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23
    2. نسخ لصق التسلسل الجيني من IGV يتضمن الموقع المفترض ملزم في Primer3 (راجع الخطوة 1.7). مجموعة نطاق حجم المنتج إلى 250-300 نقطة أساس في Primer3.
    3. التحقق من صحة الاشعال PCR باستخدام متصفح UCSC الجينوم هو في سيليكون أداة PCR (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) 24
      ملاحظة: هذا البروتوكول في خطوة لاحقة يستخدم HindIIأنا وBamHI تقييد الانزيمات للاستنساخ. تحقق ما إذا كان PCR تضخيم التسلسل كما كان متوقعا من قبل أداة PCR UCSC في وسيليكون وسوف تحتوي على مواقع تقييد AAGCTT أو GGATCC (على سبيل المثال، http://nc2.neb.com/NEBcutter2/).
    4. الحصول على الاشعال المطلوبة من بائع التجاري.
  2. PCR التضخيم من محسن تسلسل من الحمض النووي الجيني
    1. تنقية الحمض النووي الجيني قالب من الخلايا الأولية (على سبيل المثال، الخلايا الليفية الجنينية الأولية). استخدام عدة التجارية لgDNA العزلة واتبع تعليمات الشركة الصانعة.
      ملاحظة: جودة عالية من gDNA أمر ضروري لنجاح التضخيم PCR. استنساخ BAC مناسبة يمكن استخدامها اذا PCR ليست سهلة من gDNA.
    2. إعداد 50 ميكرولتر PCR رد فعل تحتوي على 100 ​​نانوغرام gDNA، 5 ميكرولتر العازلة 10X، و 3 ميكرولتر MgSO 4 (25 مم)، و 5 ميكرولتر dNTP (2 مم لكل منهما)، و 1.5 ميكرولتر إعادة توجيه التمهيدي (10 ميكرون)، 1.5 ميكرولتر القس التمهيدي (10 ميكرومتر) ، 1 ميكرولتر بوليميريز الحمض النووي
    3. تعيين دورة PCR (2 دقيقة 95 درجة مئوية، (20 ثانية 95 درجة مئوية، 10 ثانية 58-65 درجة مئوية، 18 ثانية 70 درجة مئوية) X25 تكرار، 2 دقيقة 70 درجة مئوية، وإلى الأبد 4 درجة مئوية). ضبط درجة الحرارة الصلب مع النظر في التمهيدي وتوقعت القيم تيم.
    4. تنقية المنتج PCR مع عدة تنقية PCR التجارية واتباع تعليمات الشركة الصانعة.
    5. يعرض مواقع تقييد لاستنساخ بتكرار PCR مع الاشعال المستخدمة أعلاه، ولكن بإضافة يتدلى على هم 5 'الغايات (على سبيل المثال، إعادة توجيه: 5'-الأتات AAGCTT xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx-3 "(HindIII)، القس: 5'-تاتا GGATCC xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx -3 "(BamHI)).
    6. تشغيل 5 ميكرولتر من الناتج PCR على هلام الاغاروز للتحقق من المنتجات PCR غير محددة.
      ملاحظة: إذا تم الكشف عن المزيد من العصابات، وتشغيل المنتج PCR كامل وتنقية الفرقة المناسبة من قبل مجموعة استخراج الهلام التجارية.
    7. تقييد
      ملاحظة: لاستنساخ إدراج المنبع المعارف التقليدية المروج 22 في PCR المنتج المنقى وناقلات (على سبيل المثال، TK-لوك) يجب أن يتفاعل مع HindIII وBamHI.
      1. إعداد خليط التفاعل 50 ميكرولتر تحتوي على 1 ميكروغرام تنقية المنتج PCR، 1 HindIII ميكرولتر (20 U / ميكرولتر)، 1 ميكرولتر BamHI (20 U / ميكرولتر) و 5 ميكرولتر 10X العازلة.
      2. إعداد 250 ميكرولتر خليط التفاعل التي تحتوي على ناقل 5μg (TK لوك، أو ناقلات مراسل البديل)، 5 ميكرولتر HindIII (20 U / ميكرولتر)، 5 ميكرولتر BamHI (20 U / ميكرولتر)، 5 ميكرولتر للحرارة الفوسفاتاز القلوية (1 يو / ميكرولتر) و25 ميكرولتر 10X العازلة.
        ملاحظة: العلاج AP متجه يقلل إلى حد كبير من الربط الذاتي للناقل واحد هضمها، وبالتالي الخلفية.
      3. احتضان مخاليط رد فعل لمدة 4 ساعة على 37 درجة مئوية، ثم تنقية المنتجات PCR هضمها وناقلات مع عدة تنقية PCR التجارية.
    8. Ligatioن
      1. إعداد رد فعل للربط في أنابيب PCR بما في ذلك 2 ميكرولتر 10X T4 عازلة الحمض النووي يغاز، 10 نانوغرام TK-لوك ناقلات، إدراج 50 نانوغرام (هضم المنتج PCR)، 1 ميكرولتر T4 DNA يغاز (400 U / ميكرولتر) وnuclease خالية من المياه ما يصل الى 20 ميكرولتر.
        ملاحظة: إعداد سيطرة سلبية حيث لا يحتوي على رد فعل إدراج.
      2. المزيج بلطف على رد فعل من قبل pipetting صعودا وهبوطا، وتدور باستمرار لفترة وجيزة أنابيب PCR باستخدام مصغرة الطرد المركزي ثم في احتضان RT لمدة 10 دقيقة.
      3. الحرارة تعطيل عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ثم البرد على الجليد واستخدم 5 ميكرولتر من المنتج للتحول إلى 50 ميكرولتر الخلايا المختصة (على سبيل المثال، DH5α).
      4. استخدام معيار إجراء الصدمة الحرارية لتحويل البكتيريا، والتقاط المستعمرات وعزل DNA البلازميد مع مجموعة تجارية. التحقق من صحة كافة بنيات بواسطة تسلسل قبل الخطوات المقبلة.
    9. ترنسفكأيشن من خلايا ES
      1. استخدام لوحات 48-جيدا. إضافة 200 ميكرولتر الجيلاتين 0.1٪ solutأيون / جيد 30 دقيقة قبل الطلاء الخلية.
      2. لوحة الجذعية الجنينية (ES) خلايا قبل يوم واحد ترنسفكأيشن. استخدام خالية من تغذية وفاق الخلايا ولوحة في كثافة 3 × 10 4 خلايا لكل بئر في 250 ميكرولتر ES سائل الإعلام / جيد.
      3. إعداد يمزج البلازميد (يتم احتساب كل مزيج ل8 آبار، 4 غير المعالجة و 4 الريتينويك تعامل حامض) مزيج 1: 1250 نانوغرام TK-لوك فارغة (المراقبة السلبية)، 950 نانوغرام β غالاكتوزيداز الترميز ناقلات (βGal)، ميكس 2 : 1250 نانوغرام TK-لوك Hoxa1 محسن (مراقبة إيجابية)، 950 نانوغرام βGal، ميكس 3: 1250 نانوغرام TK-لوك PRMT8 محسن (منطقة الفائدة)، 950 نانوغرام βGal.
        ملاحظة: خلايا ES تعبر عن عوامل النسخ المطلوبة (RAR / RXR). ترك الآبار untransfected لتحديد القيم الأساسية في وقت لاحق خلال القياسات وسيفيراز وβ غالاكتوزيداز.
      4. إضافة نوعية ترنسفكأيشن تخفيض وسائل الاعلام المصل لكل البلازميد خلط إلى 106 ميكرولتر الحجم الكلي (ما يكفي لمدة 8 آبار).
      5. إضافة 4.5 ميكرولتر ES جودة transfectأيون كاشف ثم المزيج بعناية من قبل pipetting 15 مرة صعودا وهبوطا. احتضان هذا المزيج ترنسفكأيشن لمدة 10 دقيقة في RT.
      6. إضافة 13 ميكرولتر من مزيج ترنسفكأيشن إلى الخلايا لكل بئر، مزيج دقيق من قبل pipetting. وضع الخلايا مرة أخرى في حاضنة (37 ° C) O / N قبل العلاج يجند.
      7. إزالة وسائل الاعلام بعناية من قبل تطلع من الخلايا وإضافة 250 ميكرولتر الطازجة وسائل الإعلام / جيد يحتوي على ،01-1 ميكرومتر جميع العابر حمض الريتينويك (RA)، والتركيز النهائي أو DMSO كما مركبة. احتضان الخلايا لمدة 24 - 48 ساعة.
        ملاحظة: حمض الريتينويك خفيف حساسة.
    10. إعداد الخلية لست]
      1. تمييع 5X الاحتياطي تحلل (1.25 مل 0.5 M تريس درجة الحموضة = 7.8، 1 مل 1 M dithiothreitol (DTT) (في H 2 O)، 10 مل 0.1 M EDTA الرقم الهيدروجيني = 8.0، 50 مل الجلسرين، 5 مل تريتون X-100، عقيم الماء تصل إلى 100 مل) ل1X باستخدام الماء المعقم، إضافة 20 ميكرولتر 1 M DTT / 10 مل وتتوازن إلى RT قبل الاستخدام. إعداد 10 مل لوحة 48-جيدا في يوم الفحص. إزالة وسائل الاعلام بعناية من قبل تطلع من الخلايا. شطف خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X. إضافة 200 ميكرولتر 1X الاحتياطي تحلل / جيد مباشرة إلى الخلايا.
      2. يهز لمدة 2 ساعة على RT (تحلل المواد الكيميائية). تجميد الخلية لست] على لوحة عند -80 درجة مئوية (تحلل الميكانيكية). ويمكن تخزين لست] في -80 درجة مئوية لعدة أيام.
      3. ذوبان الجليد لست]. بعد ذوبان كامل، نقل الخلية لست] لوحة 96-جيدا باستخدام ماصة الأقنية الإلكترونية. نقل 80 ميكرولتر من المحللة خلية لوحة 96 جيدا واضحة لفحص β غالاكتوزيداز و 40 ميكرولتر من المحللة الخلية إلى لوحة بيضاء لقياس وسيفيراز. تجنب تشكيل أي فقاعات.
    11. β غالاكتوزيداز الفحص
      ملاحظة: غالاكتوزيداز بيتا أو صحفيين الثاني البديل يجب أن تستخدم الرقابة الداخلية لمراعاة الاختلافات تجريبية غير محددة.
      1. إعداد عازلة الركيزة بيتا غالاكتوزيداز: 80.0 ز نا 2 هبو 4 • 7H 2 O،3.8 غ ناه 2 ص 4 • H 2 O، 30.0 ز بوكل، 1.0 غرام MgSO 4 • 7H 2 O، وجعل ما يصل الى 1000 مل مع الماء المعقم. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4. تصفية تعقيم (0.2 ميكرون) وتخزينها في 4 درجات مئوية
      2. مزيج عازلة الركيزة 1 مل β غالاكتوزيداز مع 4 ملغ ONPG (س-nitrophenyl-β-D-غالاكتوزيداز). إضافة 3.5 ميكرولتر من 2 المركابتويثانول (βME) لكل 1 مل من العازلة قبل الاستخدام. إضافة 100 ميكرولتر β غالاكتوزيداز عازلة الركيزة إلى 80 المحللة خلية ميكرولتر.
      3. احتضان ردود الفعل عند 37 درجة مئوية حتى وضعت اللون الأصفر الخافت. قراءة الامتصاصية في OD 420 نانومتر على قارئ لوحة وتصدير البيانات.
        ملاحظة: المرة تختلف تبعا للكفاءة ترنسفكأيشن، وعادة لا تزيد عن 30 دقيقة.
    12. الفحص وسيفيراز
      1. تجهيز 50 مل وسيفيرين الركيزة كاشف: 15.1 ملغ-D وسيفيرين الملح، 82.7 ملغ الملح اعبي التنس المحترفين، 185 ملغ MgSO 4 • 7H 2 O، إضافة إلى 50 مل أنبوب البولي بروبلين،ثم يضاف 1.5 مل العازلة 1 M HEPES، 48.5 مل ATP المياه مجانا، دوامة، تأكد من أن جميع المركبات تذوب تماما. إبقاء 5-10 مل aliquots في -80 درجة مئوية.
      2. حارة 5 مل وسيفيرين الركيزة كاشف لRT قبل البدء. ماصة 100 ميكرولتر الركيزة الكاشف إلى كل بئر من لوحة بيضاء تحتوي على 40 ميكرولتر من المحللة الخلية وقياس إشارة فورا باستخدام جهاز الانارة المضاد.
      3. الحصول الأنشطة من ثلاثة على الأقل تجارب مستقلة في تعداء ثلاث نسخ.
      4. حساب لأول مرة قاعدة luciferase النشاط تطبيع وقاعدة تطبيع القيم β غالاكتوزيداز لكل بئر بطرح متوسط ​​القيم المقاسة للخلايا غير transfected من كل قيمة قياس. ثم حساب نسبة luciferase النشاط / β غالاكتوزيداز.

    3. توصيف محسن RNA

    ملاحظة: مؤشر أكثر مباشرة النشاط محسن برز من الجينوم ث الأخيرةدراسات بيئة تطوير متكاملة حددت العديد من قصيرة الرنا غير الترميز، وتتراوح في حجمها من 50 إلى 2000 الإقليم الشمالي، والتي يتم نسخها من القدرة، ويسمى الرنا محسن (eRNAs) 16،25،26 (الشكل 4). إرنا تحريض يرتبط إلى حد كبير مع تحريض الجينات الترميز اكسون المجاورة. وهكذا، والنشاط محسن تعتمد على إشارة يمكن كميا في الجسم الحي بمقارنة إنتاج إرنا بين مختلف الظروف التي كتبها RT-QPCR.

    1. المبادئ التوجيهية لتصميم التمهيدي للكشف إرنا بواسطة RT-QPCR
      1. تحديد مناطق الجينوم لقياس إرنا أن ما لا يقل عن 1،5-2 كيلو بايت بعيدا عن مواقع بداية النسخ المشروح.
        ملاحظة: الأهم من ذلك، مستويات عالية من النسخ مرنا في القدرة داخل الجين منع التقدير الدقيق إرنا في توجيه المعنى، eRNAs العقاقير في القدرة داخل الجين يمكن كشفها وتتشابه في مستوى لeRNAs في القدرة خارج الجين.
      2. كقاعدة عامة، استخدام المناطق 200 - 1000 بي بي جيئة وذهابام وسط عامل النسخ موقع مصلحة لتصميم التمهيدي إما على حاسة أو حبلا لمكافحة الشعور (الشكل 4) والشكل (6) ملزمة.
        ملاحظة: إذا اللائحة العامة للمنظمة وما يليها، الدناز وما يليها، H3K4me1، H3K4me3 أو بيانات H3K27ac رقاقة وما يليها متاحة من أنواع الخلايا المطلوبة والشروط التي يمكن استخدامها لتصميم التمهيدي أكثر دقة. وكتب eRNAs من المناطق محسن المفترضة تتميز بمستويات عالية من H3K4me1 وME3. التعبير عن eRNAs يرتبط بشكل إيجابي مع إثراء تنشيط علامة محسن هيستون H3K27ac.
      3. الاشعال تصميم PCR لقياس RT-QPCR من eRNAs صبغية الفلورسنت التي كتبها Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23 إنشاء تسلسل مكافحة الشعور (عكس تكملة حبلا معنى) لتصميم التمهيدي حسب: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html. إدراج 200-300 نقطة أساس من إحساس أو شعور مكافحة تسلسل التصميم التمهيدي.
    2. قياس إرنا النسخ
    3. عزل الحمض النووي الريبي مجموع من الخلايا المعالجة مع الفينول الحمضية التجاري / القائم على الكلوروفورم استخراج الكاشف وفقا لتوصيات الشركة الصانعة.
    4. استخدام DNaseI لعلاج RNA معزولة قبل استخدامها في رد فعل عكس النسخ. تعطيل الدناز وفقا لتوصية الشركة الصانعة قبل النسخ العكسي.
    5. قياس تركيز الحمض النووي الريبي بعد العلاج الدناز الأول واستخدام 1000 نانوغرام في رد فعل RT. استخدام ذات جودة عالية عكس الناسخ.
      ملاحظة: كما لا يجوز مذيل بعديد الأدينيلات عدد كبير من eRNAs، النسخ العكسي يتطلب استخدام البادئات العشوائية.
    6. كشف كتب العكس إرنا بواسطة RT-QPCR باستخدام الإجراء القياسي. قياس مرنا غير المعتمد على المعاملة للتطبيع (على سبيل المثال، 36B4، Ppia، GAPDH، Actb).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

استخدمنا RXR الأجسام المضادة لعموم محددة من أجل تحديد الجينات التي التنظيم RA-الجينوم لها تخصيب مستقبلات في قربها. وكشف تحليل المعلومات البيولوجية من البيانات رقاقة وما يليها RXR تم الحصول عليها من خلايا ES تعامل مع حمض الريتينويك في إثراء نصف موقع مستقبلات النووي (AGGTCA) تحت احتلت RXR المواقع (الشكل 1). باستخدام خوارزمية المعلوماتية الحيوية رسمناها الظهر نتيجة البحث عزر لموقع نصف على البيانات RXR رقاقة وما يليها (الشكل 2). وساعد هذا التحليل لنا التعرف بدقة تلك القمم الشذرة التي كانت متداخلة مع مواقع الربط مستقبل نووي الكنسي. وأشار التصور من هذه المواقع في IGV إثراء هذه عوامل النسخ في مقربة من Hoxa1، وتتميز سابقا الهدف RAR / RXR (الشكل 2 والشكل 3). علينا أيضا أن الجين المستهدف رواية RA، وهي PRMT8 27. هذا لاتحتوي المنطقة tter تكرار المباشر مع أي النيوكليوتيدات هل بين المواقع النصف اثنين (AGGTCAAGGTCA) (الشكل 3). للتحقق من صحة وظيفيا أن العنصر المحددة للHoxa1 يمكن ربط الواقع RAR / RXR والتي تنظمها RA بنينا ناقلات مراسل TK-وسيفيراز التي تحتوي على ~ 300bp المنطقة الجينومية، بما في ذلك العناصر التي تم تحديدها. نحن أيضا بناء ناقلات بدون عنصر استجابة (الشكل 5). و transfected خلايا ES وتم قياس luciferase النشاط في غياب وجود حمض الريتينويك (الشكل 5). لم تظهر زيادة وسيفيراز إشارة شدة على علاج التهاب المفاصل الروماتويدي، بنيات التي تحتوي على عنصر الريتينويك استجابة حمض (نادر)، في حين كان بناء دون نادر لا محرض.

نحن أيضا درس النشاط التي تعتمد على حمض الريتينويك من محسن Hoxa1. للتأكد مما إذا بمعنى ومكافحة الشعور إرنا تعبير عن متجهة الى RXR Hoxa1 RAR / محسن جorrelate مع التعبير مرنا من الجينات، ونحن أيضا قياس مستوى Hoxa1 مرنا (الشكل 6). وأكدت هذه النتائج أن النشاط محسن يسببها العلاج RA قصيرة الأجل (3 ساعات)، مما يؤكد أن محسن ومن المرجح تشارك في تنظيم محسن تعتمد على RA.

شكل 1
الشكل 1. هوميروس D ه نوفو الحافز النتائج. ويرد HTML الإخراج (homerResults.html) التي تم إنشاؤها من قبل هوميروس للمثال RXR رقاقة وما يليها. الشعارات تسلسل المقابلة لأعلى المخصب الزخارف عامل النسخ التي كتبها دي نوفو اكتشاف عزر التي تم تحديدها في مواضع متجهة الى RXR. المحتلة 7463 RXR استخدمت المناطق الجينومية للبحث عن عزر. 77.66٪ من هذه المناطق تحتوي عزر AGGTCA مثل (المرتبة رقم 1). للحصول على وصف زيارة تفصيلا: (http://homer.salk.edu/ho البحار / عزر /) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2. العثور المناطق الجينوم تحتوي على الحافز الاهتمام. التصور RXR رقاقة وما يليها الانحياز يقرأ (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam والحوادث AGGTCA عزر (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) من خلال التكاملية الجينوم عارض (IGV). الملونة الأحلاف التي كتبها حبلا قراءة (يقرأ على + حبلا: أحمر، - حبلا: الأزرق) المستخدمة الجينوم لمحاذاة: MM10. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

JPG "/>
الشكل 3. تظهر الجينوم الامكنه من Hoxa1 ومعززات PRMT8. IGV قطة من RXR إشارات رقاقة وما يليها الحصول عليها من (24 ساعة، 1 ميكرومتر) الخلايا الجذعية الجنينية غير المعالجة أو المعالجة RA-27. حددت يتم تلوين تسلسل ملزمة الأحمر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
. الشكل 4. تصميم التجارب لاختبار إرنا متواليات الترميز معززات الذي تم اختياره لقياس محسن RNA (إرنا) يجب أن يكون موجودا لا يقل عن 1.5 - 2 كيلوبايت بعيدا النسبي إلى الموقع النسخ بداية (TSS) من أقرب الجينات. ويمكن استخدام البيانات الشذرة وما يليها من عامل النسخ (TF) من الفائدة وتحليل عزر لتحديد مواقع الربط المباشر على نطاق الجينوم. كما ربط transcriptional coactivator (على سبيل المثال، P300) غالبا ما يمثل القدرة البعيدة والمناطق المخصب لكلا من فريق العمل وP300 من المرشحين محسن جيد. التعبير عن eRNAs وترتبط بشكل إيجابي مع إثراء تنشيط علامة محسن هيستون H3K27ac. المناطق 200 - ينصح 1000 سنة مضت بعيدا في الشعور أو الاتجاه لمكافحة الشعور من وسط عامل النسخ ملزمة لتصميم إرنا التمهيدي الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5. luciferase المراسل آخر من المراسل أشار يبني في خلايا ES. تم استنساخ مناطق الجينوم أشار من محسن Hoxa1 إلى ناقلات TK-لوك وtransfected في الخلايا الجذعية الجنينية. بناء 1 و 2 تحتوي على الريتينويك عنصر استجابة حمض (نادر، الامم المتحدةتسلسل derlined). تم علاج الخلايا مع التهاب المفاصل الروماتويدي (24 ساعة، 1 ميكرومتر). وقد استخدم βGal باعتبارها الرقابة الداخلية للتطبيع. تمثل الحانات القيم تطبيع متوسط ​​من أربعة مكررات البيولوجية. التنمية المستدامة ± *** P <0.005 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6. مستويات حمض الريتينويك المستحثة محسن RNA النسخ. Hoxa1 مرنا وإرنا مقاسا RT-QPCR. تم عزل الحمض النووي الريبي مجموع من خلايا ES المعالجة لمدة 3 ساعة مع حمض الريتينويك (RA) أو DMSO كما مركبة (للمركبة). وترد الاشعال إلى الأمام لمعنى ومكافحة الشعور الكشف إرنا وamplicons PCR. يشار مسافة مناطق الكشف عنها بواسطة إرنا RT-QPCR من وسط الموقع ملزمة RXR. وتم تطبيع القيم إلى متوسط ​​36B4 السيدNA. البيانات تمثل يعني ± ووزارة شؤون المرأة *** P <0.005 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
KOD DNA polymerase Merck Millipore 71085-3 for PCR amplification of enhancer from gDNA
DNeasy Blood & Tissue kit  Qiagen 69504 for genomic DNA isolation
QIAquick PCR Purification kit Qiagen 28106 for PCR product purification
Gel extraction kit  Qiagen 28706 for gel extraction if there are more PCR product
HindIII NEB R3104L restriction enzyme
BamHI NEB R3136L restriction enzyme
FastAP Thermo Scientific EF0651 release of 5'- and 3'-phosphate groups from DNA
T4 DNA ligase NEB M0202 for ligation
QIAprep Spin Miniprep kit Qiagen 27106 for plasmid isolation
DMEM Gibco 31966-021 ES media
FBS Hyclone SH30070.03 ES media
MEM Non-Essential Amino Acid Sigma M7145 ES media
Penicillin-Streptomycin Sigma P4333 ES media
Beta Mercaptoethanol Sigma M6250 ES media
FuGENE HD  Promega E2311 transfection reagent
Opti-MEM® I Reduced Serum Medium Life Technologies 31985-062 for transfection
All-trans retinoic acid Sigma R2625 ligand, for activation of RAR/RXR
96-well clear plate Greiner 655101 for Beta galactosidase assay
96-well white plate Greiner 655075 for Luciferase assay
D-luciferin, potassium salt Goldbio.com 115144-35-9 for Luciferase assay
ATP salt Sigma A7699-1G for Luciferase assay
MgSO4•7H2O Sigma 230391-25G for Luciferase assay
HEPES Sigma H3375-25G for Luciferase assay
Na2HPO4 •7H2O Sigma 431478-50G for Beta galactosidase assay
NaH2PO4 •H2O Sigma S9638-25G for Beta galactosidase assay
MgSO4•7H2O Sigma 230391-25G for Beta galactosidase assay
KCl Sigma P9541-500G for Beta galactosidase assay
ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactosidase) Sigma N1127-1G for Beta galactosidase assay
TRIzol® Life Technologies 15596-026 RNA isolation
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Life Technologies 4368814 reverse transcription of eRNA
Rnase-free Dnase Promega M6101 Dnase treatment
SsoFast Eva Green BioRad 750000105 RT-qPCR mastermix
CFX384 Touch™ Real-Time PCR Detection System BioRad qPCR machine
BioTek Synergy 4 microplate reader BioTek luminescent counter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wamstad, J. A., Wang, X., Demuren, O. O., Boyer, L. A. Distal enhancers: new insights into heart development and disease. Trends in cell biology. 24, 294-302 (2014).
  2. Pennacchio, L. A., Bickmore, W., Dean, A., Nobrega, M. A., Bejerano, G. Enhancers: five essential questions. Nat Rev Genet. 14, 288-295 (2013).
  3. Mardis, E. R. ChIP-seq: welcome to the new frontier. Nature methods. 4, 613-614 (2007).
  4. Muller, F., Tora, L. Chromatin and DNA sequences in defining promoters for transcription initiation. Biochim Biophys Acta. 1839, 118-128 (2013).
  5. Ounzain, S., Pedrazzini, T. The promise of enhancer-associated long noncoding RNAs in cardiac regeneration. Trends Cardiovasc Med. , (2015).
  6. Lam, M. T., Li, W., Rosenfeld, M. G., Glass, C. K. Enhancer RNAs and regulated transcriptional programs. Trends Biochem Sci. 39, 170-182 (2014).
  7. Dickel, D. E., et al. Function-based identification of mammalian enhancers using site-specific integration. Nature methods. 11, 566-571 (2014).
  8. Blum, R., Vethantham, V., Bowman, C., Rudnicki, M., Dynlacht, B. D. Genome-wide identification of enhancers in skeletal muscle: the role of MyoD1. Genes Dev. 26, 2763-2779 (2012).
  9. Vermunt, M. W., et al. Large-scale identification of coregulated enhancer networks in the adult human brain. Cell reports 9. , 767-779 (2014).
  10. Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev Biol. 168, 342-357 (1995).
  11. Mahony, S., et al. Ligand-dependent dynamics of retinoic acid receptor binding during early neurogenesis. Genome Biol. 12 (R2), (2011).
  12. Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies. FEBS Lett. 584, 3123-3130 (2010).
  13. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
  14. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38, 576-589 (2010).
  15. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29, 24-26 (2011).
  16. Daniel, B., et al. The active enhancer network operated by liganded RXR supports angiogenic activity in macrophages. Genes Dev. 28, 1562-1577 (2013).
  17. Zhu, Y., et al. Predicting enhancer transcription and activity from chromatin modifications. Nucleic Acids Res. 41, 10032-10043 (2013).
  18. Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457, 854-858 (2009).
  19. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nat Genet. 39, 311-318 (2007).
  20. Rada-Iglesias, A., et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470, 279-283 (2010).
  21. Bonn, S., et al. Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development. Nat Genet. 44, 148-156 (2012).
  22. Hollenberg, S. M., Giguere, V., Segui, P., Evans, R. M. Colocalization of DNA-binding and transcriptional activation functions in the human glucocorticoid receptor. Cell. 49, 39-46 (1987).
  23. Untergasser, A., et al. Primer3--new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40, e115 (2012).
  24. Rhead, B., et al. The UCSC Genome Browser database: update 2010. Nucleic Acids Res. 38, D613-D619 (2010).
  25. Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465, 182-187 (2010).
  26. Wang, D., et al. Reprogramming transcription by distinct classes of enhancers functionally defined by eRNA. Nature. 474, 390-394 (2011).
  27. Simandi, Z., et al. PRMT1 and PRMT8 regulate retinoic acid-dependent neuronal differentiation with implications to neuropathology. Stem Cells. 33, 726-741 (2014).
  28. Zhou, H. Y., et al. A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential. Genes Dev. 28, 2699-2711 (2014).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 112، نص، محسن، التعبير الجيني، وحمض الريتينويك، الريتينويك حمض مستقبلات الخلية الجذعية الجنينية، رقاقة وما يليها، إرنا، فحص وسيفيراز
التنبؤ والتحقق من جين تنظيم عناصر المنشط خلال الريتينويك حمض المستحثة الجنينية الجذعية تمايز الخلايا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Simandi, Z., Horvath, A., Nagy, P.,… More

Simandi, Z., Horvath, A., Nagy, P., Nagy, L. Prediction and Validation of Gene Regulatory Elements Activated During Retinoic Acid Induced Embryonic Stem Cell Differentiation. J. Vis. Exp. (112), e53978, doi:10.3791/53978 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter