Abstract
Embryonale ontwikkeling is een meerstaps proces waarbij activering en onderdrukking van vele genen. Enhancer elementen in het genoom is gekend dat ze weefsel en celtype-specifieke regulatie van genexpressie tijdens de celdifferentiatie. Dus, de identificatie en verder onderzoek is belangrijk om te begrijpen hoe lot van de cel wordt bepaald. Integratie van genexpressie data (bijvoorbeeld microarray of RNA-volgende) en de resultaten van chromatine immunoprecipitatie (ChIP) gebaseerde genoomwijde studies (ChIP-seq) maakt het mogelijk op grote schaal identificatie van deze regulerende gebieden. Functionele validatie van celtype enhancers vereist verdere in vitro en in vivo experimentele procedures. Hier beschrijven we hoe actief enhancers kunnen worden geïdentificeerd en experimenteel gevalideerd. Dit protocol voorziet in een stap-voor-stap workflow die bestaat uit: 1) de identificatie van regulerende gebieden van Chip-seq data-analyse, 2) het klonen en experimental validatie van putatieve regulerende potentieel van de geïdentificeerde genomische sequenties in een reporter assay, en 3) bepaling van enhancer activiteit in vivo door het meten enhancer RNA transcript niveau. De gepresenteerde protocol is gedetailleerd genoeg om iedereen te helpen bij het opzetten van deze workflow in het lab. Belangrijk, kan het protocol eenvoudig aangepast worden aan en gebruikt in een cellulair modelsysteem.
Protocol
1. Enhancer selectie op basis van Chip-seq Analyse
- Download de RXR ChIP-seq ruwe data fastq file (mm_ES_RXR_24h_ATRA.fastq.gz) van http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
- Download en pak het vereiste BWA-index bestand voor de uitlijning (in ons geval: Mus_musculus_UCSC_mm10).(ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/Mus_musculus/UCSC/mm10/Mus_musculus_UCSC_mm10.tar.gz
OPMERKING: Bezoek aan https://github.com/ahorvath/Bioinformatics_scripts voor meer informatie over de stappen van bio-informatica-analyse en de scripts hieronder gebruikte downloaden. - Lijn het voorbeeld fastq bestand naar MM10 genoom (gebruik het script: perform_alignment.sh). Dit zal een map met een .bam file en statistieken van de uitlijning te creëren. Aligned RXR ChIP-seq data (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam), en de bijbehorende index-bestand (.bai) zijn hier beschikbaar:
http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
LET OP: BWA is een softwarepakket dat Rela uitgelijndtief korte sequenties (bijvoorbeeld ChIP-seq resultaten) een sequentie databank, zoals de muis referentie genoom (bijvoorbeeld, MM10) 13. - Voer het script (callpeaks.sh) voor de piek bellen en de novo motief analyse. Gebruik de .bam bestand als de input. Het script is gebaseerd op Homerus findPeaks 14.
NB: De output file ons informatie over het totale aantal pieken, verrijking van de motieven, het percentage van de achtergrond en de doelsequenties met motieven, enzovoort. (Figuur 1). Typisch verschillende motieven zijn vermeld in volgorde van hun betekenis. - Remap de # 1 gerangschikt motief (NR half `AGGTCA`) (gebruik het script: remap_motif.sh)
LET OP: Als resultaat, het script genereert een .bed bestand dat zal laten zien welke chip-pieken die genomische regio's die de canonieke bindingsplaats van de transcriptiefactor van belang bevatten. - Download en visualiseren van de resultaten van de uitgelijnde RXR ChIP-seq leest (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam (ook .bai downloaden)) en de AGGTCA motief occurrences (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) van Integrative Genomics Viewer (belastingen) aan 15 vermeende identificeren RAR / RXR bindingsplaatsen (Figuur 2 en Figuur 3).
LET OP: integratie van verschillende ChIP-seq data zal helpen om meer precies te voorspellen goede kandidaat enhancers 16,17. Recente studies toonden aan dat actieve enhancers gewoonlijk verrijkt zijn P300 en correleren met H3K4me1 en H3K27ac, en bevinden zich in de open chromatine gebieden, waardoor DNase-I overgevoeligheid afbeelden aanbevolen 18-21. - Gebruik de "een van belang definiëren" in IGV 15-200 verkrijgen - 400 bp sequentie van het geselecteerde genomische regio en gebruikt deze sequenties voor volgende primer design.
2. Reporter Assay
LET OP: De luciferine / luciferase systeem wordt gebruiktals een zeer gevoelig reporter assay voor transcriptionele regulering. Afhankelijk van de transcriptieverhogeractiviteit luciferase enzym geproduceerd dat de oxidatie van luciferine zal katalyseren oxyluciferine gevolg bioluminescense die gedetecteerd kan. Als eerste stap moet geïdentificeerde vermoedelijke enhancer sequenties gesubkloneerd in een reporter vector (bv TK-Luciferase 22, of pGL3 NanoLuc).
- primer Ontwerp
- Ontwerp PCR-primers voor amplificatie van 200-400 bp van vermoedelijke enhancer regios op Primer3 (hier beschikbaar: http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23
- Copy-paste de genoomsequentie van IGV dat de vermoedelijke bindingsplaats in Primer3 bevat (zie stap 1.7). Set product grootte bereik 250-300 bp in Primer3.
- Valideren van de PCR-primers met behulp van de UCSC Genome Browser is In silico PCR gereedschap (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) 24
LET OP: Dit protocol in een latere stap gebruikt HindIII en BamHI restrictie-enzymen voor het kloneren. Controleer of de PCR geamplificeerde sequentie zoals voorspeld door de UCSC In-silico PCR tool zal AAGCTT of GGATCC restrictieplaatsen bevatten (bijv http://nc2.neb.com/NEBcutter2/). - Verkrijgen van de gewenste primers van een commerciële leverancier.
- PCR-amplificatie van Enhancer Sequence van Genomic DNA
- Zuiver template genoom DNA van primaire cellen (bijvoorbeeld primaire embryonale fibroblasten). Gebruik commerciële kit voor gDNA isolatie en volg de instructies van de fabrikant.
LET OP: Hoge kwaliteit van gDNA is essentieel voor een succesvolle PCR-amplificatie. Geschikte BAC klonen kunnen worden gebruikt als PCR niet gemakkelijk vanaf gDNA. - Bereid 50 gl PCR reactie bevattende 100 ng gDNA, 5 ui 10 x buffer, 3 pl MgSO 4 (25 mM), 5 pl dNTP (2 mM elk), 1,5 gl Fwd primer (10 uM), 1,5 ui Rev primer (10 uM) , 1 pl DNA polymerase
- Stel de PCR-cyclus (2 min 95 ° C, (20 sec 95 ° C, 10 sec 58-65 ° C, 18 sec 70 ° C) x25 repeat, 2 min 70 ° C, voor altijd 4 ° C). Stel hybridisatietemperatuur met de overweging van de primer voorspelde Tm-waarden.
- Zuiver het PCR product met een commerciële PCR zuiveringssamenstel en de instructies van de fabrikant.
- Voeren de restrictieplaatsen voor klonering door herhaaldelijk PCR met primers zoals hierboven toegepast, maar het toevoegen overhangen op hun 5 'einden (bijv Fwd: 5'-atat AAGCTT xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx-3' (HindIII), Rev: 5'-TATA GGATCC xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx -3 '(BamHI)).
- Run 5 ui van het PCR-product op agarose gel om te controleren op niet-specifieke PCR-producten.
NB: Als er meer bands worden gedetecteerd, voert u het volledige PCR-product en zuiveren de juiste band door een commerciële gel extractie kit. - Beperking
OPMERKING: insert klonen stroomopwaarts van TK promoter 22 het gezuiverde PCR-product en de vector (bijv TK-Luc) worden gedigereerd met HindIII en BamHI.- Bereid een 50 gl reactiemengsel dat 1 ug gezuiverd PCR product, 1 ui HindlII (20 U / ul), 1 ui BamHI (20 U / pl) en 5 gl 10x buffer.
- Bereid een 250 ul reactiemengsel dat 5 ug vector (TK Luc of andere reporter vector), 5 gl HindlII (20 U / pl), 5 ui BamHI (20 U / pl), 5 gl warmtegevoelige alkaline fosfatase (1 U / pl) en 25 gl 10x buffer.
OPMERKING: AP behandeling van de vector vermindert sterk de zelf-ligatie van één-gedigereerde vector en zo de achtergrond. - Incubeer de reactiemengsels gedurende 4 uur bij 37 ° C, daarna zuiveren van de gedigereerde PCR-producten en de vector met een commerciële PCR zuivering kit.
- Ligation
- Stel de reactie voor ligatie in PCR buizen inclusief 2 gl 10 x T4 DNA ligase buffer, 10 ng TK-Luc vector, 50 ng insert (gedigesteerd PCR product), 1 pl T4 DNA ligase (400 U / pl) en nuclease-vrij water tot 20 pl.
OPMERKING: Bereid een negatieve controle waar de reactie niet insert bevat. - Meng de reactie door en neer te pipetteren, het afsluiten kort de PCR buisjes u mini-centrifuge en vervolgens incuberen bij kamertemperatuur 10 min.
- Warmte geïnactiveerd bij 65 ° C gedurende 10 min vervolgens koelen op ijs en gebruik 5 ul van het product voor omzetting in 50 pi competente cellen (bijvoorbeeld DH5a).
- Gebruik standaard heat shock procedure om bacteriën te transformeren, pick-up koloniën en isoleren van plasmide-DNA met een commerciële kit. Valideer alle constructen door sequencing voor de volgende stappen.
- Stel de reactie voor ligatie in PCR buizen inclusief 2 gl 10 x T4 DNA ligase buffer, 10 ng TK-Luc vector, 50 ng insert (gedigesteerd PCR product), 1 pl T4 DNA ligase (400 U / pl) en nuclease-vrij water tot 20 pl.
- Transfectie van ES cellen
- Met 48-well platen. Voeg 200 ul 0,1% gelatine solution / putje 30 min voor cel plating.
- Plaat embryonale stam (ES) cellen een dag voor transfectie. Gebruik voedingsvrije ES-cellen en plaat bij een dichtheid van 3 x 10 4 cellen per putje in 250 ul ES medium / putje.
- Bereid het plasmide mixen (elke mix wordt berekend voor 8 putten, 4 onbehandelde en 4 retinoïnezuur-zuur behandelde) Meng 1:. 1250 ng TK-Luc Empty (negatieve controle), 950 ng β-galactosidase coderende vector (PGal), Mix 2 : 1250 ng TK-Luc Hoxa1 enhancer (positieve controle), 950 ng pGal, Mix 3: 1250 ng TK-Luc PRMT8 enhancer (region of interest), 950 ng pGal.
LET OP: ES-cellen drukken de gewenste transcriptiefactoren (RAR / RXR). Laat putten ongetransfecteerde om basiswaarden later vast te stellen tijdens de luciferase en β-galactosidase metingen. - Voeg transfectie kwaliteit gereduceerd serum media om elk plasmide te mengen tot 106 ui totaal volume (genoeg voor 8 putten).
- Voeg 4,5 ul ES kwaliteit transfecterenion reagens vervolgens zorgvuldig meng door pipetteren 15 keer op en neer. Incubeer de transfectie mix gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 13 ul van de transfectie mix aan de cellen per well, meng door pipetteren. Plaats de cellen terug in de incubator (37 ° C) O / N ligand voor behandeling.
- Verwijder media zorgvuldig door aspiratie uit cellen en voeg 250 ul vers medium / putje met 0,01-1 uM all-trans retinoïnezuur (RA) als uiteindelijke concentratie of DMSO als vehikel. Incubeer cellen voor 24 - 48 uur.
OPMERKING: Retinoïnezuur is lichtgevoelig.
- Bereiding van cellysaten
- Verdun 5x Lysis Buffer (1,25 ml 0,5 M Tris pH = 7,8, 1 ml 1 M dithiothreitol (DTT) (in H 2 O), 10 ml 0,1 M EDTA pH 8,0, 50 ml glycerol, 5 ml Triton X-100, steriel water tot 100 ml) tot 1x gebruik steriel water, voeg 20 pl 1 M DTT / 10 ml en equilibreren tot kamertemperatuur vóór gebruik. Bereid 10 ml van een 48-well plaat op de dag van de assay. Verwijder media zorgvuldig door aspiratie uit cellen. Spoel cellen eenmaal met 1x PBS. Voeg 200 ul lysisbuffer 1x / putje direct aan de cellen.
- Schud gedurende 2 uur bij KT (chemische lysis). Bevries de cellysaten op de plaat bij -80 ° C (mechanische lysis). Lysaten kunnen enkele dagen bewaard bij -80 ° C.
- Ontdooi de lysaten. Na volledige ontdooiing overdracht cellysaten een 96-wells plaat met een elektronische multichannel pipet. Overdracht 80 ul van het cellysaat met 96 putjes duidelijke dienblad β-galactosidase assay en 40 pl van het cellysaat een witte plaat op luciferase meting. Vermijd de vorming van eventuele luchtbellen.
- β-galactosidase Assay
OPMERKING: beta galactosidase of alternatieve tweede reporters worden gebruikt als een interne controle om rekening niet-specifieke experimentele variaties.- Bereid β-galactosidase substraat buffer: 80,0 g Na 2 HPO 4 • 7H 2 O,3,8 g NaH 2 PO 4 • H 2 O, 30,0 g KCI, 1,0 g MgSO4 • 7H 2 O, vul aan tot 1000 ml met steriel water. Pas de pH tot 7,4. Filter Sterilize (0,2 micron) en bewaar bij 4 ° C
- Meng 1 ml β-galactosidase substraat buffer met 4 mg ONPG (o-nitrofenyl-β-D-galactosidase). Voeg 3,5 gl 2-Mercaptoethanol (pME) per 1 ml buffer vlak voor gebruik. Voeg 100 ul β-galactosidase substraat buffer 80 pi cellysaat.
- Incubeer de reacties bij 37 ° C totdat een lichtgele kleur ontwikkeld. Lees de absorptie bij OD 420 nm op een bord lezer en export van gegevens.
Opmerking: Het is afhankelijk van de transfectie-efficiëntie, meestal niet langer dan 30 min.
- luciferase Assay
- Bereid 50 ml luciferine substraat reagens: 15,1 mg D-luciferine zout, 82,7 mg ATP zout, 185 mg MgSO4 • 7H 2 O, toe te voegen aan 50 ml polypropyleen buis,voeg vervolgens 1,5 ml 1 M HEPES buffer, 48,5 ml ATP gratis water, draaikolk, zorg ervoor dat alle verbindingen op te lossen volledig. Houd 5-10 ml porties bij -80 ° C.
- Warm 5 ml luciferine substraat reagens RT alvorens te beginnen. Pipetteer 100 ul substraat-reagens aan elk putje van de witte plaat met 40 pi van het cellysaat en meet de signaal onmiddellijk met een luminescerende teller machine.
- Verkrijgen activiteiten uit ten minste drie onafhankelijke experimenten in triplo transfecties.
- Bereken eerst de basis genormaliseerde luciferaseactiviteit en base genormaliseerd β-galactosidase waarden voor elk putje door de gemiddelde gemeten waarden voor ongetransfecteerde cellen van elke gemeten waarde. Bereken vervolgens de verhouding van luciferase / β-galactosidase-activiteit.
3. Karakterisering van Enhancer RNA
LET OP: Een meer directe indicator van de versterker activiteit is ontstaan uit de recente genoom-wide studies die veel korte niet-coderende RNA's geïdentificeerd, variërend in grootte van 50 tot 2000 nt, die worden getranscribeerd vanaf versterkers en zogenaamde enhancer RNAs (Ernas) 16,25,26 (figuur 4). Erna inductie sterk correleert met de inductie van aangrenzende exon coderende genen. Aldus kan signaalafhankelijke enhancer-activiteit in vivo worden gekwantificeerd door vergelijking Erna productie tussen verschillende omstandigheden door RT-qPCR.
- Richtlijnen voor Primer Design for Erna detectie door RT-qPCR
- Selecteer genomische regio's voor Erna metingen die op zijn minst 1,5-2 kb afstand van geannoteerde transcriptie start sites.
OPMERKING: Belangrijk is, een hoog niveau van mRNA-transcriptie over intragene enhancers voorkomen accurate kwantificering van Erna in de sense oriëntatie, antisense Ernas op intragene enhancers zijn detecteerbaar en zijn vergelijkbaar niveau Ernas bij extragene enhancers. - Als algemene regel, gebruik regio 200 - 1000 bp weerm het midden van de transcriptiefactor bindingsplaats plaats voor primerontwerp hetzij de sense of anti-sense streng (figuur 4 en figuur 6).
LET OP: Als GRO-seq, DNase-seq, H3K4me1, H3K4me3 of H3K27ac ChIP-seq gegevens beschikbaar zijn van de gewenste soorten en voorwaarden cel kan worden gebruikt voor meer accurate primer design. Ernas getranscribeerd van vermoedelijke enhancer regio's worden gekenmerkt door een hoge mate van H3K4me1 en ME3. Expressie van Ernas positief correleert met de verrijking van actieve versterker histon mark H3K27ac. - Ontwerp PCR primers voor fluorescente kleurstof gebaseerde RT-qPCR meting van Ernas door Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23 Genereer anti-sense sequentie (reverse complement van de sense streng) voor primer design als per: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html. Steek 200-300 bp van sense of anti-sense sequentie voor primer design.
- Selecteer genomische regio's voor Erna metingen die op zijn minst 1,5-2 kb afstand van geannoteerde transcriptie start sites.
- Meting van Erna transcriptie
- Isoleer totaal RNA uit behandelde cellen met commerciële zure fenol / chloroform-extractie gebaseerde Reagens volgens aanbevelingen van de fabrikant.
- Gebruik DNaseI geïsoleerde RNA behandelen vóór gebruik ervan in reverse transcriptiereactie. DNase inactiveren volgens de aanbevelingen van de fabrikant voorafgaand aan omgekeerde transcriptie.
- Meet RNA-concentratie na DNase I behandeling en gebruik 1000 ng per RT-reactie. Gebruik van hoge kwaliteit reverse transcriptase.
OPMERKING: talrijke Ernas niet worden gepolyadenyleerde, reverse transcriptie vereist het gebruik van willekeurige primers. - Detecteren reverse getranscribeerd Erna door RT-qPCR met behulp van standaard procedure. Meet een niet-behandeling-afhankelijke mRNA voor normalisatie (bijv, 36B4, PPIA, GAPDH, ACTB).
- Zuiver template genoom DNA van primaire cellen (bijvoorbeeld primaire embryonale fibroblasten). Gebruik commerciële kit voor gDNA isolatie en volg de instructies van de fabrikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We gebruikten een pan-specifieke RXR antilichaam om na te gaan genoombrede waarin RA-gereguleerde genen receptor verrijking in hun nabijheid. Bioinformatica analyse van RXR ChIP-seq gegevens van ES-cellen behandeld met retinoïnezuur onthulde verrijking van de nucleaire receptor halve plaats (AGGTCA) onder de RXR bezette plaatsen (Figuur 1). Met behulp van een bio algoritme brachten we weer het motief zoekresultaten helft site om de RXR ChIP-seq data (figuur 2). Deze analyse heeft ons geholpen om de chip pieken die werden overlappen met canonieke nucleaire receptor bindingsplaatsen nauwkeurig te identificeren. Visualisatie van deze sites IGV aangegeven verrijking van deze transcriptiefactoren in de nabijheid van Hoxa1 een eerder gekarakteriseerde RAR / RXR target (figuur 2 en figuur 3). We hebben ook aangegeven een nieuw RA target-gen, namelijk PRMT8 27. dit latter gebied bevat een directe herhaling zonder spacer nucleotiden tussen de twee halve plaatsen (AGGTCAAGGTCA) (figuur 3). Functioneel valideren dat de geïdentificeerde voor Hoxa1 kan inderdaad binden RAR / RXR en gereguleerd door RA element we geconstrueerd TK-luciferase reporter vectoren die bevatte ~ 300 bp genomische regio, met inbegrip van de geïdentificeerde elementen. Construeerden wij ook vectoren zonder responselement (Figuur 5). ES-cellen werden getransfecteerd en luciferaseactiviteit werd gemeten in de afwezigheid en aanwezigheid van retinoïnezuur (Figuur 5). Constructen die de retinoïnezuur response-element (zeldzaam) heeft laten zien verhoogde luciferase intensiteit van het signaal bij RA behandeling, terwijl het construct zonder RARE was niet induceerbaar.
We bestudeerden ook retinoïnezuur-afhankelijke activiteit van de Hoxa1 enhancer. Om vast te stellen of de sense en anti-sense Erna uitdrukking van de Hoxa1 RAR / RXR-gebonden enhancer correlate de mRNA expressie van het gen, maten we ook het niveau van Hoxa1 mRNA (Figuur 6). Deze resultaten bevestigden dat de enhancer activiteit wordt geïnduceerd door kortstondige RA behandeling (3 uur), hetgeen bevestigt dat de enhancer waarschijnlijk betrokken bij RA-afhankelijke regulering enhancer.
Figuur 1. Homer D e Novo Motif resultaten. Een uitgang HTML (homerResults.html) gegenereerd door Homerus voor het voorbeeld RXR ChIP-seq wordt getoond. Sequence logo's die overeenkomen met top verrijkt transcriptiefactor motieven geïdentificeerd door de novo motief ontdekking bij RXR-gebonden loci. 7463 RXR bezette genomische regio werden gebruikt voor het motief zoeken. 77,66% van deze regio's bevat AGGTCA-achtige motief (gerangschikt als nummer 1). Voor gedetailleerde informatie bezoek: (http://homer.salk.edu/ho mer / motief /) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Finding Genomic gebieden met Motif of Interest. Visualisatie van de uitgelijnde RXR ChIP-seq leest (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam en de AGGTCA motief voorvallen (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) van Integrative Genomics Viewer (IGV). Alignementen worden gekleurd door read streng (leest op + streng: rood, - streng. blauw) Genome gebruikt voor de uitlijning: MM10. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
jpg "/>
Figuur 3. Genomic Loci van Hoxa1 en PRMT8 Enhancers. IGV momentopname van RXR ChIP-Seq signalen verkregen van onbehandelde en RA-behandelde (24 uur, 1 uM) embryonale stamcellen 27 worden getoond. Geïdentificeerde bindende sequenties zijn rood gekleurd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
. Figuur 4. Experimental Design for Testing Erna coderende sequenties enhancers gekozen voor enhancer RNA (Erna) meting moeten zich tenminste 1,5-2 kb weg ten opzichte van de transcriptie start site (TSS) van het dichtstbijzijnde gen. ChIP-seq gegevens van de transcriptiefactor (TF) plaats en het motief analyse kan worden gebruikt om direct bindingsplaatsen genoombrede identificeren. Als de binding van transcriptionele coactivator (bv P300) vaak markeert distale enhancers, regio verrijkt voor zowel de TF en P300 zijn goede versterker kandidaten. Expressie van Ernas positief correleren met de verrijking van actieve versterker histon mark H3K27ac. Regio's 200 -. 1000 bp in sense of anti-sense richting van het centrum van de transcriptiefactor binding van wordt aanbevolen voor Erna primer ontwerp Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Luciferase activiteit van de aangegeven reporterconstructen in ES cellen. Aangegeven genomische regio van de Hoxa1 enhancer werden gekloneerd in TK-Luc vector en getransfecteerd in embryonale stamcellen. Construct 1 en 2 bevatte de retinoïnezuur response-element (RARE, underlined sequentie). Cellen werden behandeld met RA (24 hr, 1 uM). PGal werd gebruikt als een interne controle voor normalisatie. Balken geven de gemiddelde genormaliseerde waarden van vier biologische herhalingen. ± sd *** P <0,005 Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. retinoïnezuur Induced Enhancer RNA transcriptie. Hoxa1 mRNA en Erna niveaus zoals gemeten door RT-qPCR. Totaal RNA werd geïsoleerd uit ES-cellen behandeld gedurende 3 uur met retinoïnezuur (RA) of DMSO als vehikel (veh). Voorwaartse primers voor de sense en anti-sense Erna detectie en de PCR amplicons getoond. Afstand gedetecteerd met RT-qPCR Erna van het centrum van de RXR bindingsplaats regio aangegeven. Waarden werden genormaliseerd tot de gemiddelde 36B4 mRNA. Gegevens vertegenwoordigen gemiddelde ± sem *** P <0,005 Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD DNA polymerase | Merck Millipore | 71085-3 | for PCR amplification of enhancer from gDNA |
| DNeasy Blood & Tissue kit | Qiagen | 69504 | for genomic DNA isolation |
| QIAquick PCR Purification kit | Qiagen | 28106 | for PCR product purification |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28706 | for gel extraction if there are more PCR product |
| HindIII | NEB | R3104L | restriction enzyme |
| BamHI | NEB | R3136L | restriction enzyme |
| FastAP | Thermo Scientific | EF0651 | release of 5'- and 3'-phosphate groups from DNA |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | for ligation |
| QIAprep Spin Miniprep kit | Qiagen | 27106 | for plasmid isolation |
| DMEM | Gibco | 31966-021 | ES media |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | ES media |
| MEM Non-Essential Amino Acid | Sigma | M7145 | ES media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | ES media |
| Beta Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | ES media |
| FuGENE HD | Promega | E2311 | transfection reagent |
| Opti-MEM® I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 31985-062 | for transfection |
| All-trans retinoic acid | Sigma | R2625 | ligand, for activation of RAR/RXR |
| 96-well clear plate | Greiner | 655101 | for Beta galactosidase assay |
| 96-well white plate | Greiner | 655075 | for Luciferase assay |
| D-luciferin, potassium salt | Goldbio.com | 115144-35-9 | for Luciferase assay |
| ATP salt | Sigma | A7699-1G | for Luciferase assay |
| MgSO4•7H2O | Sigma | 230391-25G | for Luciferase assay |
| HEPES | Sigma | H3375-25G | for Luciferase assay |
| Na2HPO4 •7H2O | Sigma | 431478-50G | for Beta galactosidase assay |
| NaH2PO4 •H2O | Sigma | S9638-25G | for Beta galactosidase assay |
| MgSO4•7H2O | Sigma | 230391-25G | for Beta galactosidase assay |
| KCl | Sigma | P9541-500G | for Beta galactosidase assay |
| ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactosidase) | Sigma | N1127-1G | for Beta galactosidase assay |
| TRIzol® | Life Technologies | 15596-026 | RNA isolation |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies | 4368814 | reverse transcription of eRNA |
| Rnase-free Dnase | Promega | M6101 | Dnase treatment |
| SsoFast Eva Green | BioRad | 750000105 | RT-qPCR mastermix |
| CFX384 Touch™ Real-Time PCR Detection System | BioRad | qPCR machine | |
| BioTek Synergy 4 microplate reader | BioTek | luminescent counter |
References
- Wamstad, J. A., Wang, X., Demuren, O. O., Boyer, L. A. Distal enhancers: new insights into heart development and disease. Trends in cell biology. 24, 294-302 (2014).
- Pennacchio, L. A., Bickmore, W., Dean, A., Nobrega, M. A., Bejerano, G.
- Mardis, E. R. ChIP-seq: welcome to the new frontier. Nature methods. 4, 613-614 (2007).
- Muller, F., Tora, L. Chromatin and DNA sequences in defining promoters for transcription initiation. Biochim Biophys Acta. 1839, 118-128 (2013).
- Ounzain, S., Pedrazzini, T. The promise of enhancer-associated long noncoding RNAs in cardiac regeneration. Trends Cardiovasc Med. , (2015).
- Lam, M. T., Li, W., Rosenfeld, M. G., Glass, C. K. Enhancer RNAs and regulated transcriptional programs. Trends Biochem Sci. 39, 170-182 (2014).
- Dickel, D. E., et al. Function-based identification of mammalian enhancers using site-specific integration. Nature methods. 11, 566-571 (2014).
- Blum, R., Vethantham, V., Bowman, C., Rudnicki, M., Dynlacht, B. D. Genome-wide identification of enhancers in skeletal muscle: the role of MyoD1. Genes Dev. 26, 2763-2779 (2012).
- Vermunt, M. W., et al. Large-scale identification of coregulated enhancer networks in the adult human brain. Cell reports 9. , 767-779 (2014).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev Biol. 168, 342-357 (1995).
- Mahony, S., et al. Ligand-dependent dynamics of retinoic acid receptor binding during early neurogenesis. Genome Biol. 12 (R2), (2011).
- Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies. FEBS Lett. 584, 3123-3130 (2010).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38, 576-589 (2010).
- Robinson, J. T., et al.
- Daniel, B., et al. The active enhancer network operated by liganded RXR supports angiogenic activity in macrophages. Genes Dev. 28, 1562-1577 (2013).
- Zhu, Y., et al. Predicting enhancer transcription and activity from chromatin modifications. Nucleic Acids Res. 41, 10032-10043 (2013).
- Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457, 854-858 (2009).
- Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nat Genet. 39, 311-318 (2007).
- Rada-Iglesias, A., et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470, 279-283 (2010).
- Bonn, S., et al. Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development. Nat Genet. 44, 148-156 (2012).
- Hollenberg, S. M., Giguere, V., Segui, P., Evans, R. M. Colocalization of DNA-binding and transcriptional activation functions in the human glucocorticoid receptor. Cell. 49, 39-46 (1987).
- Untergasser, A., et al.
- Rhead, B., et al. The UCSC Genome Browser database: update 2010. Nucleic Acids Res. 38, D613-D619 (2010).
- Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465, 182-187 (2010).
- Wang, D., et al. Reprogramming transcription by distinct classes of enhancers functionally defined by eRNA. Nature. 474, 390-394 (2011).
- Simandi, Z., et al. PRMT1 and PRMT8 regulate retinoic acid-dependent neuronal differentiation with implications to neuropathology. Stem Cells. 33, 726-741 (2014).
- Zhou, H. Y., et al. A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential. Genes Dev. 28, 2699-2711 (2014).
