Abstract
התפתחות עוברת היא תהליך רב שלבי מעורבי הפעלה ודיכוי של גנים רבים. אלמנטים Enhancer בגנום ידועים לתרום תקנה רקמות תאים מסוג מסוים של ביטוי גנים במהלך התמיינות תאים. לכן, זיהוי שלהם לחקירה נוספת חשוב על מנת להבין כיצד גורל תא נקבע. אינטגרציה של נתוני ביטוי גנים (למשל, microarray או RNA-seq) ותוצאות immunoprecipitation הכרומטין (שבב) מחקרים הגנום כולו מבוסס (שבב seq) מאפשרת זיהוי בקנה מידה הגדולה של אזורים רגולטוריים אלה. עם זאת, אימות פונקציונלית של משפר ספציפי תא מהסוג דורשת עוד במבחנת פרוצדורות vivo. כאן אנו מתארים כיצד משפרים פעילים ניתן לזהות ומאומתים באופן ניסיוני. פרוטוקול זה מספק עבודה צעד-אחר-צעד, הכוללת: 1) זיהוי של אזורים רגולטוריים על ידי ניתוח נתונים שבב seq, 2) שיבוט experאימות imental פוטנציאל רגולציה משוערת של רצפי הגנום המזוהים ב assay כתב, ו -3) קביעת הפעילות משפר in vivo על ידי מדידת רמת תעתיקי הרנ"א משפר. הפרוטוקול המובא מפורט מספיק כדי לעזור למישהו להקים זרימת עבודה זו במעבדה. חשוב לציין כי הפרוטוקול ניתן להתאים בקלות והשתמש בכל מערכת מודל הסלולר.
Protocol
Enhancer 1. בחירה בהתבסס על ניתוח צ'יפ-seq
- הורד את הקובץ fastq הנתונים הגולמיים RXR שבב seq (mm_ES_RXR_24h_ATRA.fastq.gz) מ http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
- הורד וחלץ את קובץ האינדקס BWA הדרוש יישור (במקרה שלנו: Mus_musculus_UCSC_mm10).(ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/Mus_musculus/UCSC/mm10/Mus_musculus_UCSC_mm10.tar.gz
הערה: ביקור https://github.com/ahorvath/Bioinformatics_scripts למידע נוסף בדבר הפעולות של ניתוח ביואינפורמטיקה להוריד את הסקריפטים בשימוש להלן. - יישר את הקובץ לדוגמה fastq לגנום mm10 (להשתמש בסקריפט: perform_alignment.sh). פעולה זו תיצור תיקייה עם קובץ .bam וסטטיסטיקות של היישור. נתוני שבב seq מסודרים RXR (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam), ואת קובץ האינדקס המתאים (.bai) ניתן למצוא כאן:
http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
הערה: BWA היא חבילת תוכנה שמתיישר רלהרצפים קצרים בקנייה (למשל, תוצאות-seq שבב) למסד נתונים רצף, כגון הגנום התייחסות העכבר (למשל, mm10) 13. - הפעל את התסריט (callpeaks.sh) עבור שיחות שיא וניתוח מוטיב דה נובו. השתמשו בקובץ .bam כקלט. התסריט מבוסס על הומר findPeaks 14.
הערה: קבצי הפלט נותנים לנו מידע על המספר הכולל של פסגות, העשרה של המוטיבים, האחוז ברקע, ואת רצפי היעד עם מוטיבים, וכו. (איור 1). בדרך כלל מספר מוטיבים מופיעים לפי סדר חשיבותם. - למפות מחדש את מוטיב # 1 מדורגת (חצי ע"נ `AGGTCA`) (להשתמש בסקריפט: remap_motif.sh)
הערה: כתוצאה מכך, את התסריט ומייצרת קובץ .bed שנראה אשר-פסגות שבב מכסה אזורי גנומית המכילים את האתר הקנונית המחייב של שעתוק הגורם של עניין. - הורד ולדמיין תוצאות RXR שבב seq מיושר קורא (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam (גם להוריד את .bai)) ואת המופעים מוטיב AGGTCA (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) על ידי Viewer ג'נומיקס אינטגרטיבית (IGV) 15 לזהות RAR המשוערת / אתרי הקישור RXR (איור 2 ואיור 3).
הערה: שילוב של נתוני שבב seq שונים יעזור לייתר דיוק לחזות משפר מועמד טוב 16,17. מחקרים שנעשו לאחרונה עולה כי משפרי פעיל בדרך כלל מועשרים עבור P300 ו לתאם עם H3K4me1 ו H3K27ac, והם ממוקמים באזורים הכרומטין פתוח, ובכך להציג רגישות יתר DNase-לי מומלץ גם 18-21. - השתמש "הגדר אזור של אינטרס" ב IGV 15 להשיג 200 - 400 נ"ב רצף של האזור הגנומי שנבחר ולהשתמש הרצפים הללו לצורך עיצובים פריימר שלאחר מכן.
Assay Reporter 2.
הערה: מערכת luciferin / בלוציפראז משמשתכמו assay הכתב רגיש מאוד לרגולציה תעתיק. בהתאם האנזים בלוציפראז פעילות משפר הוא מיוצר כי יהיה לזרז את התחמצנות של luciferin כדי oxyluciferin וכתוצאה מכך bioluminescense, אשר ניתן לאתרם. כצעד ראשון, רצפים משפרים משוערים מזוהים יש subcloned לתוך וקטור כתב (למשל, TK-בלוציפראז 22, pGL3 או NanoLuc).
- עיצוב פריימר
- פריימרים PCR עיצוב הגברה של 200 - 400 נ"ב של אזורים משפרים משוערים ידי Primer3 (הזמינים כאן: http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23
- העתק-הדבק את רצף גנומי IGV הכוללת את אתר הקישור המשוערת לתוך Primer3 (ראה שלב 1.7). טווח גודל מוצר גדר 250 - 300 נ"ב Primer3.
- אמת את פריימרים PCR באמצעות דפדפן הגנום UCSC נמצא כלי סיליקון PCR (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) 24
הערה: פרוטוקול זה בשלב מאוחר יותר משתמש HindIIהגבלת אני BamHI אנזימים לקראת שיבוט. בדוק אם רצף מוגבר PCR כפי שחוזה כלי PCR UCSC In-סיליקון יכיל אתרי הגבלה AAGCTT או GGATCC (למשל, http://nc2.neb.com/NEBcutter2/). - השג את פריימרים הנדרשים מהספק מסחרי.
- PCR הגברה של Enhancer רצף מ- DNA הגנומי
- לטהר DNA הגנומי תבנית מתוך תאים ראשוניים (למשל, פיברובלסטים עובריים עיקריים). השתמש ערכה מסחרית לבידוד gDNA ופעל לפי הוראות היצרן.
הערה: האיכות גבוהה של gDNA חיונית הגברת PCR מוצלחת. שיבוטי BAC מתאימים יכולים לשמש אם PCR לא קל מן gDNA. - הכן 50 μl תגובת PCR המכיל 100 ng gDNA, 5 μl 10x חיץ, 3 μl 4 MgSO (25 מ"מ), 5 μl dNTP (2 מ"מ כל אחד), 1.5 μl פריימר Fwd (10 מיקרומטר), 1.5 פריימר Rev μl (10 מיקרומטר) DNA פולימרז, 1 μl
- הגדר את מחזור PCR (2 דקות 95 ° C, (20 שניות 95 ° C, 10 שניות 58 - 65 מעלות צלזיוס, 18 שניות 70 ° C) חזור על x25, 2 דקות 70 מעלות צלזיוס, לנצח 4 ° C). חישול בטמפרטורה סט, השיקול של פריימר של ערכים חזויים TM.
- לטהר את מוצר ה- PCR עם ערכת טיהור מסחרית PCR ופעל לפי הוראות היצרן.
- הציגו את אתרי הגבלה על שיבוט על ידי חזרה על PCR עם פריימרים כפי שמוצג לעיל, אך הוספת המסוכך על 5 שלהם 'הקצוות (למשל, Fwd: 5'-ATAT AAGCTT xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx-3' (HindIII), Rev: 5'-TATA GGATCC xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx -3 '(BamHI)).
- הפעל 5 μl של המוצר PCR על ג'ל agarose כדי לבדוק מוצרים PCR נוקבים.
הערה: אם להקות יותר מזוהות, הפעל את מוצר PCR כולו ולטהר את הלהקה המתאימה ידי ערכת חילוץ ג'ל מסחרית. - הַגבָּלָה
הערה: כדי לשכפל הכנס במעלה הזרם של TK האמרגן 22 המוצר PCR מטוהרים וקטור (למשל, TK-לוק) צריך להיות מעוכל עם HindIII ו BamHI.- הכינו תערובת התגובה 50 μl המכיל 1 מיקרוגרם המוצר PCR מטוהרים, 1 HindIII μl (20 U / μl), 1 μl BamHI (20 U / μl) ו -5 μl 10x חיץ.
- הכן וקטור 5μg המכיל תערובת התגובה 250 μl (TK לוק, או וקטור הכתב חלופי), 5 μl HindIII (20 U / μl), 5 μl BamHI (20 U / μl), 5 μl thermosensitive phosphatase אלקליין (1 U / μl) ו 25 μl 10x חיץ.
הערה: AP טיפול של וקטור מאוד מצמצמת את עצמי קשירת וקטור חד מתעכל ובכך ברקע. - דגירה את תערובת התגובה במשך 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, אז לטהר את מוצרי ה- PCR מתעכלים וקטור עם ערכת טיהור מסחרית PCR.
- Ligation
- הגדר את התגובה קשירת צינורות PCR כולל חיץ האנזים 2 μl 10x T4 DNA, 10 וקטור ng TK-לוק, 50 הכנס ng (מוצר PCR מעוכל), 1 μl האנזים T4 DNA (400 U / μl) ו nuclease ללא מים עד 20 μl.
הערה: כן בקרה שלילית שבו התגובה אינה מכילה כנס. - לערבב בעדינות את התגובה על ידי pipetting למעלה ולמטה, ספין למטה בקצרה את צינורות PCR באמצעות צנטריפוגות מיני ולאחר מכן לדגור על RT במשך 10 דקות.
- מחמם להשבית ב 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן לצנן על קרח ולהשתמש 5 μl של המוצר עבור והפיכתו 50 μl תאים מוסמכים (למשל, DH5α).
- השתמש בהליך הלם חום סטנדרטי להפוך חיידקים, להרים מושבות לבודד DNA פלסמיד עם ערכה מסחרית. אמת כל המבנים על ידי רצף לפני הצעדים הבאים.
- הגדר את התגובה קשירת צינורות PCR כולל חיץ האנזים 2 μl 10x T4 DNA, 10 וקטור ng TK-לוק, 50 הכנס ng (מוצר PCR מעוכל), 1 μl האנזים T4 DNA (400 U / μl) ו nuclease ללא מים עד 20 μl.
- Transfection בתאי גזע עובריים
- השתמש צלחות 48-היטב. הוספת 200 solut ג'לטין μl 0.1%יון / טוב 30 דקות לפני ציפוי התא.
- גזע פלייט עוברי (ES) תאי יום לפני transfection. השתמשו בתאי גזע עובריים ללא מזין צלחת בצפיפות של 3 x 10 4 תאים לכל היטב 250 μl ES מדיה / טוב.
- הכן את תערובות פלסמיד (כל תמהיל מחושב עבור 8 בארות, 4 מטופל ו -4 רטינואית שטופלו בחומצה) מערבבים 1:. 1,250 ng TK-לוק רוקן (שליטה שלילי), 950 וקטור קידוד ng β-galactosidase (βGal), מערבבים 2 : 1,250 ng TK-לוק משפר Hoxa1 (בקרה חיובית), 950 ננוגרם βGal, מערבבים 3: 1,250 ng TK-לוק משפר PRMT8 (האזור של עניין), 950 ננוגרם βGal.
הערה: בתאי גזע עובריים לבטא את גורמי השעתוק הרצוי (RAR / RXR). השאירו בארות untransfected לקבוע ערכי הבסיס מאוחר יותר במהלך המדידות בלוציפראז ו β-galactosidase. - הוסף מדיה סרום מופחתת איכות transfection לכל פלסמיד לערבב עד 106 μl נפח כולל (מספיק עבור 8 בארות).
- להוסיף 4.5 μl transfect איכות ESמגיב יון ואז לערבב בקפידה על ידי pipetting 15 פעמים למעלה ולמטה. דגירת תמהיל transfection במשך 10 דקות ב RT.
- להוסיף 13 μl של תמהיל transfection אל תאים לכל היטב, לערבב היטב על ידי pipetting. מניחים את התאים בחזרה לתוך החממה (37 מעלות צלזיוס) O / N לפני הטיפול ליגנד.
- הסר מדיה בקפידה על ידי שאיפה מתאי ולהוסיף 250 μl טרי מדיה / היטב המכיל 0.01 - 1 מיקרומטר כל-טרנס החומצה הרטינואית (ע"ר) כמו ריכוז סופי או DMSO כמו הרכב. דגירת תאים עבור 24 - 48 שעות.
הערה: חומצה רטינואית רגיש לאור.
- הכנת lysates תא
- לדלל חיץ תמוגה 5x (1.25 מ"ל 0.5 M טריס pH = 7.8, 1 מ"ל 1 M dithiothreitol (DTT) (ב H 2 O), 10 מ"ל 0.1 M pH EDTA = 8.0, 50 מ"ל גליצרול, 5 מ"ל טריטון X-100, סטרילי במים עד 100 מ"ל) ל 1x באמצעות מים סטריליים, להוסיף 20 μl 1 M DTT / 10 מ"ל ו לאזן RT לפני השימוש. הכן 10 מ"ל עבור צלחת 48-גם ביום של assay. סר מדיה בקפידה על ידי שאיפה מתאית. יש לשטוף את התאים פעם עם 1x PBS. הוסף 200 μl חיץ תמוגה 1x / טוב ישירות אל התאים.
- Shake עבור שעה 2 ב RT (תמוגה כימי). להקפיא את התא lysates על הצלחת ב -80 ° C (ימס מכנים). ניתן לאחסן Lysates ב -80 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים.
- הפשרת lysates. לאחר הפשרה מלאה, להעביר lysates תא לצלחת 96-היטב באמצעות פיפטה רבה אלקטרונית. העברת 80 μl של lysate התא 96-גם צלחת ברור עבור assay β-galactosidase ו -40 μl של lysate התא לצלחת לבן למדידת בלוציפראז. הימנע ויוצרים בועות.
- β-galactosidase Assay
הערה: galactosidase Beta או כתבים שניים אלטרנטיבה אמורה לשמש בקרה פנימית לחשבון וריאציות ניסיוניות שאינם ספציפיות.- הכן חיץ המצע β-galactosidase: 80.0 גרם Na 2 HPO 4 • 7H 2 O,3.8 גרם לאא 2 PO 4 • H 2 O, 30.0 גרם KCl, 1.0 גרם MgSO 4 • 7H 2 O, לבצע עד 1,000 מ"ל עם מים סטריליים. התאם ל- pH 7.4. סנן לעקר (0.2 מיקרון) ולאחסן ב 4 ° C
- מערבבים 1 מ"ל β-galactosidase חיץ המצע עם 4 מ"ג ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactosidase). להוסיף 3.5 μl של 2-mercaptoethanol (βME) לכל 1 מ"ל של חיץ רק לפני השימוש. הוספת 100 μl חיץ המצע β-galactosidase 80 lysate תא μl.
- דגירת התגובות ב 37 מעלות צלזיוס עד פתח צבע צהבהב. קראו ספיגה ב OD 420 ננומטר על נתונים קוראים ויצוא צלחת.
הערה: בפעם משתנה בהתאם יעילות transfection, בדרך כלל לא יותר מ -30 דקות.
- Assay בלוציפראז
- הכן 50 מ"ל ריאגנט המצע luciferin: 15.1 מ"ג מלח D-luciferin, מלח ATP 82.7 מ"ג, 185 מ"ג MgSO 4 • 7H 2 O, מוסיפים 50 מ"ל צינור פוליפרופילן,ולאחר מכן להוסיף 1.5 מ"ל 1 חיץ M HEPES, 48.5 מ"ל מים חינם ATP, מערבולת, לוודא שכל תרכובות להתמוסס לחלוטין. שמור 5 - 10 aliquots מ"ל ב -80 ° C.
- מגיב מצע 5 מיליליטר luciferin חם RT לפני שמתחיל. פיפטה 100 מגיב המצע μl היטב בכל צלחת לבנה המכילה את 40 μl של lysate התא ולמדוד את האות מיד באמצעות מכונה הדלפק זורח.
- השג פעילויות מלפחות שלושה ניסויים בלתי תלויים ב transfections בשלושה עותקים.
- חישוב הראשון הפעילות בלוציפראז מנורמל בסיס וערכים β-galactosidase מנורמל בסיס עבור כל טוב על ידי הפחתת ערכי הממוצע הנמדד עבור תאים שאינם transfected מכל הערך הנמדד. ואז לחשב את היחס של בלוציפראז / β-galactosidase פעילות.
אפיון 3. RNA Enhancer
הערה: מדד ישיר יותר של פעילות משפרת התפתחה מתוך הגנום w האחרוןמחקרי IDE שזיהו רבי RNAs ללא קידוד קצר, החל בגודל 50 עד 2,000 NT, אשר עבדו מ- משפר, ו מכונים RNAs משפר (eRNAs) 16,25,26 (איור 4). אינדוקצית ארנה בקורלציה גבוהה עם האינדוקציה של גני אקסון-קידוד סמוכים. לפיכך, פעילות משפרים תלוי אות ניתן לכמת in vivo על ידי השוואת ייצור ארנה בין תנאים שונים על ידי RT-qPCR.
- הנחיות פריימר עיצוב לגילוי ארנה ידי RT-qPCR
- בחר אזורים גנומית למדידות ארנה כי הם לפחות 1.5 - במרחק 2 kb מאתרי תחילת שעתוק מבוארים.
הערה: חשוב לציין, רמות גבוהות של שעתוק mRNA ברחבי משפר intragenic למנוע כימות מדויק של ארנה בכיוון התחושה, eRNAs antisense ב משפר intragenic ניתן לזיהוי והם דומים ברמתו ל eRNAs ב משפר extragenic. - ככלל, השתמש אזורים 200 - 1,000 BP הלוך ושובמ 'במרכז גורם שעתוק מחייבים למוקד עניין עבור עיצוב פריימר או על תחושה או גדיל אנטי תחושה (איור 4 ואיור 6).
הערה: אם GRO-seq, DNase-seq, H3K4me1, H3K4me3 או H3K27ac שבב seq נתונים זמינים סוגי התאים הרצוי ותנאי זה יכול לשמש עבור עיצוב פריימר מדויק יותר. eRNAs משועתק מאזורים משפרים משוערים מאופיינים ברמות גבוהות של H3K4me1 ו ME3. הביטוי של eRNAs בקורלציה חיובית עם העשרת H3K27ac סימן היסטון משפר מופעל. - פריימרים עיצוב PCR עבור פלורסנט לצבוע מבוססי מדידה RT-qPCR של eRNAs ידי Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23 צור רצף אנטי תחושה (הפוכה המשלים של גדיל תחושה) עבור עיצוב פריימר לפי: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html. הכנס 200 - -300 נ"ב של רצף תחושה או תחושה אנטי עבור עיצוב פריימר.
- בחר אזורים גנומית למדידות ארנה כי הם לפחות 1.5 - במרחק 2 kb מאתרי תחילת שעתוק מבוארים.
- מדידת תמלול ארנה
- לבודד RNA הכולל תאים שטופלו פנול חומצי מסחרי / מגיב מיצוי מבוסס כלורופורם על פי המלצות היצרן.
- השתמש DNaseI לטיפול RNA בודד לפני השימוש בהם בתגובה שעתוק לאחור. להשבית DNase פי המלצת היצרן לפני שעתוק לאחור.
- מדוד ריכוז RNA לאחר הטיפול DNase אני ולהשתמש 1,000 ננוגרם לכל תגובה RT. השתמש transcriptase הפוך באיכות גבוהה.
הערה: ככל מספר רב של eRNAs לא יכול להיות polyadenylated, שעתוק לאחור מחייב שימוש פריימרים אקראיים. - זיהוי הפוך עבד ארנה ידי RT-qPCR באמצעות הליך רגיל. מדוד mRNA שאינו תלוי-טיפול לנורמליזציה (למשל, 36B4, PPIA, GAPDH, Actb).
- לטהר DNA הגנומי תבנית מתוך תאים ראשוניים (למשל, פיברובלסטים עובריים עיקריים). השתמש ערכה מסחרית לבידוד gDNA ופעל לפי הוראות היצרן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השתמשנו נוגדני RXR הפאן הספציפיות על מנת לזהות גנים יש עשר קולטן אשר הגנום כולו מוסדר RA בסמיכות שלהם. ניתוח ביואינפורמטיקה של נתונים שבב seq RXR המתקבל תאים ES שטופלו החומצה הרטינואית חשף את העשרת האתר חצי רצפטור גרעיני (AGGTCA) תחת RXR הכבושים אתרים (איור 1). באמצעות אלגוריתם ביואינפורמטיקה מיפינו חזרה לתוצאות חיפוש מוטיב עבור אתר חצי לנתונים RXR שבב seq (איור 2). ניתוח זה עזר לנו לזהות את אלה שבב פסגות במדויק אילו היו חופפים עם אתרי קישור רצפטור גרעיני הקנונית. ויזואליזציה של האתרים הללו IGV הצביעו העשרה של גורמי שעתוק אלה בסמיכות של Hoxa1, מטרה RAR / RXR מאופיין בעבר (איור 2 ואיור 3). אנחנו גם זיהינו גן מטרת RA רומן, כלומר PRMT8 27. זה laבאזור tter מכיל חוזרים ישירים ללא נוקלאוטידים spacer בין שני האתרים וחצאים (AGGTCAAGGTCA) (איור 3). כדי תפקודית לאמת כי אלמנט המזוהה לצורך Hoxa1 אכן יכול להיקשר RAR / RXR והוא מווסת על ידי RA בנינו וקטורים כתב TK-בלוציפראז שהכיל ~ באזור 300bp גנומית, כולל הגורמים המזוהים. גם אנחנו נבנה וקטורים ללא אלמנט תגובה (איור 5). בתאי גזע עובריים היו transfected ופעילות בלוציפראז נמדדה בהעדר ונוכחות של חומצה רטינואית (איור 5). מבנים המכילים אלמנט תגובת חומצה רטינואית (RARE) עשתה עוצמת אות בלוציפראז מופע עלה על טיפול בדלקת מפרקים שגרוני, בעוד המבנה ללא RARE לא היה מושרה.
גם למדנו את פעילות החומצה רטינואית התלויה של משפר Hoxa1. כדי לברר אם השכל הישר אנטי ביטוי ארנה של ג משפר Hoxa1 RAR / RXR הנכנסorrelate עם ביטוי mRNA של הגן, אנו מודדים גם את רמת Hoxa1 mRNA (איור 6). תוצאות אלו אשרו כי הפעילות המשפרת היא מושרה על ידי טיפול RA לטווח קצר (3 שעות), ובכך אשרה כי משפר מעורב סביר בתקנה משפר RA-תלוי.
איור 1. הומר ד ה נובו מוטיב תוצאות. HTML פלט (homerResults.html) שנוצר על ידי הומר עבור הדוגמה RXR שבב seq מוצג. לוגו רצף מקביל לראש מוטיבים גורמים שעתוק מועשר מזוהים על ידי גילוי מוטיב דה נובו ב לוקוסים נכנסים RXR. 7463 RXR הכבושים אזורים גנומית שימשו בחיפוש מוטיב. 77.66% של אזורים אלה מכילים מוטיב AGGTCA הדמוי (המדורג כמו 1 #). לביקור תיאור מפורט: (http://homer.salk.edu/ho mer / מוטיב /) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. מציאת הגנום אזורים המכילים מוטיב של ריבית. ויזואליזציה של seq שבב RXR מיושר קורא (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam ואת המופעים מוטיב AGGTCA (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) על ידי אינטגרטיבית ג'נומיקס Viewer (IGV). יישור נצבעים על ידי גדיל קריאה (קורא על גדיל +: אדום, - גדיל:. כחול) הגנום המשמש יישור: mm10. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
jpg "/>
איור 3. הגנום לוקוסים של Hoxa1 וחילוף PRMT8. תמונת מצב IGV של RXR שבב Seq אותות המתקבלים מטופל RA שטופלו (24 שעות, 1 מיקרומטר) בתאי גזע עובריים 27 מוצגים. שזוהה רצפי מחייב צבועים באדום. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
. איור 4. ניסיונותיי עיצוב עבור רצפי Coding בדיקת ארנה משפר שנבחר RNA משפר (ארנה) מדידה צריך להיות ממוקם לפחות 1.5 - 2 kb משם ביחס לאתר תחילת שעתוק (TSS) של הגן הקרוב. שבב seq נתונים של גורם שעתוק (TF) ריבית לבין ניתוח מוטיב יכול לשמש כדי לזהות אתרי קישור ישיר הגנום כולו. כמחייבים של transcripcoactivator התזונתית (למשל, P300) לעתים קרובות מסמנת משפר דיסטלי, אזורים המועשרים הוא TF ו P300 הם מועמדי משפר טובים. הביטוי של eRNAs הוא עולה גם העשרת H3K27ac סימן היסטון משפר מופעל. אזורים 200 -. 1,000 נ"ב משם במובן או בכיוון אנטי תחושה ממרכז גורם שעתוק עקדה מומלצת עבור עיצוב פריימר ארנה אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
פעילות בלוציפראז איור 5. של Reporter הצביעו בונה בתאי גזע עובריים. אזורים גנומית מצוינות של משפר Hoxa1 היו משובטים לתוך TK-לוק וקטור transfected לתאי גזע עובריים. לבנות 1 ו -2 הכילו אלמנט תגובת חומצה רטינואית (RARE, unרצף derlined). תאים שטופלו עם RA (24 שעות, 1 מיקרומטר). βGal שמש בקרה פנימית לנורמליזציה. ברים מייצגים ערכים מנורמלים ממוצע מתחיילים ארבע חזרות ביולוגיות. SD ± *** P <0.005 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6. החומצה הרטינואית מושרה Enhancer RNA תמלול. Hoxa1 mRNA וארנה רמות כפי שהיא נמדדת על ידי RT-qPCR. RNA סה"כ היה מבודד מן בתאי גזע עובריים שטופלו במשך 3 שעות עם חומצה רטינואית (RA) או DMSO כמו הרכב (Veh). פריימרים קדימה עבור במובן וזיהוי אנטי תחושה ארנה ואת amplicons PCR מוצגים. מרחק של אזורים זוהו על ידי ארנה RT-qPCR ממרכז האתר מחייב RXR מותווה. ערכים היו מנורמל לממוצע של 36B4 מרNA. הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM *** P <0.005 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD DNA polymerase | Merck Millipore | 71085-3 | for PCR amplification of enhancer from gDNA |
| DNeasy Blood & Tissue kit | Qiagen | 69504 | for genomic DNA isolation |
| QIAquick PCR Purification kit | Qiagen | 28106 | for PCR product purification |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28706 | for gel extraction if there are more PCR product |
| HindIII | NEB | R3104L | restriction enzyme |
| BamHI | NEB | R3136L | restriction enzyme |
| FastAP | Thermo Scientific | EF0651 | release of 5'- and 3'-phosphate groups from DNA |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | for ligation |
| QIAprep Spin Miniprep kit | Qiagen | 27106 | for plasmid isolation |
| DMEM | Gibco | 31966-021 | ES media |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | ES media |
| MEM Non-Essential Amino Acid | Sigma | M7145 | ES media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | ES media |
| Beta Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | ES media |
| FuGENE HD | Promega | E2311 | transfection reagent |
| Opti-MEM® I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 31985-062 | for transfection |
| All-trans retinoic acid | Sigma | R2625 | ligand, for activation of RAR/RXR |
| 96-well clear plate | Greiner | 655101 | for Beta galactosidase assay |
| 96-well white plate | Greiner | 655075 | for Luciferase assay |
| D-luciferin, potassium salt | Goldbio.com | 115144-35-9 | for Luciferase assay |
| ATP salt | Sigma | A7699-1G | for Luciferase assay |
| MgSO4•7H2O | Sigma | 230391-25G | for Luciferase assay |
| HEPES | Sigma | H3375-25G | for Luciferase assay |
| Na2HPO4 •7H2O | Sigma | 431478-50G | for Beta galactosidase assay |
| NaH2PO4 •H2O | Sigma | S9638-25G | for Beta galactosidase assay |
| MgSO4•7H2O | Sigma | 230391-25G | for Beta galactosidase assay |
| KCl | Sigma | P9541-500G | for Beta galactosidase assay |
| ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactosidase) | Sigma | N1127-1G | for Beta galactosidase assay |
| TRIzol® | Life Technologies | 15596-026 | RNA isolation |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies | 4368814 | reverse transcription of eRNA |
| Rnase-free Dnase | Promega | M6101 | Dnase treatment |
| SsoFast Eva Green | BioRad | 750000105 | RT-qPCR mastermix |
| CFX384 Touch™ Real-Time PCR Detection System | BioRad | qPCR machine | |
| BioTek Synergy 4 microplate reader | BioTek | luminescent counter |
References
- Wamstad, J. A., Wang, X., Demuren, O. O., Boyer, L. A. Distal enhancers: new insights into heart development and disease. Trends in cell biology. 24, 294-302 (2014).
- Pennacchio, L. A., Bickmore, W., Dean, A., Nobrega, M. A., Bejerano, G.
- Mardis, E. R. ChIP-seq: welcome to the new frontier. Nature methods. 4, 613-614 (2007).
- Muller, F., Tora, L. Chromatin and DNA sequences in defining promoters for transcription initiation. Biochim Biophys Acta. 1839, 118-128 (2013).
- Ounzain, S., Pedrazzini, T. The promise of enhancer-associated long noncoding RNAs in cardiac regeneration. Trends Cardiovasc Med. , (2015).
- Lam, M. T., Li, W., Rosenfeld, M. G., Glass, C. K. Enhancer RNAs and regulated transcriptional programs. Trends Biochem Sci. 39, 170-182 (2014).
- Dickel, D. E., et al. Function-based identification of mammalian enhancers using site-specific integration. Nature methods. 11, 566-571 (2014).
- Blum, R., Vethantham, V., Bowman, C., Rudnicki, M., Dynlacht, B. D. Genome-wide identification of enhancers in skeletal muscle: the role of MyoD1. Genes Dev. 26, 2763-2779 (2012).
- Vermunt, M. W., et al. Large-scale identification of coregulated enhancer networks in the adult human brain. Cell reports 9. , 767-779 (2014).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev Biol. 168, 342-357 (1995).
- Mahony, S., et al. Ligand-dependent dynamics of retinoic acid receptor binding during early neurogenesis. Genome Biol. 12 (R2), (2011).
- Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies. FEBS Lett. 584, 3123-3130 (2010).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38, 576-589 (2010).
- Robinson, J. T., et al.
- Daniel, B., et al. The active enhancer network operated by liganded RXR supports angiogenic activity in macrophages. Genes Dev. 28, 1562-1577 (2013).
- Zhu, Y., et al. Predicting enhancer transcription and activity from chromatin modifications. Nucleic Acids Res. 41, 10032-10043 (2013).
- Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457, 854-858 (2009).
- Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nat Genet. 39, 311-318 (2007).
- Rada-Iglesias, A., et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470, 279-283 (2010).
- Bonn, S., et al. Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development. Nat Genet. 44, 148-156 (2012).
- Hollenberg, S. M., Giguere, V., Segui, P., Evans, R. M. Colocalization of DNA-binding and transcriptional activation functions in the human glucocorticoid receptor. Cell. 49, 39-46 (1987).
- Untergasser, A., et al.
- Rhead, B., et al. The UCSC Genome Browser database: update 2010. Nucleic Acids Res. 38, D613-D619 (2010).
- Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465, 182-187 (2010).
- Wang, D., et al. Reprogramming transcription by distinct classes of enhancers functionally defined by eRNA. Nature. 474, 390-394 (2011).
- Simandi, Z., et al. PRMT1 and PRMT8 regulate retinoic acid-dependent neuronal differentiation with implications to neuropathology. Stem Cells. 33, 726-741 (2014).
- Zhou, H. Y., et al. A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential. Genes Dev. 28, 2699-2711 (2014).
