Abstract
胚発生は、多くの遺伝子の活性化と抑制を含む多段階プロセスです。ゲノム中のエンハンサーエレメントは、組織及び細胞分化の間の遺伝子発現の細胞型特異的調節に寄与することが知られています。したがって、それらの同定およびさらなる調査は、細胞の運命を決定する方法を理解するために重要です。遺伝子発現データ（ 例えば、マイクロアレイまたはRNA-seqの）およびクロマチン免疫沈降（ChIPの）ベースのゲノムワイドな研究（チップ配列）の結果の統合は、これらの調節領域の大規模な同定を可能にします。しかしながら、細胞型特異的エンハンサーの機能的検証は、in vitroおよびin vivo実験手順でさらに必要とします。ここでは、アクティブなエンハンサーを同定し、実験的に検証できる方法について説明します。このプロトコルは、ステップバイステップのワークフローを提供します：1）のChIP-seqのデータ解析による調節領域の同定、2）クローニングおよびEXPERimentalレポーターアッセイで同定されたゲノム配列の推定調節の可能性の検証、およびエンハンサーRNA転写物のレベルを測定することにより、in vivoでのエンハンサー活性の3）決意。提示されたプロトコルは、ラボでは、このワークフローを設定するために誰を助けるために十分に詳述されています。重要なことに、このプロトコルは容易に適応し、任意の細胞モデル系において使用することができます。
Protocol
チップ-seqの分析に基づく1エンハンサーの選択
- http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/からRXRのChIP-seqの生データFASTQファイル（mm_ES_RXR_24h_ATRA.fastq.gz）をダウンロード
- 我々の場合で（位置合わせのために必要なBWAインデックスファイルをダウンロードし、解凍します。 Mus_musculus_UCSC_mm10).(ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/Mus_musculus/UCSC/mm10/Mus_musculus_UCSC_mm10.tar.gz
注：バイオインフォマティクス解析の手順の詳細についてはhttps://github.com/ahorvath/Bioinformatics_scriptsにアクセスして、以下で使用するスクリプトをダウンロードします。 - （：perform_alignment.shスクリプトを使用）MM10ゲノムに例のFASTQファイルを合わせます。これは.bamファイルとアライメントの統計でフォルダを作成します。整列RXRのChIP-seqのデータ（mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam）、および対応するインデックスファイル（.bai）は、ここで使用できます。
http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
注：BWAはRELAを整列ソフトウェアパッケージです例えば、マウスの参照ゲノム（ 例えば、MM10）13のような配列データベースにtively短い配列（ 例えば、のChIP-seqの結果）、。 - ピークの呼び出しおよびデノボモチーフ解析のためのスクリプト（callpeaks.sh）を実行します。入力として.bamファイルを使用してください。スクリプトは、ホーマーfindPeaks 14に基づいています。
注：出力ファイルは、私たちにピークの合計数、モチーフの濃縮、背景の割合、およびなどのモチーフと標的配列についての情報を与えます。 （ 図1）。典型的には、いくつかのモチーフは、その重要性の順に記載されています。 - （：remap_motif.shスクリプトを使用）1位にランクモチーフ（NRの半分 `AGGTCA`）をリマップ
注：この結果、スクリプトは、チップのピークが関心の転写因子の標準的な結合部位を含むゲノム領域をカバーしているが表示されます.bedファイルを生成します。 - （mm_ES_RXをダウンロードして、読み込み整列RXRのChIP-seqの結果を可視化推定されるRAR / RXR結合部位（ 図2と図3）を識別するための統合的ゲノミクスビューア（IGV）15によってR_24h_ATRA.bam（も.baiをダウンロード））とAGGTCAモチーフの発生（mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed）。
注：さまざまなのChIP-seqのデータの統合は、より正確に良い候補増強剤に16,17を予測するのに役立ちます。最近の研究では、アクティブなエンハンサーは、通常、P300について濃縮し、H3K4me1とH3K27acと相関し、また、18から21をお勧めします、それによりDNアーゼI過敏症を表示し、開いたクロマチン領域に配置されていることを明らかにしました。 - 選択されたゲノム領域の400塩基対の配列と、それに続くプライマーの設計のためにこれらの配列を使用する- 200を得るために、IGV 15に「 関心領域の定義 」 を使用します。
2.レポーターアッセイ
注：ルシフェリン/ルシフェラーゼ系が使用されています転写調節のために非常に敏感なレポーターアッセイとして。エンハンサー活性に依存するルシフェラーゼ酵素を検出することができるbioluminescense、その結果ルシフェリンをオキシルシフェリンの酸化を触媒すること製造されます。最初のステップとして、同定された推定エンハンサー配列は、レポーターベクター（ 例えば、TK-ルシフェラーゼ22、のpGL3またはNanoLuc）にサブクローニングする必要があります。
- プライマーの設計
- （：http://bioinfo.ut.ee/primer3/ここから入手可能）23プライマー3によって推定されるエンハンサー領域の400bpの- 200の増幅のための設計PCRプライマー
- プライマー3（ステップ1.7を参照）に推定結合部位を含むIGVからゲノム配列をコピーし、貼り付けます。プライマー3で300 bpの - 250に設定し、製品のサイズ範囲。
- インシリコ PCRツール（https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr）24 で UCSCゲノムブラウザのを使用して、PCRプライマーを検証
注：後の工程でこのプロトコルは、のHindIIIを使用していますIおよびBamHI制限は、クローニングのための酵素。 インシリコ PCRツールは（ 例えば、http://nc2.neb.com/NEBcutter2/）AAGCTTまたはGGATCC制限部位が含まれていますUCSCによって予測されるようにPCR増幅した配列かどうかを確認してください。 - 商用ベンダーから必要なプライマーを入手します。
- ゲノムDNAからのエンハンサー配列のPCR増幅
- 初代細胞（ 例えば、初代胚線維芽細胞）からテンプレートのゲノムDNAを精製します。 gDNAの単離のための市販のキットを使用し、製造元の指示に従ってください。
注：のgDNAの高品質が成功したPCR増幅のために不可欠です。 PCRは、gDNAをより容易でない場合は、適切なBACクローンを使用することができます。 - gDNAのngの100を含む50μlのPCR反応を準備し、5μlの10×緩衝液、3μlの硫酸マグネシウム（25 mM）の、5μlのdNTPを（各2mM）、1.5μlの早送りプライマー（10μM）、1.5μlの改訂プライマー（10μM） 、1μlのDNAポリメラーゼ
- PCRサイクル設定（2分95℃、（20秒95℃、10秒を58から65°C、18秒70°C）のx25繰り返し、2分70°C、永遠に4°C）。プライマーのを考慮した設定アニール温度は、Tm値を予測しました。
- 商業PCR精製キットを用いてPCR産物を精製し、製造元の指示に従ってください。
- 上記で使用されるプライマーを用いてPCRを繰り返し、それらの5 '末端（ 例えば、早送り：5'-ATAT AAGCTTの xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx-3'のオーバーハングを追加することによって、クローニングのための制限部位を導入する（HindIIIで）、REV：5'- TATA GGATCC xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx -3 '（BamHIで））。
- 非特異的なPCR産物を確認するためにアガロースゲル上でPCR産物の5μLを実行します。
注：複数のバンドが検出された場合、全体のPCR産物を実行し、商業ゲル抽出キットを用いて適切なバンドを精製します。 - 制限
注：HindIII及びBamHIで消化されるべきであるTKプロモーター22精製したPCR産物およびベクター（ 例えば、TK-リュック）の上流に挿入クローニングするために。- 1μgの精製PCR産物、1μlのをHindIII（20 U /μl）を、1μlのをBamHI（20 U /μl）を5μlの10×緩衝液を含む50μlの反応混合物を準備します。
- 5μgのベクター（TKリュック、または代替レポーターベクター）、5μlのをHindIII（20 U /μl）を、5μlのをBamHI（20 U /μl）を、5μlの感熱アルカリホスファターゼ（1 U /μl）を含む250μlの反応液を調製そして、25μlの10×バッファー。
注：ベクトルのAP処理が大幅に単一消化ベクターのセルフライゲーションので、バックグラウンドを減少させます。 - 次に商用PCR精製キットを用いて消化したPCR産物およびベクターを精製し、37℃で4時間、反応混合物をインキュベートします。
- Ligation個
- 2μlの10×T4 DNAリガーゼ緩衝液、10 ngのTK-Lucベクター、50ngのインサート（消化したPCR産物）、1μlのT4 DNAリガーゼ（400 U /μl）を、およびヌクレアーゼフリー水を含むPCRチューブ内ライゲーション反応をセットアップします20μlのまで。
注：反応は、インサートを含まないネガティブコントロールを準備します。 - 静かにピペッティングすることによって反応をミックスダウン、ミニ遠心機を使用して簡単にPCRチューブをスピンダウンした後、室温で10分間インキュベートします。
- 熱は氷の上でリラックスし、50μlのコンピテント細胞（ 例えば、DH5α）への形質転換のために、製品の5μLを使用し、その後65℃で10分間不活性化します。
- 市販のキットを用いて、細菌を形質転換コロニーをピックアップし、プラスミドDNAを単離するための標準的な熱ショック手順を使用します。次のステップの前に配列決定することにより全ての構築物を検証します。
- 2μlの10×T4 DNAリガーゼ緩衝液、10 ngのTK-Lucベクター、50ngのインサート（消化したPCR産物）、1μlのT4 DNAリガーゼ（400 U /μl）を、およびヌクレアーゼフリー水を含むPCRチューブ内ライゲーション反応をセットアップします20μlのまで。
- ES細胞のトランスフェクション
- 48ウェルプレートを使用してください。 200μlの0.1％のゼラチンsolutを追加します。細胞播種の前にイオン/ウェルの30分。
- 板胚性幹（ES）細胞をトランスフェクションの前日。 /ウェル250μlのES培地でウェルあたり3×10 4細胞の密度で、フィーダーを含まないES細胞とプレートを使用してください。
- 。プラスミドミックスを準備ミックス （各ミックスは、未処理の4,4は、レチノイン酸処理した8ウェルについて計算される）1：1250 ngのTK-Lucの空（ネガティブコントロール）、950 ngのβガラクトシダーゼコーディングベクトル（のβGal）、 ミックス2 ：1250 ngのTK-LucのHOXA1エンハンサー（ポジティブコントロール）、のβGalngの950、 ミックス3：1250 NGのTK-LucのPRMT8エンハンサー（関心領域）、950 ngののβGal。
注記：ES細胞は、所望の転写因子を発現する（RAR / RXR）。ルシフェラーゼおよびβガラクトシダーゼ測定中に、後に基準値を決定するためにトランスフェクトしていない井戸を残します。 - 106μlに（8ウェルについて十分な）総容量をミックス各プラスミドにトランスフェクション品質低血清培地を追加します。
- 4.5μlのES品質トランスフェクションを追加します。イオン試薬は、次に上下に15回ピペッティングすることによって慎重に混ぜます。 RTで10分間トランスフェクション混合物をインキュベートします。
- 、ウェルあたりの細胞にトランスフェクション混合物の13μl加え、ピペッティングにより完全に混和します。バックリガンド処理前のインキュベーター（37°C）O / Nへの細胞を配置します。
- 細胞からの吸引により慎重にメディアを取り出して、250μlを添加する新鮮な培地/ウェル0.01含む - 車両として最終濃度またはDMSOなど1μMの全トランスレチノイン酸（RA）を。 48時間 - 24細胞をインキュベートします。
注：レチノイン酸は光に敏感です。
- 細胞溶解物の調製
- 希薄5倍の溶解緩衝液（1.25ミリリットル0.5 MトリスpH値= 7.8、H 2 Oで1ミリリットルの1Mジチオスレイトール（DTT）（）、10ミリリットルの0.1M EDTAをpH = 8.0、50ミリリットルの無菌グリセロール、5ミリリットルのTriton X-100、 100ミリリットルまで水）は、滅菌水を使用して1倍20μlの1 M DTT / 10ミリリットルを追加し、使用前に室温に平衡化します。アッセイの日に48ウェルプレート用の10ミリリットルを準備します。 細胞からの吸引により慎重にメディアを取り出します。 1×PBSで細胞を1回すすいでください。細胞に200μlの1×溶解緩衝液/ウェルに直接追加します。
- RTで2時間（化学溶解）振とうします。 -80°C（機械的溶解）でプレート上の細胞溶解物をフリーズします。溶解物を数日間-80℃で保存することができます。
- 溶解物を解凍します。完全に解凍した後、電子マルチチャンネルピペットを用いて96ウェルプレートに細胞溶解物を移します。 βガラクトシダーゼアッセイおよびルシフェラーゼ測定用の白色板に細胞溶解物の40μlのための96ウェル透明プレートに移し、細胞溶解物の80μlのを。任意の気泡を形成することは避けてください。
- βガラクトシダーゼアッセイ
注：ベータガラクトシダーゼまたは代替第二のレポーターは、非特異的な実験のばらつきを考慮するために、内部コントロールとして使用されるべきです。- βガラクトシダーゼ基質緩衝液を準備します：80.0グラムのNa 2 HPO 4•7H 2 O、3.8グラムののNaH 2 PO 4•H 2 O、30.0グラムのKCl、1.0グラムのMgSO 4•7H 2 O、滅菌水で千ミリリットルに構成しています。 pHを7.4に調整します。滅菌（0.2ミクロン）を濾過し、4℃で保存
- 4ミリグラムONPGで1ミリリットルβガラクトシダーゼ基質緩衝液を混合（o-ニトロフェニルβ-D-ガラクトシダーゼ）。使用直前に緩衝液1mlあたり2メルカプトエタノール（βME）の3.5μlを添加します。 80μlの細胞溶解液に100μlのβガラクトシダーゼ基質緩衝液を追加します。
- かすかな黄色が開発されるまで、37℃で反応をインキュベートします。プレートリーダーおよびエクスポートデータにOD 420 nmの吸光度を読みます。
注：時間は、通常、もう30分より、トランスフェクション効率に依存して変化しません。
- ルシフェラーゼアッセイ
- 、50ミリリットルポリプロピレンチューブに追加し、15.1ミリグラムD-ルシフェリン塩、82.7 mgのATP塩、185 mgの硫酸マグネシウム4•7H 2 O：50ミリリットルルシフェリン基質試薬を準備しますその後、1.5ミリリットルの1M HEPESバッファー、48.5ミリリットルATP遊離水、渦を追加するすべての化合物が完全に溶解していることを確認します。 -80℃で10ミリリットルのアリコート - 5を保管してください。
- 開始する前に室温に温まる5ミリリットルルシフェリン基質試薬。細胞溶解物の40μLを含む白色プレートの各ウェルにピペットで100μlの基質試薬および発光カウンター機を用いて、すぐの信号を測定します。
- 三重トランスフェクションでは、少なくとも3つの独立した実験からのアクティビティを取得します。
- 測定された各値から非トランスフェクトされた細胞について測定した平均値を減算することにより、最初の各ウェルのベース正規化されたルシフェラーゼ活性とベース正規化されたβガラクトシダーゼ値を計算します。その後、ルシフェラーゼ/βガラクトシダーゼ活性の比率を計算します。
エンハンサーRNAの3キャラクタリゼーション
注：エンハンサー活性のより直接的な指標は、最近のゲノムワットから浮上していますエンハンサーから転写され、およびエンハンサーのRNA（eRNAs）16,25,26（ 図4）と呼ばれるntの50から2000までの範囲の大きさの多くの短い非コードRNAを、識別されたIDE研究。エルナ誘導は非常に隣接するエクソンをコードする遺伝子の誘導と相関します。したがって、信号依存エンハンサー活性は、RT-qPCRにより種々の条件の間のエルナ産生を比較することにより、in vivoで定量化することができます。
- RT-qPCRによりエルナ検出用プライマーの設計のためのガイドライン
- 2キロバイト離れた注釈付きの転写開始部位から - 少なくとも1.5であるエルナ測定のためのゲノム領域を選択します。
注：重要なのは、遺伝子内エンハンサー全体のmRNA転写の高レベルはセンス方向でエルナの正確な定量化を防ぐため、遺伝子内エンハンサーでのアンチセンスeRNAsは、検出可能であり、遺伝子外エンハンサーでeRNAsにレベルが類似しています。 - 一般的なルールとして、地域200を使用 - 1,000 bpのあちこちセンスまたはアンチセンス鎖（ 図4、 図6）のプライマー設計のための目的の転写因子結合部位の中心をmです。
注：GRO-seqの、DNアーゼ-seqの、H3K4me1、H3K4me3とまたはH3K27acのChIP-seqのデータは、それがより正確なプライマー設計に使用することができ、所望の細胞型および条件から市販されている場合。 eRNAsはH3K4me1とME3の高いレベルを特徴と推定されるエンハンサー領域から転写されます。 eRNAsの発現は、積極的に活性化されたエンハンサーヒストンマークH3K27acの濃縮と相関します。 - プライマー3によってeRNAsの蛍光染料ベースのRT-qPCRの測定のための設計PCRプライマー（http://bioinfo.ut.ee/primer3/）23に従って、プライマー設計のためのアンチセンス配列（センス鎖の相補体を反転）を生成します。 http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html。プライマー設計のためのセンスまたはアンチセンス配列の300bpの - 200を挿入します。
- 2キロバイト離れた注釈付きの転写開始部位から - 少なくとも1.5であるエルナ測定のためのゲノム領域を選択します。
- エルナ転写の測定
- 製造業者の推奨に従って商業酸性フェノール/クロロホルムベースの抽出試薬で処理した細胞から全RNAを分離します。
- 前逆転写反応でそれらを使用して単離されたRNAを治療するためのDNアーゼIを使用してください。逆転写の前に、製造業者の推奨に従ってDNアーゼを不活性化します。
- DNアーゼI処理した後、RNA濃度を測定し、RT反応1,000 ngのを使用します。高品質の逆転写酵素を使用してください。
注：eRNAs多数のポリアデニル化されないかもしれないように、逆転写は、ランダムプライマーの使用を必要とします。 - 検出は、逆の標準的な手順を用いて、RT-qPCRによりエルナを転写しました。正規化のための非治療に依存してmRNAを測定する（ 例えば、36B4、PPIA、GAPDH、ACTB）。
- 初代細胞（ 例えば、初代胚線維芽細胞）からテンプレートのゲノムDNAを精製します。 gDNAの単離のための市販のキットを使用し、製造元の指示に従ってください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
我々はゲノムワイドRA調節遺伝子は、その近接して受容体濃縮を持っている識別するために、汎特異的RXR抗体を使用します。レチノイン酸で処理されたES細胞から得られたRXRチップ、配列データのバイオインフォマティクス解析は、RXR部位を占領下で核内受容体半部位（AGGTCA）（ 図1）の濃縮が明らかになりました。バイオインフォマティクスのアルゴリズムを用いて、我々はRXRのChIP-seqのデータ（ 図2）に半分サイトのモチーフ検索結果をバックマッピングされました。この分析は、正確に標準的な核内受容体結合部位と重複したものをChIPのピークを識別するために私たちを助けてくれました。 IGVにおけるこれらの部 位の視覚化はHOXA1、以前に特徴付けRAR / RXRターゲット（ 図2及び図3）に近接して、これらの転写因子の濃縮を示しました。我々はまた、新規RA標的遺伝子、すなわちPRMT8 27を同定しました 。このラtterの領域は、2つのハーフサイト（AGGTCAAGGTCA）との間にはスペーサーヌクレオチド（ 図3）との直接の繰り返しが含まれています。機能的にHOXA1のために識別された要素が実際にRAR / RXRに結合することができることを検証し、RAによって調節するために、我々は、識別された要素を含むゲノム領域300bpの〜を含まTK-ルシフェラーゼレポーターベクターを、構築しました。また、応答エレメント（ 図5）せずにベクトルを構築しました。 ES細胞は、トランスフェクトし、ルシフェラーゼ活性を、レチノイン酸（ 図5）の非存在下および存在下で測定しました。 RAREなしの構築物が誘導されなかったが、レチノイン酸応答エレメント（RARE）を含む構築物は、ショーは、RAの治療の際に、ルシフェラーゼシグナル強度を増加しました。
また、HOXA1エンハンサーのレチノイン酸依存性活性を検討しました。 HOXA1 RAR / RXRに結合したエンハンサーcのセンスおよびアンチセンスエルナ式かどうかを確認するには遺伝子のmRNA発現とorrelateは、我々はまた、HOXA1のmRNA（ 図6）のレベルを測定しました。これらの結果は、エンハンサー活性は、従ってエンハンサーはおそらくRA依存性エンハンサーの調節に関与していることを確認し、短期のRA処理（3時間）により誘導されることを確認しました。
図1. ホーマーD Eノボ Motifの結果。例RXRのChIP-seqのためのホーマーによって生成された出力HTML（homerResults.html）が示されています。シーケンスロゴはRXRに結合した遺伝子座でのde novoモチーフ発見によって識別された濃縮された転写因子のモチーフをトップに対応します。 7463 RXRは、ゲノム領域は、モチーフ検索のために使用された占有しました。これらの領域の77.66パーセントは、（＃1としてランク付け）AGGTCA様モチーフが含まれています。詳細な説明をご覧ください：（http://homer.salk.edu/hoマー/モチーフ/） この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 関心のモチーフを含む 2. 検索のゲノム領域。整列RXRのChIP-seqが統合ゲノミクスビューア（IGV）によって（mm_ES_RXR_24h_ATRA.bamとAGGTCAモチーフの発生（mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed）読み込みの可視化。アラインメントは、リードストランドによって着色されている（読み取り、赤、 -鎖：+鎖上。青）ゲノムは、位置合わせのために使用：MM10。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
JPG "/>
HOXA1とPRMT8エンハンサーの 図3. ゲノム遺伝子座27 が示されている未処理およびRA処理した（24時間、1μM）胚性幹細胞から得られたRXRのChIP-のSeq信号のIGVのスナップショット。結合配列が赤色に着色されている識別された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
。最も近い遺伝子の転写開始部位（TSS）に離れて相対2キロバイト- テストエルナコード配列図 4. 実験デザインエンハンサーRNA（エルナ）測定のために選択されたエンハンサーは、少なくとも1.5を配置する必要があります。関心とモチーフ解析の転写因子（TF）チップ、配列データは、ゲノム全体の直接の結合部位を同定するために使用され得ます。 transcripの結合として、的なコアクチベーター（ 例えば、P300）は、多くの場合、遠位エンハンサーをマークし、TFとP300の両方に富む領域が良好なエンハンサー候補です。 eRNAsの発現は、積極的に活性化されたエンハンサーヒストンマークH3K27acの濃縮と相関されます。 200の地域- 。離れてセンスまたはアンチセンス方向の転写因子結合の中心から千塩基対がエルナプライマーの設計のために推奨され、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
示されたレポーターの 図5. ルシフェラーゼ活性は、ES細胞で構築します。 HOXA1エンハンサー示すゲノム領域は、TK-Lucベクターにクローン化し、胚性幹細胞にトランスフェクトしました。 1と2は、レチノイン酸応答エレメント（RARE、国連を含ま構築derlinedシーケンス）。細胞は、RA（24時間、1μM）で処理しました。 βGalは、正規化のための内部対照として使用しました。バーは4生物学的複製からの平均正規化した値を表します。 ±SD *** P <0.005 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
RT-qPCRにより測定されるように、図6レチノイン酸誘導性エンハンサーRNA転写。HOXA1のmRNAとエルナレベル。全RNAを、レチノイン酸（RA）またはビヒクルとしてDMSO（VEH）で3時間処理したES細胞から単離しました。センスおよびアンチセンスエルナ検出とPCRアンプリコンのためのフォワードプライマーを示しています。 RXR結合部位の中心からエルナRT-qPCRにより検出された領域の距離が示されています。値は、36B4のMR平均値に正規化しましたNA。データは平均値±s *** P <0.005を意味表す。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD DNA polymerase | Merck Millipore | 71085-3 | for PCR amplification of enhancer from gDNA |
| DNeasy Blood & Tissue kit | Qiagen | 69504 | for genomic DNA isolation |
| QIAquick PCR Purification kit | Qiagen | 28106 | for PCR product purification |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28706 | for gel extraction if there are more PCR product |
| HindIII | NEB | R3104L | restriction enzyme |
| BamHI | NEB | R3136L | restriction enzyme |
| FastAP | Thermo Scientific | EF0651 | release of 5'- and 3'-phosphate groups from DNA |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | for ligation |
| QIAprep Spin Miniprep kit | Qiagen | 27106 | for plasmid isolation |
| DMEM | Gibco | 31966-021 | ES media |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | ES media |
| MEM Non-Essential Amino Acid | Sigma | M7145 | ES media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | ES media |
| Beta Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | ES media |
| FuGENE HD | Promega | E2311 | transfection reagent |
| Opti-MEM® I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 31985-062 | for transfection |
| All-trans retinoic acid | Sigma | R2625 | ligand, for activation of RAR/RXR |
| 96-well clear plate | Greiner | 655101 | for Beta galactosidase assay |
| 96-well white plate | Greiner | 655075 | for Luciferase assay |
| D-luciferin, potassium salt | Goldbio.com | 115144-35-9 | for Luciferase assay |
| ATP salt | Sigma | A7699-1G | for Luciferase assay |
| MgSO4•7H2O | Sigma | 230391-25G | for Luciferase assay |
| HEPES | Sigma | H3375-25G | for Luciferase assay |
| Na2HPO4 •7H2O | Sigma | 431478-50G | for Beta galactosidase assay |
| NaH2PO4 •H2O | Sigma | S9638-25G | for Beta galactosidase assay |
| MgSO4•7H2O | Sigma | 230391-25G | for Beta galactosidase assay |
| KCl | Sigma | P9541-500G | for Beta galactosidase assay |
| ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactosidase) | Sigma | N1127-1G | for Beta galactosidase assay |
| TRIzol® | Life Technologies | 15596-026 | RNA isolation |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies | 4368814 | reverse transcription of eRNA |
| Rnase-free Dnase | Promega | M6101 | Dnase treatment |
| SsoFast Eva Green | BioRad | 750000105 | RT-qPCR mastermix |
| CFX384 Touch™ Real-Time PCR Detection System | BioRad | qPCR machine | |
| BioTek Synergy 4 microplate reader | BioTek | luminescent counter |
References
- Wamstad, J. A., Wang, X., Demuren, O. O., Boyer, L. A. Distal enhancers: new insights into heart development and disease. Trends in cell biology. 24, 294-302 (2014).
- Pennacchio, L. A., Bickmore, W., Dean, A., Nobrega, M. A., Bejerano, G.
- Mardis, E. R. ChIP-seq: welcome to the new frontier. Nature methods. 4, 613-614 (2007).
- Muller, F., Tora, L. Chromatin and DNA sequences in defining promoters for transcription initiation. Biochim Biophys Acta. 1839, 118-128 (2013).
- Ounzain, S., Pedrazzini, T. The promise of enhancer-associated long noncoding RNAs in cardiac regeneration. Trends Cardiovasc Med. , (2015).
- Lam, M. T., Li, W., Rosenfeld, M. G., Glass, C. K. Enhancer RNAs and regulated transcriptional programs. Trends Biochem Sci. 39, 170-182 (2014).
- Dickel, D. E., et al. Function-based identification of mammalian enhancers using site-specific integration. Nature methods. 11, 566-571 (2014).
- Blum, R., Vethantham, V., Bowman, C., Rudnicki, M., Dynlacht, B. D. Genome-wide identification of enhancers in skeletal muscle: the role of MyoD1. Genes Dev. 26, 2763-2779 (2012).
- Vermunt, M. W., et al. Large-scale identification of coregulated enhancer networks in the adult human brain. Cell reports 9. , 767-779 (2014).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev Biol. 168, 342-357 (1995).
- Mahony, S., et al. Ligand-dependent dynamics of retinoic acid receptor binding during early neurogenesis. Genome Biol. 12 (R2), (2011).
- Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies. FEBS Lett. 584, 3123-3130 (2010).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38, 576-589 (2010).
- Robinson, J. T., et al.
- Daniel, B., et al. The active enhancer network operated by liganded RXR supports angiogenic activity in macrophages. Genes Dev. 28, 1562-1577 (2013).
- Zhu, Y., et al. Predicting enhancer transcription and activity from chromatin modifications. Nucleic Acids Res. 41, 10032-10043 (2013).
- Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457, 854-858 (2009).
- Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nat Genet. 39, 311-318 (2007).
- Rada-Iglesias, A., et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470, 279-283 (2010).
- Bonn, S., et al. Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development. Nat Genet. 44, 148-156 (2012).
- Hollenberg, S. M., Giguere, V., Segui, P., Evans, R. M. Colocalization of DNA-binding and transcriptional activation functions in the human glucocorticoid receptor. Cell. 49, 39-46 (1987).
- Untergasser, A., et al.
- Rhead, B., et al. The UCSC Genome Browser database: update 2010. Nucleic Acids Res. 38, D613-D619 (2010).
- Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465, 182-187 (2010).
- Wang, D., et al. Reprogramming transcription by distinct classes of enhancers functionally defined by eRNA. Nature. 474, 390-394 (2011).
- Simandi, Z., et al. PRMT1 and PRMT8 regulate retinoic acid-dependent neuronal differentiation with implications to neuropathology. Stem Cells. 33, 726-741 (2014).
- Zhou, H. Y., et al. A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential. Genes Dev. 28, 2699-2711 (2014).
