Abstract
Lo sviluppo embrionale è un processo a più fasi che coinvolge l'attivazione e la repressione di molti geni. Elementi Enhancer nel genoma sono noti per contribuire al tessuto e cellula-tipo regolazione specifica dell'espressione genica durante la differenziazione cellulare. Pertanto, la loro identificazione e un'ulteriore indagine è importante per comprendere come il destino della cellula è determinata. Integrazione dei dati di espressione genica (ad esempio, microarray o RNA-Seq) e risultati di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) basata su studi genome-wide (ChIP-Seq) permette l'identificazione su larga scala di queste regioni regolatorie. Tuttavia, validazione funzionale di esaltatori specifici di tipo a cella richiede ulteriori in vitro e in vivo procedure sperimentali. Qui si descrive come esaltatori attivi possono essere identificati e validati sperimentalmente. Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro passo-passo che comprende: 1) l'identificazione di regioni regolatorie attraverso l'analisi, 2) la clonazione e exper dati ChIP-Seqconvalida imental del potenziale normativo putativo delle sequenze genomiche identificate in un saggio giornalista, e 3) determinazione dell'attività enhancer in vivo misurando il livello trascrizione di RNA enhancer. Il protocollo presentato è abbastanza dettagliata per aiutare chiunque a creare questo flusso di lavoro nel laboratorio. Soprattutto, il protocollo può essere facilmente adattato e utilizzato in qualsiasi sistema modello cellulare.
Protocol
1. Enhancer selezione basata su analisi Chip-Seq
- Scaricare il file di dati grezzi FASTQ RXR ChIP-Seq (mm_ES_RXR_24h_ATRA.fastq.gz) da http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
- Scaricare ed estrarre il file di indice BWA necessario per l'allineamento (nel nostro caso: Mus_musculus_UCSC_mm10).(ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/Mus_musculus/UCSC/mm10/Mus_musculus_UCSC_mm10.tar.gz
NOTA: Visita a https://github.com/ahorvath/Bioinformatics_scripts per ulteriori informazioni per quanto riguarda le fasi di analisi bioinformatica e per scaricare gli script usati di seguito. - Allineare il file di esempio FASTQ al genoma MM10 (utilizzare lo script: perform_alignment.sh). Questo creerà una cartella con un file .bam e le statistiche del tracciato. RXR ChIP-Seq dati allineati (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam), e il file di indice corrispondente (.bai) sono disponibili qui:
http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
NOTA: BWA è un pacchetto software che si allinea relasequenze relativamente brevi (ad esempio, risultati ChIP-seq) ad un database di sequenze, come il genoma di riferimento del mouse (ad esempio, mm10) 13. - Eseguire lo script (callpeaks.sh) per il picco di chiamata e de novo analisi motivo. Utilizzare il file .bam come ingresso. Lo script si basa su Homer findPeaks 14.
NOTA: I file di output ci danno informazioni sul numero totale dei picchi, l'arricchimento dei motivi, la percentuale dello sfondo, e le sequenze bersaglio con motivi, ecc. (Figura 1). Tipicamente diversi motivi sono elencati in ordine del loro significato. - Rimappare il # 1 motivo classificato (NR metà `AGGTCA`) (utilizzare lo script: remap_motif.sh)
NOTA: Come risultato, lo script genera un file .bed che mostrerà quale chip-picchi coprono regioni genomiche che contengono il sito di legame canonica del fattore di trascrizione di interesse. - Scaricare e visualizzare i risultati della allineato RXR ChIP-Seq legge (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam (anche scaricare il .bai)) e le occorrenze motivo AGGTCA (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) da Integrativa Genomica Viewer (IGV) 15 per identificare RAR putativo / RXR siti di legame (Figura 2 e Figura 3).
NOTA: L'integrazione di vari dati del chip-ss aiuterà a più prevedere con precisione le buone esaltatori di candidati 16,17. Recenti studi hanno rivelato che esaltatori attivi sono in genere arricchito da P300 e correlazione con H3K4me1 e H3K27ac, e si trovano in regioni della cromatina aperta, mostrando in tal modo DNase-I ipersensibilità è anche raccomandato 18-21. - Utilizzare la "Definizione di una regione di interesse" in IGV 15 per ottenere 200-400 sequenza bp della regione genomica selezionata e utilizzare queste sequenze per le successive disegni di primer.
2. Reporter Assay
NOTA: Il sistema luciferina / luciferasi viene utilizzatocome un saggio giornalista molto sensibile per la regolazione trascrizionale. A seconda della luciferasi enzimatica enhancer è prodotta che catalizzare l'ossidazione di luciferina per oxyluciferin conseguente bioluminescense, che può essere rilevato. Come primo passo, identificate sequenze enhancer putativi dovrebbero essere subclonati in un vettore giornalista (ad esempio, TK-luciferasi 22, pGL3 o NanoLuc).
- disegno Primer
- Primer design PCR per l'amplificazione di 200-400 bp di regioni enhancer putativi da Primer3 (disponibile qui: http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23
- Copia-incolla la sequenza genomica da IGV che include il sito di legame putativo in Primer3 (vedi punto 1.7). Set gamma di dimensioni prodotto da 250-300 bp Primer3.
- Convalida i primer PCR utilizzando il browser UCSC genoma di In silico strumento PCR (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) 24
NOTA: Questo protocollo in un passaggio successivo utilizza HindIII e BamHI enzimi di restrizione per la clonazione. Controllare se la PCR sequenza amplificata come previsto dallo strumento PCR UCSC in silico conterrà AAGCTT o GGATCC siti di restrizione (ad esempio, http://nc2.neb.com/NEBcutter2/). - Ottenere i primer richiesti da un fornitore commerciale.
- PCR amplificazione di Enhancer sequenza da DNA genomico
- Purificare modello DNA genomico da cellule primarie (ad esempio, fibroblasti embrionali primari). Utilizzare kit commerciale per l'isolamento gDNA e seguire le istruzioni del produttore.
NOTA: L'alta qualità di gDNA è essenziale per l'amplificazione PCR di successo. Appropriate cloni BAC possono essere utilizzati se la PCR non è facile da gDNA. - Preparare 50 microlitri reazione PCR contenente 100 ng gDNA, 5 ml 10x tampone, 3 ml MgSO 4 (25 mm), 5 ml dNTP (2 mm ciascuno), 1,5 ml Fwd Primer (10 micron), 1,5 ml Rev Primer (10 micron) , 1 microlitri DNA polimerasi
- Impostare il ciclo di PCR (2 min 95 ° C, (20 sec a 95 ° C, 10 sec 58 - 65 ° C, 18 sec a 70 ° C) ripetizione x25, 2 min a 70 ° C, sempre 4 ° C). Impostare la temperatura di ricottura con la considerazione del primer del predetto valori Tm.
- Purificare il prodotto di PCR con un kit commerciale di purificazione PCR e seguire le istruzioni del produttore.
- Introdurre i siti di restrizione per la clonazione ripetendo la PCR con primer usati in precedenza, ma l'aggiunta di sporgenze sulle loro estremità 5 '(ad esempio, Fwd: 5'-ATAT AAGCTT xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx-3' (HindIII), Rev: 5'-TATA GGATCC xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx -3 '(BamHI)).
- Eseguire 5 ml di prodotto di PCR su gel di agarosio per verificare la presenza di prodotti di PCR aspecifici.
NOTA: Se vengono rilevati più bande, eseguire l'intero prodotto PCR e purificare la banda appropriata da un kit di estrazione del gel commerciale. - Limitazione
NOTA: Per clonare inserto a monte della TK promotore 22 il prodotto purificato PCR e il vettore (ad esempio, TK-Luc) deve essere digerito con HindIII e BamHI.- Preparare una miscela di reazione di 50 ml contenente 1 mg di prodotto purificato PCR, 1 HindIII microlitri (20 U / mL), 1 ml BamHI (20 U / ml) e 5 ml 10x tampone.
- Preparare una 250 miscela di reazione microlitri contenente vettore 5 mcg (TK Luc, o un vettore giornalista alternativo), 5 ml HindIII (20 U / ml), 5 ml BamHI (20 U / ml), 5 ml termosensibile fosfatasi alcalina (1 U / ml) e 25 microlitri 10x tampone.
NOTA: Trattamento AP del vettore diminuisce notevolmente l'auto-ligazione del singolo vettore digerito e quindi lo sfondo. - Incubare le miscele di reazione per 4 ore a 37 ° C, quindi purificare i prodotti di PCR digerito e il vettore con un kit commerciale di purificazione PCR.
- ligation
- Impostare la reazione per la legatura in provette da PCR di cui 2 ml 10x T4 tampone DNA ligasi, 10 ng TK-Luc vettore, inserto 50 ng (prodotto di PCR digerito), 1 ml T4 DNA ligasi (400 U / ml) e priva di nucleasi acqua fino a 20 microlitri.
NOTA: Preparare un controllo negativo in cui la reazione non contiene inserto. - Mescolare delicatamente la reazione pipettando su e giù, centrifugare brevemente le provette per PCR utilizzando mini-centrifuga e poi incubare a temperatura ambiente per 10 min.
- Calore inattivare a 65 ° C per 10 minuti poi raffreddare in ghiaccio e usare 5 ml di prodotto per la trasformazione in 50 microlitri cellule competenti (ad esempio, DH5α).
- Utilizzare procedura di shock termico standard per trasformare i batteri, raccogliere le colonie e isolare il DNA plasmide con un kit commerciale. Convalida tutti i costrutti da sequenziamento prima delle fasi successive.
- Impostare la reazione per la legatura in provette da PCR di cui 2 ml 10x T4 tampone DNA ligasi, 10 ng TK-Luc vettore, inserto 50 ng (prodotto di PCR digerito), 1 ml T4 DNA ligasi (400 U / ml) e priva di nucleasi acqua fino a 20 microlitri.
- Trasfezione delle cellule ES
- Usare piatti 48 pozzetti. Aggiungere 200 ml 0,1% di gelatina solution / pozzetto 30 min prima placcatura cellule.
- staminali embrionali (ES), le cellule piastra al giorno prima di trasfezione. Utilizzare ES cellule libera-feeder e la piastra ad una densità di 3 x 10 4 cellule per pozzetto in 250 microlitri ES media / bene.
- Preparare le miscele plasmide (ciascuna miscela viene calcolato per 8 pozzi, 4 non trattata e 4 trattati con acido retinoico) Mix 1:. 1.250 ng TK-Luc vuoto (controllo negativo), 950 ng β-galattosidasi codifica vettore (βGal), Mix 2 : 1.250 ng TK-Luc HOXA1 enhancer (controllo positivo), 950 ng βGal, Mix 3: 1.250 ng TK-Luc PRMT8 enhancer (regione di interesse), 950 ng βGal.
NOTA: cellule staminali embrionali esprimono i fattori di trascrizione desiderati (RAR / RXR). Lasciare pozzi untransfected per determinare i valori di base in seguito durante le misurazioni luciferasi e β-galattosidasi. - Aggiungere qualità trasfezione mezzi siero ridotto a ciascun plasmide mescolare fino a 106 microlitri volume totale (sufficiente per 8 pozzetti).
- Aggiungere 4,5 microlitri transfect qualità ESione reagente quindi mescolare accuratamente pipettando 15 volte su e giù. Incubare la miscela di trasfezione per 10 minuti a RT.
- Aggiungere 13 ml di mix trasfezione le cellule per bene, mescolare accuratamente pipettando. Posizionare le cellule di nuovo nel incubatore (37 ° C) O / N prima del trattamento ligando.
- Rimuovere i supporti con cura mediante aspirazione dalle cellule e aggiungere 250 microlitri fresca media / pozzetto contenente 0,01 - 1 micron tutto-trans retinoico (RA) come concentrazione finale o DMSO come veicolo. Incubare le cellule per 24 - 48 ore.
NOTA: L'acido retinoico è sensibile alla luce.
- Preparazione di lisati cellulari
- Diluire 5x Lysis Buffer (1,25 ml 0,5 M Tris pH = 7.8, 1 ml 1 M ditiotreitolo (DTT) (in H 2 O), 10 ml di 0,1 M EDTA pH = 8,0, 50 ml di glicerolo, 5 ml di Triton X-100, sterili acqua fino a 100 ml) a 1x con acqua sterile, aggiungere 20 ml 1 M DTT / 10 ml e portare a RT prima dell'uso. Preparare 10 ml per una piastra a 48 pozzetti il giorno del test. Rimuovere i supporti con cura per aspirazione da cellule. Lavare le cellule una volta con PBS 1x. Aggiungere 200 microlitri 1x tampone di lisi / pozzetto direttamente alle cellule.
- Agitare per 2 ore a temperatura ambiente (lisi chimica). Congelare i lisati cellulari sulla piastra a -80 ° C (lisi meccanica). Lisati possono essere conservati a -80 ° C per diversi giorni.
- Scongelare i lisati. Dopo aver completato lo scongelamento, trasferire lisati cellulari ad una piastra a 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale elettronica. Trasferimento 80 ml di lisato cellulare a piastra a 96 pozzetti chiaro per il dosaggio β-galattosidasi e 40 ml di lisato cellulare a un piatto bianco per la misurazione della luciferasi. Evitare la formazione di eventuali bolle.
- β-galattosidasi Assay
NOTA: beta-galattosidasi o seconde giornalisti alternativi debbano essere usati come controllo interno per tenere conto di non specifici variazioni sperimentali.- Preparare tampone substrato β-galattosidasi: 80,0 g Na 2 HPO 4 • 7H 2 O,3,8 g NaH 2 PO 4 • H 2 O, 30,0 g KCl, 1,0 g MgSO 4 • 7H 2 O, portare a 1000 ml con acqua sterile. Regolare il pH a 7,4. Filtro sterilizzare (0,2 micron) e conservare a 4 ° C
- Mescolare tampone substrato 1 ml β-galattosidasi con 4 mg ONPG (o-nitrofenil-β-D-galattosidasi). Aggiungere 3,5 ml di 2-mercaptoetanolo (βME) per 1 ml di tampone appena prima dell'uso. Aggiungere 100 microlitri tampone del substrato β-galattosidasi al 80 microlitri lisato cellulare.
- Incubare le reazioni a 37 ° C fino ad un colore giallo tenue è sviluppato. Leggere l'assorbanza a OD 420 nm su un lettore di piastre ed esportare i dati.
NOTA: Il tempo varia a seconda della efficienza di trasfezione, di solito non più di 30 min.
- Assay luciferasi
- Preparare 50 ml substrato luciferina reagente: 15.1 mg di sale D-luciferina, 82,7 mg di sale ATP, 185 mg MgSO 4 • 7H 2 O, aggiungere 50 ml di tubo di polipropilene,quindi aggiungere 1,5 ml 1 M tampone HEPES, 48,5 ml ATP acqua libera, vortice, assicurarsi che tutti i composti si dissolvono completamente. Tenere 5 - 10 ml aliquote a -80 ° C.
- Warm 5 ml substrato luciferina reagente per RT prima di iniziare. Pipettare 100 microlitri reagente substrato a ciascun pozzetto della piastra bianca contenente 40 ml di lisato cellulare e misurare il segnale immediatamente utilizzando una macchina contatore luminescenti.
- Ottenere le attività da almeno tre esperimenti indipendenti in trasfezioni triplice copia.
- Calcolare prima il normalizzata l'attività della luciferasi base e valori β-galattosidasi normalizzate di base per ogni bene sottraendo i valori medi misurati per le cellule non transfettate di ogni valore misurato. Quindi calcolare il rapporto di attività luciferasi / β-galattosidasi.
3. Caratterizzazione di Enhancer RNA
NOTA: Un indicatore più diretto di attività enhancer è emerso dalla recente genoma-wstudi ide che ha individuato molti RNA non codificanti brevi, di dimensioni variabili da 50 a 2.000 nt, che sono trascritti da esaltatori, e sono denominate RNA Enhancer (eRNA) 16,25,26 (Figura 4). eRNA induzione altamente correlata con l'induzione di geni esone codificante adiacenti. Così, l'attività enhancer segnale-dipendente può essere quantificato in vivo confrontando la produzione eRNA tra varie condizioni di RT-qPCR.
- Linee guida per la progettazione Primer per il rilevamento Erna di RT-qPCR
- Selezionare regioni genomiche per misure erna che sono almeno 1,5 - 2 kb lontano da siti di inizio della trascrizione annotati.
NOTA: È importante sottolineare che, alti livelli di mRNA trascrizione attraverso esaltatori intragenica prevenire quantificazione accurata Erna nell'orientamento senso, eRNA antisenso a esaltatori intragenica sono rilevabili e sono simili a livello di eRNA a esaltatori extrageniche. - Come regola generale, utilizzare le regioni 200 - 1.000 bp from il centro del fattore di trascrizione sito di interesse per la progettazione di primer sia sul senso o antisenso filamento (Figura 4 e Figura 6) vincolante.
NOTA: Se GRO-ss, DNasi-ss, H3K4me1, H3K4me3 o dati H3K27ac ChIP-Seq sono disponibili presso i tipi di cellule desiderate e condizioni può essere utilizzato per la progettazione di primer più accurata. eRNA sono trascritti dalle regioni enhancer putativo caratterizzate da alti livelli di H3K4me1 e ME3. L'espressione di eRNA correla positivamente con l'arricchimento di attivazione marchio enhancer istone H3K27ac. - Progettazione PCR primer per la misurazione RT-qPCR di eRNA a base di colorante fluorescente di Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23 Generare la sequenza anti-senso (complemento del filamento senso inverso) per la progettazione di fondo come per: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html. Inserire 200-300 bp di senso o anti-senso sequenza per la progettazione di primer.
- Selezionare regioni genomiche per misure erna che sono almeno 1,5 - 2 kb lontano da siti di inizio della trascrizione annotati.
- Misura Erna Trascrizione
- Isolare RNA totale da cellule trattate con acido commerciale di fenolo / cloroformio a base di reagente di estrazione in base alle raccomandazioni del fabbricante.
- Utilizzare DNasiI per il trattamento di RNA isolato prima di utilizzarli nella reazione di trascrizione inversa. Inattivare DNasi secondo le raccomandazioni del fabbricante, prima di invertire la trascrizione.
- Misurare la concentrazione di RNA dopo il trattamento DNasi I e usare 1,000 ng per reazione RT. Utilizzare trascrittasi inversa di alta qualità.
NOTA: Come gran numero di eRNA non può essere poliadenilato, trascrizione inversa richiede l'uso di primer casuali. - Rileva trascrizione inversa Erna di RT-qPCR utilizzando la procedura standard. Misurare un mRNA non-trattamento-dipendente per la normalizzazione (ad esempio, 36B4, PPIA, GAPDH, ACTB).
- Purificare modello DNA genomico da cellule primarie (ad esempio, fibroblasti embrionali primari). Utilizzare kit commerciale per l'isolamento gDNA e seguire le istruzioni del produttore.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Abbiamo utilizzato un anticorpo specifico-pan RXR al fine di identificare quali geni RA-regolati a livello di genoma hanno recettore arricchimento nella loro immediate vicinanze. L'analisi bioinformatica delle RXR dati del chip-ss ottenuti da cellule ES trattate con acido retinoico ha rivelato l'arricchimento del mezzo sito recettore nucleare (AGGTCA) sotto il RXR siti occupati (figura 1). Utilizzando un algoritmo di bioinformatica abbiamo mappato di nuovo il risultato della ricerca motivo per metà sito ai dati RXR ChIP-Seq (Figura 2). Questa analisi ci ha aiutato a identificare con precisione i picchi ChIP che sono state sovrapposizioni con recettori nucleari siti di legame canoniche. La visualizzazione di questi siti in IGV ha indicato l'arricchimento di questi fattori di trascrizione nelle immediate vicinanze di HOXA1, un obiettivo RAR / RXR precedentemente caratterizzato (Figura 2 e Figura 3). Abbiamo anche individuato un gene bersaglio romanzo RA, vale a dire PRMT8 27. questa laregione tter contiene una ripetizione diretta senza nucleotidi distanziatori tra i due siti mezze (AGGTCAAGGTCA) (Figura 3). Per convalidare funzionalmente che l'elemento identificato per HOXA1 può infatti legare RAR / RXR e regolata da RA abbiamo costruito vettori giornalista TK-luciferasi che contenevano ~ 300bp regione genomica, compresi gli elementi individuati. Abbiamo anche costruito vettori senza l'elemento di risposta (Figura 5). Cellule ES sono state trasfettate e attività della luciferasi è stata misurata in assenza e in presenza di acido retinoico (Figura 5). Costrutti contenenti l'elemento di risposta acido retinoico (RARE) mostrò un aumento dell'intensità del segnale luciferasi in seguito al trattamento RA, mentre il costrutto senza l'RARE non era inducibile.
Abbiamo anche studiato l'attività di acido retinoico-dipendente del enhancer HOXA1. Per accertare se il senso e anti-senso eRNA espressione del HOXA1 RAR / RXR-bound enhancer correlate con l'espressione mRNA del gene, abbiamo misurato anche il livello di mRNA HOXA1 (Figura 6). Questi risultati hanno confermato che l'attività enhancer è indotta da trattamenti RA a breve termine (3 ore), confermando in tal modo che l'enhancer è probabilmente coinvolti nella regolazione enhancer RA-dipendente.
Figura 1. Homer D e Novo Motif Risultati. Viene visualizzata una HTML uscita (homerResults.html) generato da Omero per l'esempio RXR ChIP-Seq. Loghi sequenza corrispondente a inizio arricchiti di trascrizione motivi fattore identificati da de novo scoperta motivo a loci RXR-bound. 7463 RXR occupato regioni genomiche sono stati utilizzati per la ricerca motivo. 77.66% di queste regioni contiene motivo AGGTCA-like (classificato come # 1). Per una descrizione dettagliata visita: (http://homer.salk.edu/ho mer / motivo /) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Trovare genomiche regioni contenenti Motivo di interesse. Visualizzazione del allineato RXR ChIP-Seq letture (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam e le occorrenze motivo AGGTCA (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) da integrativo di genomica Viewer (IGV). Allineamenti sono colorati da Leggi Strand (legge il + filo: rosso, - filo:. blu) Genome utilizzato per l'allineamento: MM10. clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
jpg "/>
Figura 3. genomica Loci di HOXA1 e PRMT8 Enhancers. IGV un'istantanea di RXR segnali ChIP-Seq ottenuti da (24 ore, 1 micron) le cellule staminali embrionali non trattate e RA-trattati 27 sono mostrati. Identificate sequenze di legame sono di colore rosso. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
. Figura 4. disegno sperimentale per le prove Erna sequenze codificanti Enhancers scelti per la misurazione potenziatore RNA (eRNA) deve essere posizionato ad almeno 1,5 - 2 kb via rispetto al sito di inizio della trascrizione (TSS) del gene più vicino. Dati chip-seguenti del fattore di trascrizione (TF) di interesse e l'analisi motivo possono essere utilizzati per identificare i siti di legame diretto genoma-larga. Come legame di transcripzionale coactivator (ad esempio, P300) spesso segna esaltatori distali, le regioni arricchite sia per il TF e P300 sono buoni candidati enhancer. L'espressione di eRNA è correlata positivamente con l'arricchimento di attivazione marchio enhancer istone H3K27ac. Regioni 200 -. 1.000 bp via in senso o la direzione anti-senso dal centro del fattore di trascrizione vincolante è raccomandato per la progettazione eRNA fondo Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. luciferasi di attività del reporter indicato il Costruisce in cellule ES. Indicato regioni genomiche del enhancer HOXA1 sono stati clonati in TK-Luc vettoriale e trasfettati in cellule staminali embrionali. Costruire 1 e 2 conteneva l'elemento di risposta acido retinoico (RARE, unsequenza derlined). Le cellule sono state trattate con RA (24 hr, 1 mM). βGal è stato utilizzato come controllo interno per la normalizzazione. Barre rappresentano valori normalizzati medi provenienti da quattro repliche biologiche. Sd ± *** P <0.005 Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. livelli di acido retinoico Induced Enhancer RNA trascrizione. HOXA1 mRNA e Erna come misurato mediante RT-qPCR. L'RNA totale è stato isolato da cellule ES trattati per 3 ore con acido retinoico (RA) o DMSO come veicolo (veh). primer in avanti per il senso e anti-senso di rilevamento eRNA e gli ampliconi della PCR sono mostrati. Distanza di regioni rilevati da eRNA RT-qPCR dal centro del sito di legame RXR è indicato. I valori sono stati normalizzati per la media di 36B4 mRN / A. I dati rappresentano media ± sem *** P <0.005 Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD DNA polymerase | Merck Millipore | 71085-3 | for PCR amplification of enhancer from gDNA |
| DNeasy Blood & Tissue kit | Qiagen | 69504 | for genomic DNA isolation |
| QIAquick PCR Purification kit | Qiagen | 28106 | for PCR product purification |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28706 | for gel extraction if there are more PCR product |
| HindIII | NEB | R3104L | restriction enzyme |
| BamHI | NEB | R3136L | restriction enzyme |
| FastAP | Thermo Scientific | EF0651 | release of 5'- and 3'-phosphate groups from DNA |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | for ligation |
| QIAprep Spin Miniprep kit | Qiagen | 27106 | for plasmid isolation |
| DMEM | Gibco | 31966-021 | ES media |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | ES media |
| MEM Non-Essential Amino Acid | Sigma | M7145 | ES media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | ES media |
| Beta Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | ES media |
| FuGENE HD | Promega | E2311 | transfection reagent |
| Opti-MEM® I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 31985-062 | for transfection |
| All-trans retinoic acid | Sigma | R2625 | ligand, for activation of RAR/RXR |
| 96-well clear plate | Greiner | 655101 | for Beta galactosidase assay |
| 96-well white plate | Greiner | 655075 | for Luciferase assay |
| D-luciferin, potassium salt | Goldbio.com | 115144-35-9 | for Luciferase assay |
| ATP salt | Sigma | A7699-1G | for Luciferase assay |
| MgSO4•7H2O | Sigma | 230391-25G | for Luciferase assay |
| HEPES | Sigma | H3375-25G | for Luciferase assay |
| Na2HPO4 •7H2O | Sigma | 431478-50G | for Beta galactosidase assay |
| NaH2PO4 •H2O | Sigma | S9638-25G | for Beta galactosidase assay |
| MgSO4•7H2O | Sigma | 230391-25G | for Beta galactosidase assay |
| KCl | Sigma | P9541-500G | for Beta galactosidase assay |
| ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactosidase) | Sigma | N1127-1G | for Beta galactosidase assay |
| TRIzol® | Life Technologies | 15596-026 | RNA isolation |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies | 4368814 | reverse transcription of eRNA |
| Rnase-free Dnase | Promega | M6101 | Dnase treatment |
| SsoFast Eva Green | BioRad | 750000105 | RT-qPCR mastermix |
| CFX384 Touch™ Real-Time PCR Detection System | BioRad | qPCR machine | |
| BioTek Synergy 4 microplate reader | BioTek | luminescent counter |
References
- Wamstad, J. A., Wang, X., Demuren, O. O., Boyer, L. A. Distal enhancers: new insights into heart development and disease. Trends in cell biology. 24, 294-302 (2014).
- Pennacchio, L. A., Bickmore, W., Dean, A., Nobrega, M. A., Bejerano, G.
- Mardis, E. R. ChIP-seq: welcome to the new frontier. Nature methods. 4, 613-614 (2007).
- Muller, F., Tora, L. Chromatin and DNA sequences in defining promoters for transcription initiation. Biochim Biophys Acta. 1839, 118-128 (2013).
- Ounzain, S., Pedrazzini, T. The promise of enhancer-associated long noncoding RNAs in cardiac regeneration. Trends Cardiovasc Med. , (2015).
- Lam, M. T., Li, W., Rosenfeld, M. G., Glass, C. K. Enhancer RNAs and regulated transcriptional programs. Trends Biochem Sci. 39, 170-182 (2014).
- Dickel, D. E., et al. Function-based identification of mammalian enhancers using site-specific integration. Nature methods. 11, 566-571 (2014).
- Blum, R., Vethantham, V., Bowman, C., Rudnicki, M., Dynlacht, B. D. Genome-wide identification of enhancers in skeletal muscle: the role of MyoD1. Genes Dev. 26, 2763-2779 (2012).
- Vermunt, M. W., et al. Large-scale identification of coregulated enhancer networks in the adult human brain. Cell reports 9. , 767-779 (2014).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev Biol. 168, 342-357 (1995).
- Mahony, S., et al. Ligand-dependent dynamics of retinoic acid receptor binding during early neurogenesis. Genome Biol. 12 (R2), (2011).
- Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies. FEBS Lett. 584, 3123-3130 (2010).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38, 576-589 (2010).
- Robinson, J. T., et al.
- Daniel, B., et al. The active enhancer network operated by liganded RXR supports angiogenic activity in macrophages. Genes Dev. 28, 1562-1577 (2013).
- Zhu, Y., et al. Predicting enhancer transcription and activity from chromatin modifications. Nucleic Acids Res. 41, 10032-10043 (2013).
- Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457, 854-858 (2009).
- Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nat Genet. 39, 311-318 (2007).
- Rada-Iglesias, A., et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470, 279-283 (2010).
- Bonn, S., et al. Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development. Nat Genet. 44, 148-156 (2012).
- Hollenberg, S. M., Giguere, V., Segui, P., Evans, R. M. Colocalization of DNA-binding and transcriptional activation functions in the human glucocorticoid receptor. Cell. 49, 39-46 (1987).
- Untergasser, A., et al.
- Rhead, B., et al. The UCSC Genome Browser database: update 2010. Nucleic Acids Res. 38, D613-D619 (2010).
- Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465, 182-187 (2010).
- Wang, D., et al. Reprogramming transcription by distinct classes of enhancers functionally defined by eRNA. Nature. 474, 390-394 (2011).
- Simandi, Z., et al. PRMT1 and PRMT8 regulate retinoic acid-dependent neuronal differentiation with implications to neuropathology. Stem Cells. 33, 726-741 (2014).
- Zhou, H. Y., et al. A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential. Genes Dev. 28, 2699-2711 (2014).
