Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

أدوات لدراسة دور HMGB1 البروتين المعماري في تجهيز اللولب تشويه، والحمض النووي الخاصة بالموقع Interstrand Crosslinks

Published: November 10, 2016 doi: 10.3791/54678
Automatic Translation
1, 1
1Division of Pharmacology and Toxicology, College of Pharmacy, The University of Texas at Austin

Abstract

مربع المجموعة عالية التنقل 1 (HMGB1) البروتين هو بروتين المعماري غير بسيطة التي تشارك في تنظيم العديد من الوظائف الهامة في الجينوم، مثل النسخ، وتكرار الحمض النووي، وإصلاح الحمض النووي. يربط HMGB1 على الحمض النووي مشوهة هيكليا مع ارتفاع تقارب من لالكنسي B-DNA. على سبيل المثال، وجدنا أن HMGB1 يربط الحمض النووي interstrand crosslinks (ICLS)، التي تربط تساهمي فروع اثنين من الحمض النووي، وتسبب تشويه الحلزون، وإذا تركت دون اصلاح يمكن أن يسبب موت الخلايا. نظرا لقدرتها السامة للخلايا، وتستخدم العديد من وكلاء ICL الذي يحفز حاليا وكلاء العلاج الكيميائي في العيادة. بينما تظهر وكلاء ICL تشكيل تفضيلات لبعض متواليات قاعدة (على سبيل المثال، 5'-TA-3 "هو موقع يشابك المفضل لالسورالين)، فإنها تحفز إلى حد كبير التلف في الحمض النووي بطريقة عشوائية. ومع ذلك، من خلال اقتران تساهميا وكيل ICL الذي يحفز إلى النوكليوتيد تشكيل ثلاثي (TFO)، الذي يربط الحمض النووي في تسلسل محددالطريقة الحمض النووي من التلف المستهدفة يمكن أن يتحقق. هنا، ونحن نستخدم TFO مترافق تساهميا على 'نهاية ل4'-hydroxymethyl-4،5' 5 (همت) السورالين trimethylpsoralen-8، لتوليد ICL في مواقع محددة على البلازميد الطفرة مراسل لاستخدام أداة لدراسة تعديل المعماري ومعالجة وإصلاح آفات الحمض النووي المعقدة التي HMGB1 في الخلايا البشرية. وصفنا تقنيات تجريبية لإعداد ICLS موجهة TFO على البلازميدات مراسل، واستجواب جمعية HMGB1 مع ICLS موجهة TFO في سياق الخلوي باستخدام فحوصات مناعي لونين. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف فحوصات الحمض النووي supercoiling لتقييم تعديل المعماري معين من الحمض النووي التالف عن طريق قياس كمية من الأدوار superhelical أدخلت على البلازميد-السورالين crosslinked بواسطة HMGB1. هذه التقنيات يمكن استخدامها لدراسة دور البروتينات الأخرى المشاركة في تجهيز وإصلاح ICLS موجهة TFO أو غيرها من الأضرار الحمض النووي المستهدفة في أي خط من الخلايا في المصالح.

Introduction

ثلاثي تشكيل أليغنوكليوتيد] (TFOs) مأزق مزدوج الحمض النووي بطريقة تسلسل معين عن طريق الربط Hoogsteen الهيدروجين لتشكيل هياكل الثلاثي حلزونية 1-5. وقد استخدمت تقنية ثلاثي لاستجواب مجموعة متنوعة من الآليات الجزيئية البيولوجية، مثل النسخ، وإصلاح الحمض النووي من التلف، واستهداف الجين (إعادة النظر في المراجع 6-8). وقد استخدمت على نطاق واسع TFOs للحث على الضرر في مواقع محددة على البلازميدات مراسل 9،10. مختبرنا وغيرها قد استخدمت سابقا TFO، AG30، مربوط الى جزيء السورالين للحث على crosslinks DNA interstrand في مواقع محددة (ICLS) في الجين supF على pSupFG1 البلازميد 5،10-12. ICLS هي السامة للخلايا للغاية حيث أن هذه الآفات تشعبي تساهميا اثنين من خيوط الحمض النووي، وإذا تركت دون اصلاح، يمكن منع النسخ الجيني وتعيق آلية تكرار الحمض النووي 13،14. بسبب قدرتها السامة للخلايا، وقد استخدمت وكلاء ICL الذي يحفز كما أدوية العلاج الكيميائي في علاجمن السرطان وأمراض أخرى 15. ومع ذلك، وتجهيز وإصلاح ICLS في الخلايا البشرية ليست مفهومة جيدا. وبالتالي، فهم أفضل من الآليات التي تشارك في تجهيز ICLS في الخلايا البشرية يمكن أن تساعد على تحسين فعالية نظم العلاج الكيميائي على أساس ICL. ICLS يسببها TFO وسيطة إصلاح لهم لديها القدرة على التسبب في تشوهات هيكلية مهمة لولب الحمض النووي. هذه التشوهات هي أهداف محتملة للبروتينات المعمارية، الذي ربط الحمض النووي مشوهة مع تقارب أعلى من لالكنسي B-شكل مزدوج الحمض النووي 16-20. هنا، درسنا جمعية بروتين المعماري وفيرة للغاية، HMGB1 مع ICLS في الخلايا البشرية عبر مناعي لونين (رقاقة) فحوصات على البلازميدات-السورالين crosslinked والتعرف على دور HMGB1 في تحوير طوبولوجيا من البلازميد-السورالين crosslinked في الإنسان لست] الخلايا السرطانية.

HMGB1 هو وفيرة للغاية، وأعرب عن بتواجد مطلق غير لهلهجة البروتين المعماري الذي يربط الحمض النووي التالف وركائز الحمض النووي منظم بدلا من ذلك مع تقارب أعلى من الكنسي B-شكل الحمض النووي 17-20. وتشارك HMGB1 في العديد من عمليات التمثيل الغذائي الحمض النووي، مثل النسخ، وتكرار الحمض النووي، وإصلاح الحمض النووي 16،21-23. لقد أثبتنا سابقا أن HMGB1 بربط ICLS موجهة TFO في المختبر مع قابلية عالية 20. وعلاوة على ذلك، لقد أثبتنا أن عدم وجود HMGB1 زيادة تجهيز مطفرة من ICLS موجهة TFO وحددت HMGB1 بمثابة إصلاح النوكليوتيدات الختان (NER) المشارك عامل 23،24. مؤخرا، وجدنا أن HMGB1 يرتبط ICLS موجهة TFO في الخلايا البشرية والتوظيف لمثل هذه الآفات يعتمد على بروتين معدل الالتحاق الصافي، XPA 16. وقد تبين supercoiling السلبي من الحمض النووي للترويج لإزالة فعالة من آفات الحمض النووي التي كتبها NER 25، وقد وجدنا أن HMGB1 يدفع supercoiling سلبي تفضيلي على إخراج TFO اصق ICL التي تحتوي علىركائز منتصف (نسبة إلى ركائز غير التالفة البلازميدات) 16، توفير فهم أفضل للدور المحتمل (ق) من HMGB1 باعتبارها NER المشارك عامل. ليست مفهومة تجهيز ICLS تماما في الخلايا البشرية. وبالتالي، يمكن للتقنيات والمقايسات وضعت على أساس الأدوات الجزيئية الموصوفة هنا يؤدي إلى التعرف على البروتينات إضافية تشارك في إصلاح ICL، والتي بدورها قد تخدم أهدافا الدوائية التي يمكن استغلالها لتحسين فعالية نظم العلاج الكيميائي للسرطان.

هنا، نهج فعال لتقييم كفاءة تشكيل ICL موجهة TFO في البلازميد من تغيير طبيعة الاغاروز الكهربائي للهلام تم مناقشتها. وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام البلازميدات التي تحتوي على ICLS موجهة TFO، تقنيات لتحديد جمعية HMGB1 مع البلازميدات التالفة ICL في سياق الخلوي باستخدام المقايسات رقاقة تعديل تم وصفها. بالإضافة إلى ذلك، وهي طريقة سطحي لدراسة التعديلات التي أدخلها الطوبوغرافية عشروقد تم تحديد ه البروتين المعماري HMGB1، وتحديدا على ركائز البلازميد التالفة ICL في الخلية لست] الإنسان عن طريق إجراء فحوصات supercoiling عبر ثنائية الأبعاد الكهربائي للهلام الاغاروز. وصف تقنيات يمكن استخدامها لتعزيز فهم إشراك إصلاح الحمض النووي والبروتينات المعمارية في معالجة التلف في الحمض النووي المستهدفة على البلازميدات في الخلايا البشرية.

وصفنا بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لتشكيل ICLS السورالين موجهة TFO-مواقع محددة على DNA البلازميد، ورقاقة البلازميد لاحق وsupercoiling فحوصات لتحديد البروتينات التي ترتبط بها مع الآفات، والبروتينات التي تغير طوبولوجيا الحمض النووي، على التوالي. يمكن تعديل هذه المقايسات لأداء مع غيرها من العوامل الحمض النووي المدمر، TFOs، ركائز البلازميد، وخطوط الخلايا الثديية من الفائدة. في الواقع، لقد أظهرنا أن هناك إمكانية فريدة وعالية تقارب موقع واحد على الأقل ملزم TFO داخل كل الجينات المشروح في الجينوم البشري (26). كيفمن أي وقت مضى، من أجل الوضوح، وصفنا هذه التقنيات لاستخدام TFO مترافق السورالين محددة (pAG30) على البلازميد الطفرة مراسل معين (pSupFG1) في خلايا U2OS الإنسان كما أننا قد تستخدم في موخرجي وفاسكيز، 2016 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد ICLS موجهة TFO على البلازميد ركائز

  1. احتضان كميات متساوي المولية من pSupFG1 البلازميد 10،11 الحمض النووي (5 ميكروغرام DNA البلازميد هو نقطة انطلاق جيدة) مع السورالين مترافق TFO AG30 في 8 ميكرولتر من ثلاثي العازلة ملزمة [50٪ الجلسرين، 10 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 10 ملي MgCl 2] وO 2 درهم إلى الحجم النهائي من 40 ميكرولتر في أنبوب العنبر. مزيج دقيق من قبل pipetting صعودا وهبوطا. احتضان رد الفعل عند 37 درجة مئوية حمام الماء لمدة 12 ساعة.
  2. الاحماء مصباح الأشعة فوق البنفسجية لضمان انتاج الطاقة الكاملة. ضع رد فعل ثلاثي على الفيلم البارافين، ووضع الفيلم البارافين على الجليد تحت (نانومتر 365) مصباح الأشعة فوق البنفسجية. وضع مرشح مايلر بين مصباح وردود الفعل.
  3. UVA أشرق لجرعة من مجموع 1.8 J / سم 2. تخزين العينات في 4 درجات مئوية لاستخدامها مرة أخرى.
    الحذر: ارتداء النظارات الواقية المناسبة والملابس مع UVA التشعيع.
  4. خطي 200 نانوغرام من البلازميد أعد أعلاه مع إعادةانزيم striction ايكو R1 في إجمالي حجم 20 ميكرولتر باستخدام زودت الشركة المصنعة 10X العازلة. الحرارة تفسد الانزيم لمدة 20 دقيقة عند 65 درجة مئوية. تدور العينات لمدة 10 دقيقة في 10000 x ج وتخزين عند 4 درجات مئوية.
  5. إعداد 50X عازلة القلوية [1.5 م هيدروكسيد الصوديوم، 50 ملي Ethylenediaminetetraacetic حمض (EDTA)]. إضافة 0.5 ملغ من الاغاروز إلى 50 مل درهم 2 O. يغلي لإذابة الاغاروز ووضعه في 50 ° C حمام الماء.
  6. بعد درجة حرارة الاغاروز حل وصولا الى 50 درجة مئوية، إضافة 1 مل من العازلة 50X قلوية، ومزجها ثم صب جل في علبة الجل. إتاحة الوقت لهلام ليصلب في درجة حرارة الغرفة قبل استخدامها.
  7. إضافة 4 ميكرولتر من 0.5 M EDTA إلى 20 ميكرولتر من عينة الحمض النووي خطي واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  8. إضافة 6X القلوية عازلة هلام تحميل (300 ملي هيدروكسيد الصوديوم، 6 ملي EDTA، 18٪ (ث / ت) ارتفاع الوزن الجزيئي السكاريد، 0.06٪ خضرة البروموكريزول في DH 2 O) للعينات و1 كيلو بايت سلم الحمض النووي.
    ملاحظة: من المهم استخدام العازلة هلام تحميل القلوية 6X، يرجى الاطلاع على المناقشة.
  9. نماذج تحميل على هلام في الغرفة الباردة وتشغيل بين عشية وضحاها في المخزن القلوية 1X (12-16 ساعة) عند 3.2 فولت لكل سم. مرة واحدة العينات دخلت هلام، وضع لوحة من الزجاج على الجزء العلوي من هلام لمنعها من العائمة.
  10. تحييد العينات عن طريق نقع هلام العازلة في تحييد [1 M تريس الكلورين (الرقم الهيدروجيني 7.6)، و 1.5 M كلوريد الصوديوم، 3 M خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.2)] لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  11. وصمة عار في هلام لالحمض النووي مع 4 ميكرولتر من 1٪ بروميد إيثيديوم (EtBr) في 50 مل من الماء لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. يزيل اللون مع الماء لمدة 15 دقيقة. تصور الحمض النووي باستخدام نظام التصوير.
    تحذير: EtBr هو المغير قوية ويمكن استيعابها من خلال الجلد. تجنب الاتصال المباشر مع EtBr.

2. ترنسفكأيشن ومناعي من إخراج TFO-ICL التي تحتوي على البلازميدات في الخلايا البشرية

  1. لوحة 400،000 خلايا الثدييات (على سبيل المثال، U2OS سخلايا steosarcoma) في 60 طبق مم في Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS) بدون المضادات الحيوية 24 ساعة قبل ترنسفكأيشن. احتضان خلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
  2. قبل ترنسفكأيشن، وسائط النمو الدافئ والفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. تدفئة كاشف ترنسفكأيشن إلى درجة حرارة الغرفة.
  3. احتضان 30 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن مع 500 ميكرولتر من وسائط النمو 1X (مزيج 1) و 2 ميكروجرام من TFO الموجه ICL التي تحتوي على البلازميدات في 500 ميكرولتر من 1X وسائط النمو (مزيج 2) في منفصلة 14 مل أنابيب أسفل جولة لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. إضافة مزيج 1 إلى مزيج 2، مزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا. احتضان لمدة 25-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني الدافئ. يضاف مزيج ترنسفكأيشن بطريقة الإفلات من الحكمة توزيع بالتساوي في جميع أنحاء لوحة من الخلايا. إضافة 1 مل من وسائط النمو إلى لوحة وجلب الحجم النهائي إلى 2 مل. خلط نحنليرة لبنانية. وضع لوحات الثقافة في الحاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 4 ساعة.
  6. استبدال وسائل الإعلام مع وسائل الاعلام 3 مل النمو تستكمل مع FBS 10٪، واحتضان مزيد لمدة 16 ساعة. لا تستخدم المضادات الحيوية.
  7. علاج الخلايا مع 80 ميكرولتر من الفورمالديهايد العذبة 37٪ لكل لوحة لتركيز النهائي من ما يقرب من 1٪ واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في غياب الضوء.
    تحذير: الفورمالديهايد السامة، وينبغي التعامل وفقا لتعليمات السلامة بها. تعرض الفورمالديهايد يمكن أن يسبب ضرر للجلد والعين والجهاز التنفسي.
  8. إخماد الفورمالديهايد يشابك بإضافة 300 ميكرولتر من الجلايسين المبردة (مرفق في مجموعات المتاحة تجاريا) في لوحة واحتضان لمدة 5 دقائق. إزالة وسائل الإعلام ويغسل مرتين مع المثلجة PBS، ثم جمع الخلايا عن طريق كشط في 1 مل المبردة (4 درجة مئوية) في برنامج تلفزيوني في أنبوب microcentrifuge. الحفاظ على عينات على الجليد في جميع الأوقات.
  9. إعداد الكريات الخلية عن طريق الطرد المركزي في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لر 13400 x ج باستخدام الطاولة المبردة الطرد المركزي. الماصة من طاف ووضع بيليه الخلية على الجليد.
  10. و resuspend متجانس بيليه في 1 مل المبردة (4 درجة مئوية) العازلة ألف (المتوفرة في مجموعات المتاحة تجاريا)، واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة. مزيج من حين لآخر عن طريق أنبوب للقلب. بيليه الخلايا كما كان من قبل (راجع الخطوة 2.9 أعلاه).
  11. و resuspend متجانس بيليه في 1 مل المبردة (4 درجة مئوية) B الاحتياطي (مرفق في مجموعات المتاحة تجاريا)، واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة مع خلط في بعض الأحيان من قبل قلب. خلايا بيليه بواسطة الطرد المركزي كما كان من قبل (راجع الخطوة 2.9 أعلاه).
  12. resuspend الخلايا مرة أخرى في 200 ميكرولتر برود العازلة B. إضافة 2 ميكرولتر من Micrococcal نوكلياز (MNase)، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. خلط رد فعل من حين لآخر من قبل عبها الأنبوب. وقف رد فعل MNase عن طريق وضع أنبوب على الجليد وإضافة 40 ملي EDTA. بيليه الخلايا كما كان من قبل (راجع الخطوة 2.9 أعلاه).
  13. Resuspend الخلايا في 100 immunopr لونين 1X ميكرولترecipitation عازلة (رقاقة) عازلة (مرفق في مجموعات المتاحة تجاريا) تستكمل مع الكوكتيل مثبط البروتياز.
  14. وضع الخلايا معلق في أنبوب microfuge رقيقة الجدران. يصوتن العينات من خلال تعويم لهم على sonicator باث الماء لمدة 20 ثانية تليها 20 ثانية حضانة على الجليد. كرر صوتنة الخطوات من 9 مرات لتوليد ~ 800-1،200 شظايا مضت.
    1. إلى 20 ميكرولتر من العينات sonicated إضافة 3 ميكرولتر 5 M كلوريد الصوديوم و 1 ميكرولتر ريبونوكلياز A. مزيج جيد من قبل vortexing واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. وفي وقت لاحق، إضافة 2 ميكرولتر بروتين K واحتضان لمدة 2 ساعة على 65 درجة مئوية. تنقية العينات باستخدام طقم تنقية PCR. تشغيل العينات على 1٪ هلام الاغاروز وتصور مع EtBr.
      ملاحظة: كثافة القصوى من الناتج الحمض النووي ينبغي أن تكون عند أو تحت 1000 سنة مضت.
  15. في ثلاثة أنابيب منفصلة، ​​إضافة 30 ميكرولتر من المحللة في أنبوب siliconized وقبل المبردة ثم إضافة 70 ميكرولتر من العازلة الشذرة 1X المبردة مع مثبطات الأنزيم البروتيني المضافة. إضافة 1 μز المضادة للالمناعي G (مفتش)، H3 مكافحة هيستون (كما تحكم إيجابية)، أو أضداد HMGB1 للأنابيب منها. احتضان بين عشية وضحاها في غرفة باردة مع دوران مستمر.
  16. Resuspend الخرز بروتين G متجانس في غرفة باردة. إضافة 4 ميكرولتر من بروتين G حبات في أنبوب واحتضان لمدة 2-4 ساعة أخرى في غرفة باردة مع دوران.
  17. استخدام الحامل المغناطيسي، بيليه الخرز وإزالة طاف. إضافة 200 ميكرولتر 1X الشذرة العازلة مختلطة مع الكوكتيل مثبط البروتياز لبيليه ويغسل لمدة 5 دقائق في غرفة باردة مع دوران. تكرار غسل مرتين.
  18. أداء غسيل إضافي واحد مع الملح العالية العازلة 1X الشذرة (التي تحتوي على 70 ملي كلوريد الصوديوم).
  19. Resuspend والكريات مع شطف العازلة 160 ميكرولتر (مرفق في مجموعات المتاحة تجاريا)، واحتضان عند 37 درجة مئوية مع دوران لمدة 30 دقيقة.
  20. بيليه الخرز وجمع طاف في أنبوب جديد. إضافة 6 ميكرولتر من 5 M كلوريد الصوديوم و 2 ميكرولتر من بروتين كاف، واحتضان بين عشية وضحاها في 65° C.
  21. تنقية الحمض النووي باستخدام PCR عدة تنقية المنتجات وأزل الحمض النووي باستخدام 50 ميكرولتر درهم 2 O.
  22. أداء PCR 16 ردود الفعل باستخدام مجموعات التمهيدي إلى المنطقة (ق) من الفائدة، وحل المنتجات على هلام الاغاروز 1٪ ملطخة EtBr.

3. Supercoiling الفحص و2-الأبعاد الاغاروز جل الكهربائي

  1. تحضير الحمض النووي عازلة التوليف إصلاح (45 ملي HEPES-كوه، ودرجة الحموضة 7.8 و 70 ملي بوكل، 7.4 ملي MgCl 2؛ 0.9 ملي DTT؛ 0.4 ملي EDTA، 2 ملم ATP و 20 ميكرومتر dNTPs، 3.4٪ الجلسرين و 18 ألبومين المصل ميكروغرام البقري) . تخزين في -80 درجة مئوية. ذوبان الجليد على الجليد، وقبل استخدام إضافة 40 فسفوكرياتين ملي و 2.5 ميكروغرام فسفوكيناز الكرياتين.
  2. إعداد العازلة 10X supercoiling [500 ملي تريس (8.0 درجة الحموضة)، 500 مم كلوريد الصوديوم، و 25 ملي MgCl 2، 1 ملم EDTA]، وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
  3. خطي 300 نانوغرام من supercoiled البلازميد pSupFG1 الحمض النووي تماما باستخدام 1 ميكرولتر الوقس Topoisomerase الأول (5-15 U / ميكرولتر) مع 1Xعازلة supercoiling في رد فعل 10 ميكرولتر. احتضان الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  4. ذوبان الجليد هيلا خالية من الخلايا استخراج 24 على الجليد. لالبلازميدات استرخاء تماما، إضافة 25 ميكرولتر هيلا خالية من الخلايا استخراج وعازلة إصلاح الحمض النووي التوليف. اخلط جيدا. إضافة 1 ميكرولتر إضافية من الوقس Topoisomerase الأول لهذا المزيج، واحتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية.
  5. إنهاء ردود الفعل بإضافة كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) (تركيز النهائي 1٪) وبروتين كاف (0.25 ملغ / مل تركيز النهائي). احتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
  6. يلقي هلام الاغاروز 1٪ مع 1X تريس بورات EDTA عازلة (TBE). إضافة الحمض النووي صبغ التحميل وتحميل ردود فعل مباشرة على هلام لا يقل عن 4 حارات على حدة. تشغيل هلام لمدة 8-10 ساعة في 2 V / سم في 1X TBE (البعد 1) في درجة حرارة الغرفة لحل topoisomers.
    ملاحظة: إعداد محلول المخزون 5X TBE في 1 لتر من O 2 درهم من خلال إضافة 54 غرام من قاعدة تريس. 27.5 غرام من حمض البوريك و 20 مل من 0.5 M EDTA (8.0 درجة الحموضة).
  7. إعداد 2 لتر من 1XTBE مع 3 ميكروغرام / مل الكلوروكين فوسفات. نقع الهلام في 200 مل من هذا المحلول لمدة 20 دقيقة. تغطية علبة هلام مع رقائق الألومنيوم.
  8. لelectrophorese جل في البعد الثاني، وتحويل جل 90 ° بطريقة اتجاه عقارب الساعة وتشغيله لمدة 4-6 ساعة في 2 V / سم في الكلوروكين التي تحتوي على 1X TBE لحل supercoils الإيجابية والسلبية.
  9. وصمة عار الجل مع EtBr لمدة 1 ساعة على الكرسي الهزاز. يزيل اللون هلام مع DH 2 O لمدة 15 دقيقة وبعد ذلك تصور التوزيع الحراري للtopoisomers باستخدام تصوير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تشكيل ICL موجهة TFO-هو أمر حاسم لفحوصات البلازميد مقرها، والتي تستخدم لاستجواب الأدوار من البروتينات المعمارية في معالجة ICL في الخلايا البشرية. تغيير طبيعة الاغاروز الكهربائي للهلام هو وسيلة السطحية لتحديد كفاءة تشكيل ICL موجهة TFO. البلازميدات إيواء ICLS موجهة TFO-تهاجر مع تباطؤ التنقل من خلال مصفوفة agarose هلام (الشكل 1A، حارة 3) بالمقارنة مع البلازميدات السيطرة إلغاء crosslinked (الشكل 1A، 2 لين). قياسات الكثافة من العصابات في الممرات 2 و 3 (الشكل 1A) يكشف ما يقرب من 70٪ من السكان البلازميد تهاجر من خلال الجل مع التنقل تباطؤ (التي تم تحديدها من قبل السهم الأسود)، مشيرا إلى تشكيل ICL موجهة TFO على هذه البلازميدات.

فحوصات مناعي لونين أجريت على مقتطفات من U2OS الإنسان خلايا آرansfected إما بلازميد التحكم (P) أو البلازميدات تحتوي على ICLS موجهة TFO (P-ICL) عرض إثراء HMGB1 في المنطقة ف ICL مقارنة بالمجموعة الضابطة (P) المنطقة، عندما immunoprecipitated مع الأجسام المضادة لمكافحة HMGB1 (الشكل 2 ، أعلى لوحة، الممرات 2 و 3). وتشير هذه النتائج إلى أن الزميلة HMGB1 مع ICLS في الخلايا البشرية. عندما المنضب HMGB1 من الخلايا عن طريق العلاج سيرنا، وتضاءل تخصيب P-ICL محددة (الشكل 2، أعلى لوحة، والممرات 4 و 5)، كما هو متوقع. عندما immunoprecipitated نفس العينات باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة مفتش كعنصر تحكم خصوصية الأجسام المضادة، تم الكشف عن أي التضخيم PCR، كما هو متوقع (الشكل 2، لوحة العلوي، والممرات 6-10). كانت الممرات 10-14 (اللوحة العلوية) في الشكل رقم 2 عينات المدخلات المستخدمة للتطبيع. تظهر لوحة أعلى PCR التضخيم من قبل الاشعال بالقرب من موقع ICL موجهة TFO ولوحة أسفل يظهر PCR التضخيم عند الاشعال البعيدة إلى TFO الموجهواستخدمت الموقع ICL.

HMGB1 هو بروتين المعماري، الذي يربط الحمض النووي مشوهة مع ارتفاع تقارب من أوجب عليها DNA التالفة. فحوصات الحمض النووي supercoiling حلها من خلال ثنائية الأبعاد الكهربائي للهلام الاغاروز تثبت تعديل المعماري للتوجه TFO-البلازميدات ICL التي تحتوي على (P-ICL) مقارنة للسيطرة على البلازميدات (ف) من خلال HMGB1 في مقتطفات الخلية هيلا (الشكل 3). تم الكشف عن تعديل المعماري الناجمة عن HMGB1 يفضل أن يكون على P-ICL التي تحتوي على ركائز مع زيادة في supercoiling السلبي. البلازميدات Supercoiled تهاجر بشكل أسرع من خلال المواد الهلامية الاغاروز النسبية لالبلازميدات استرخاء أو الخطية. توزيع topoisomers يشير أكثر supercoiling من P-ICLS مقارنة P في وجود HMBG1 (الشكل 3). يدير supercoiled سلبا على الحمض النووي كما أعسر قوس في البعد الثاني في وجود الكلوروكين. وsupercoiling الناجمة عن HMGB1 على P-ICLيبدو أن تتألف في معظمها من topoisomers التي تشكل قوس أعسر (~ تم تحديد 14 topoisomers على ICL موجهة TFO التي تحتوي على البلازميدات مقارنة ~ 7 topoisomers من البلازميد السيطرة)، مشيرا إلى تشكيل supercoils السلبي. وإجمالا، فإن هذه البيانات التي البلازميدات مع ICLS موجهة TFO ويمكن استخدامها كأداة لدراسة العلاقة عالية تقارب من HMGB1 البروتين المعماري مع آفات الحمض النووي في الخلايا البشرية من خلال فحوصات مناعي لونين. وبالإضافة إلى ذلك، إجراء تعديلات معمارية محددة من ركائز ف ICL بواسطة HMGB1 يمكن أيضا أن تدرس باستخدام فحوصات supercoiling والمواد الهلامية الاغاروز ثنائية الأبعاد.

شكل 1
الشكل 1: القلوية فحص الاغاروز الكهربائي للهلام لقياس توجه TFO-ICL الكفاءة تشكيل على pSupFG1 البلازميد (A) لين 1، 1 كيلو بايت الحمض النووي سلم؛ 2 لين، ررasmid pSupFG1 (P) تستخدم كعنصر تحكم. وحارة 3، TFO الموجه ICL التي تحتوي على pSupFG1 (P-ICL). البلازميدات إيواء ICLS تهاجر ببطء أكثر في جل كما هو موضح في حارة 3 (الذي يشير إليه السهم الأسود على الجانب الأيمن من هلام). (ب) قياس الكثافة الكمي للعصابات في حارة 2 و 3 حارات تشير إلى أن ما يقرب من 70٪ من البلازميدات هي crosslinked. تم تعديل هذا الرقم من إشارة 16. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: الشذرة تخصيب فحص التظاهر من HMGB1 على إخراج TFO-المنطقة ICL التي تحتوي على البلازميد crosslinked (A). كانت PCR التضخيم من شظايا immunoprecipitated صesolved على هلام الاغاروز 1٪ باستخدام مجموعة من الاشعال القريبة بالقرب من موقع موجه TFO-ICL (باء؛ P1 و P2، أعلى لوحة)، والمجموعة الثانية من الاشعال تستخدم كوسيلة لمراقبة النوعية التي كانت أبعد (حوالي 2000 سنة مضت) من وICL موقع الموجه (باء؛ P3 و P4، اللوحة السفلية). الممرات 2 و 3 تشير إلى إثراء HMGB1 بالقرب من ICL موجهة TFO (حارة 3) نسبة إلى الحمض النووي غير التالفة (حارة 2). الممرات 4 و 5 ضوابط خصوصية الأجسام المضادة باستخدام الأجسام المضادة مفتش. حارات 6 و 7 عينات الإدخال. لين 8 هو السيطرة السلبية للتفاعل PCR ولا يحتوي على الحمض النووي القالب. P، البلازميد pSupFG1. P-ICL، TFO الموجه ICL التي تحتوي على البلازميد pSupFG1. تم تعديل هذا الرقم من إشارة 16. (ب) رسم تخطيطي للpSupFG1 البلازميد التي تبين مواقع التمهيدي لP1 و P2 وكذلك P3 و P4. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر فرسأيون من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): 2D الاغاروز الكهربائي للهلام تظهر تشكيل supercoils سلبي في إخراج TFO-البلازميدات ICL التي تحتوي على، بتسهيل من HMGB1 الجل الاغاروز 1X TBE يكشف عن التوزيع الحراري للtopoisomers الناتجة عن البلازميد وحدها (P) أو السورالين-crosslinked. البلازميد (P-ICL). هو أسرع مقارنة تنقل الأنواع supercoiled إلى البلازميدات استرخاء. وتمثل كل الفرقة topoisomer يختلف عن الفرقة أقل أو أكثر من جانب واحد بدوره أقل أو أكثر superhelical، على التوالي. قوس أعسر يمثل supercoiled سلبا (هاء) الأنواع وقوس اليد اليمنى يمثل supercoiled إيجابي (+ هاء) الأنواع. والسورالين ICL التي تحتوي على السكان البلازميد (P-ICL) يحتوي على أكثر supercoiled الأنواع من البلازميدات التحكم (P). R، البلازميدات استرخاء. S، البلازميدات supercoiled. 1D،البعد الأول للالكهربائي للهلام. 2D، البعد الثاني للالكهربائي للهلام. تم تعديل هذا الرقم من 16. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تشكيل كفاءة ICLS موجهة TFO هو يعتمد على عاملين هامين: أولا، مكونات عازلة الصحيح (على سبيل المثال، MgCl 2) وتستغرق وقتا من حضانة TFO مع الركيزة الحمض النووي هدفه (تعتمد على تقارب ملزمة للTFO إلى هدفه على الوجهين، وتركيزات المستخدمة). والثانية، والجرعة المناسبة للأشعة فوق البنفسجية (365 نانومتر) التشعيع لتشكيل crosslinks السورالين بكفاءة. تشكيل ثلاثي الأمثل يمكن تحقيقه عن طريق استخدام HPLC أو هلام TFOs تنقيته. الشوائب تلويث TFO قد يؤدي إلى منتجات crosslinked غير المرغوب فيها، والتي يمكن أن تزيد من تعقيد نتائج تجريبية. لزيادة استقرار TFOs تعلق تساهمي إلى السورالين 5'-همت، ينبغي تخزين TFOs في aliquots في -80 درجة مئوية، كما متعددة ذوبان الجليد تجميد TFOs قد يؤدي إلى تدهور أليغنوكليوتيد]. بعد تشكيل ثلاثي لاستهداف السورالين إلى موقع معين (على سبيل المثال، 5'-TA-3 "و 5'-AT-3" هي قبلferred السورالين يشابك المواقع)، وتشكيل ICL السورالين يتطلب التعرض للأشعة فوق البنفسجية. جرعة من 1.8 J / سم 2 UVA كافية لتشكيل الأمثل للICLS على البلازميدات في المختبر. ينبغي تحديد وقت التعرض باستخدام مضواء. اعتمادا على مصدر مصباح الأشعة فوق البنفسجية، بالإضافة إلى انبعاث الأشعة فوق البنفسجية في 365 نانومتر، ومصباح ويمكن أيضا تنبعث منها موجات أقصر، مما قد يؤدي إلى تكوين الحمض النووي من التلف غير مقصود في جميع أنحاء العمود الفقري الحمض النووي. لأنه سيتم استخدام موجهة TFO-البلازميدات ICL التي تحتوي على دراسات تتعلق إصلاح الحمض النووي من ICL في موقع معين، قد مثل هذه photoproducts غير مقصودة تربك نتائج الدراسات إصلاح الحمض النووي. ولذلك، ينبغي أن تستخدم مرشح مايلر لمنع التعرض للعينات لموجات أقصر. يعتمد تشكيل ICL الناجح أيضا على استقرار هيكل ثلاثي خلال UVA التشعيع. الوقت من الأشعة فوق البنفسجية المطلوب يعتمد على القوة الكهربائية من مصدر UVA. في حالتنا، مطلوب 20-30 دقيقة لتوليد عشرالبريد المطلوب جرعة من الأشعة فوق البنفسجية. خلال هذا الوقت، الحرارة المتولدة من المصباح قد يسبب فقدان المياه المتبخرة من العينات. هذه الخسارة الماء قد يغير تركيز العازلة وقد تسبب زعزعة استقرار الهياكل ثلاثي. ووضع ردود الفعل على الجليد خلال أشعة فوق البنفسجية تساعد على منع التبخر من العينات.

من أجل تحديد كفاءة تشكيل تشعبي السورالين على ركائز البلازميد، تم حل العينات في 1٪ والمواد الهلامية الاغاروز قلوية (الشكل 1). معظم بروتوكولات الكهربائي للهلام القلوية تشير إلى 2X قلوية صبغ هلام تحميل، على الرغم من بعض البروتوكولات تشير إلى أن القلوية صبغ تحميل ليس من الضروري، كشرط عازلة تغيير طبيعة من هلام كافية لتفسد العينات. في حين أن صبغ 2X يعمل بشكل جيد مع عينات من الحمض النووي المركزة، ويتطلب هذا البروتوكول تحميل حجم العينة كبير. لذلك، استخدم 6X القلوية صبغ هلام التحميل. لضمان تمسخ السليم للالسورالين crosslinked ررركائز asmid، احتضان العينات في العازلة تحميل لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وبالإضافة إلى ذلك، والمغنيسيوم 2+ يمكن أن تشكل الماغنسيوم (OH) 2 تحت الظروف القلوية، التي يحاصر الحمض النووي ويمكن أن يؤدي إلى ترسيب. يحتوي المخزن المؤقت رد فعل لتشكيل ثلاثي المغنيسيوم 2+، وبالتالي فإنه من المهم لاحتضان العينات مع EDTA للتأكد من أن المغنيسيوم 2+ هو بالكلاب قبل إضافة الصبغة القلوية تحميل للعينات. بعد الكهربائي، من المهم أن تحييد هلام، كما EtBr لا يقحم مع الحمض النووي تحت الظروف القلوية.

مقاربة بديلة لتقييم الكفاءة لتشكيل تشعبي موجه TFO هو استخدام تغيير طبيعة جل بولي أكريلاميد الكهربائي، لكن هذا الأسلوب هو أكثر شاقة، وتتطلب عملية الهضم تقييد البلازميدات يليه وضع العلامات النظائر المشعة من شظايا. يوضح هذا النهج الحالي لذلك، طريقة بسيطة نسبيا لكنها فعالة لدetermine كفاءة تشكيل ICL موجهة TFO على ركائز البلازميد. ومع ذلك، يمكن تطبيق هذه التقنية لتقييم تشكيل ICLS من قبل وكلاء تشكيل تشعبي-الآخرين كذلك.

نتيجة ناجحة لفحص البلازميد الشذرة يعتمد على عدد من العوامل. وتناقش الخطوات الحاسمة في البروتوكول واستكشاف الأخطاء وإصلاحها الاقتراحات هنا. وتشمل الخطوات الحاسمة المشاركة في هذا الاختبار، يشابك الفورمالديهايد، micrococcal الهضم نوكلياز، صوتنة، يغسل عينة، وعكس الفورمالديهايد crosslinks البروتين الحمض النووي في العينات. لكفاءة يشابك البروتين الحمض النووي، فمن المهم استخدام الفورمالدهيد جديدة. لا ينبغي أن تستخدم زجاجات الأسهم من 37٪ الفورمالديهايد لأكثر من ستة أشهر بعد الافتتاح، مثل التعرض للضوء والأكسجين يحط الفورمالديهايد. لذلك، من المفيد أيضا لأداء يشابك الفورمالديهايد دون ضوء في الخلية هود الثقافة. خطوة هامة أخرى هي نوكلياز micrococcal (MNase) digestioن من العينات. MNase الهضم ليس فقط يشق الحمض النووي الجيني إلى أجزاء أصغر لكن أيضا يزيل أي البلازميدات العالقة التي لم يتم تسليمها إلى الخلايا خلال طريقة ترنسفكأيشن، والتي يمكن أن تقلل بشكل كبير من الخلفية. فترة حضانة من MNase الهضم يجب أن تحدد تجريبيا. قد يؤدي أطول الهضم في فقدان العينات، في حين فترات حضانة أقصر قد يؤدي إلى إزالة غير فعالة من الحمض النووي غير المرغوب فيها. ويمكن رؤية نتائج ممتازة بعد حضانة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع خلط أحيانا من ردود الأفعال التي كتبها قلب الأنابيب. لمناعي فعال، يجب أن تكون مجزأة الحمض النووي لأحجام بين 800-1،200 بي بي. هذا تفتيت الحمض النووي يمكن أن يتحقق عن طريق صوتنة شامل للعينات. صوتنة فعالة من العينات يمكن أن يتحقق من خلال إعادة تعليق-الكريات في أنابيب PCR رقيقة الجدران، وبعد ذلك وضعها في sonicator حمام الماء. البقول الصوتية أكثر فعالية مقارنة صوتنة المستمر. في المضافاتأيون، فمن المهم وضع العينات على الجليد بين النبضات لمنع تدهور البروتين، وأنه من المهم أيضا لتكملة العازلة 1X الشذرة مع مثبطات الأنزيم البروتيني، وضرورية للاعتراف الأجسام المضادة والخطوات اللاحقة هطول البروتينات مستقرة. ومع ذلك، أثناء عملية مناعي، نظرا لطبيعة مسعور من حبات مغناطيسية، وسيكون سحب الحمض النووي غير محددة أسفل. للحد من الاشارات من هذه القوالب غير محددة، غسل صارم عند الضرورة القصوى. وأخيرا، عكس السليم للcrosslinks البروتين الحمض النووي من العينات ضروري لPCR التضخيم من القوالب immunoprecipitated. لتحقيق أفضل النتائج، يجب تحضين العينات لمدة لا تقل عن 12 ساعة مع SDS وبروتين K. هناك فوائد استخدام رقاقة فحص القائم على البلازميد على المقايسات رقاقة الجينوم. على سبيل المثال، الحمض النووي من التلف المستهدفة يمكن أن يتحقق بسهولة باستخدام البلازميد الركيزة الحمض النووي وTFO، مقارنة تشكيل الآفة المستهدفة TFO في موضعا الجيني. ولجبل الركيزة كما يمكن التحكم لتعديل كثافة إشارات عند استخدام البلازميد التالفة المستهدفة TFO. وعلاوة على ذلك، فإن هذه ركائز يمكن استخدامها في أي خط خلوي من اختيار واختبار لبالتعاون مع مختلف البروتينات مرشح، وبالتالي توسيع نطاق الدراسات على معالجة وإصلاح ICLS.

ويستند هذا الفحص supercoiling على الفرق في الشكل بين الخطية وsupercoiled DNA البلازميد. البلازميدات الحمض النووي Supercoiled هي أكثر إحكاما وتهاجر بشكل أسرع من خلال مصفوفة هلام مقارنة مع البلازميدات استرخاء. وتناقش الخطوات الحاسمة في البروتوكول واستكشاف الأخطاء وإصلاحها الاقتراحات هنا. لأن البروتينات المعمارية تسهل التعديلات الطوبوغرافية على ركائز الحمض النووي التالف، ويقاس من خلال تحريض supercoiling من البلازميدات استرخاء، فمن الأهمية بمكان للاسترخاء تماما البلازميدات مع Topoisomerase أولا ومن الضروري فحص مدى الاسترخاء الحمض النووي الناجم عن Topoisomerase أنا عبر agarose هلام الكهربي.وMgCl 2 موجودة في المخزن المؤقت supercoiling يمكن أن يعجل مع مرور الوقت، ووجود MgCl 2 يؤثر على التوزيع الحراري للsupercoils الإيجابية والسلبية من خلال تسهيل تشكيل supercoils إيجابي. لذلك، من المفيد إضافة MgCl 2 منفصلة إلى مزيج أو إعداد عازلة جديد في كل مرة. لفصل topoisomers من السكان البلازميد، فمن المهم لأداء الكهربائي للهلام في الجهد المنخفض جدا (~ 2 V / سم) بحيث الهجرة من الحمض النووي ويستند أساسا على هيكل / شكل جزيئات. إذا التخفيف من البلازميدات التي كتبها Topoisomerase أنا ليست كاملة، ثم فترة حضانة و / أو كمية الانزيم المستخدمة يجب أن تكون زيادة. الاسترخاء التام لابد من التأكد قبل الانتقال إلى الخطوة الحمض النووي supercoiling اللاحقة لاستخدام فحص supercoiling مع البلازميدات خففت بشكل غير كامل قد يؤدي إلى سوء تفسير البيانات، ويمكن أن تكون النتائج الصعب تكرار. مرة واحدة مجمعات للوقد حققت مؤسسة التدريب الأوروبية الاسترخاء، وفحص supercoiling من السهل نسبيا على أداء. عنصر واحد مهم من هذا الاختبار هو استخدام منطقة عازلة إصلاح الحمض النووي التوليف. ويطلب من فسفوكرياتين وفسفوكيناز الكرياتين لتضاف إلى المزيج في كل مرة لتوليد اعبي التنس المحترفين. وفي أعقاب خطوة supercoiling، فمن المهم لإزالة البروتينات من البلازميد التي يحتضنها مع SDS وبروتين K. SDS يساعد في عدم الربط بين البروتينات من الحمض النووي وبروتين كاف يتحلل البروتين، مما يترك الحمض النووي سليمة مع مستويات مختلفة من supercoiling . إذا لم تتم إزالة البروتين تماما، فإن التوزيع الحراري للtopoisomers لا تكون مرئية بشكل واضح. الحمض النووي لا يمكن تنقيته بواسطة الفينول: كلوروفورم: كحول أيزو أميلي والايثانول عجلت لأن هذا الأسلوب (وغيرها) يمكن نيك الحمض النووي، مما أدى إلى فقدان supercoiling. خطوة هامة أخرى هي إضافة الكلوروكين إلى المخزن المؤقت. الكلوروكين هو وكيل الإقحام وبالمرافعة الحمض النووي. بناء علىإقحام، فإنه يرتاح الحمض النووي supercoiled سلبا ويدخل supercoiling إيجابي على الحمض النووي استرخاء مما يسهل فصل topoisomers تحتوي على كثافة عالية من supercoiling. وهكذا supercoils الإيجابية والسلبية يمكن أن تكون متباينة. هذا هو عموما تجربة سطحية وغير قابلة للتكرار للغاية عند جميع النقاط أعلاه في الاعتبار.

ومع ذلك، إذا لم supercoiling واضح، فمن الضروري تحديد النشاط من البروتين من الفائدة. وقد استخدم supercoiling فحص 2D لدراسة التعديلات الطوبوغرافية بتسهيل من البروتينات المعمارية 27. وقد استخدم هذا الاختبار هنا في سياق معالجة التلف في الحمض النووي من ICLS موجهة TFO في الخلايا البشرية. HMGB1 بربط ICLS موجهة TFO مع قابلية عالية وخصوصية، كما هو موضح سابقا عبر في المختبر هلام الكهربي المقايسات التنقل التحول 20 وفي الخلايا البشرية باستخدام فحص البلازميد رقاقة هو موضح في غضون 16. هنا، شغناء supercoiling فحص 2D فقد ثبت أنه عند ملزما للICLS موجهة TFO في هيلا مقتطفات خالية من الخلايا، ويساعد HMGB1 في تشكيل supercoiling سلبي على ركائز (الشكل 3)، والتي قد تكون خطوة مهمة في إصلاح الآفة لأنه من المعروف supercoiling السلبي لتسهيل إزالة الحمض النووي من التلف عبر مسار معدل الالتحاق الصافي 25. هناك العديد من البروتينات المعمارية التي تورطت في معالجة التلف في الحمض النووي يمكن دراستها باستخدام هذا الاختبار. وهذا النهج تقتصر على الدراسات في المختبر، مع ذلك، هو فحص بسيط ومفيد لاستجواب العلاقة بين الهيكل وظيفة البروتينات المعمارية في سياق إصلاح الحمض النووي من التلف. ومع ذلك، فإن بروتوكول رقاقة يمكن تعديلها بسهولة لدراسة التفاعلات الحمض النووي والبروتينات في سياق الجينوم، مع تقييم الآثار المترتبة على supercoiling الحمض النووي عن طريق مثل هذه التفاعلات قد يثبت أنه من الصعب للغاية. نحن وغيرها من الجماعات دينا بالفعل صعلى أساس ثلاثي الدراسات erformed 1) من خلال ترنسفكأيشن مستقرة من البلازميد في الجينوم 28-30 فبراير) من خلال استهداف موضع الجيني 31-33 و 3) من خلال دمج TFO المعدلة السورالين (وUVA التشعيع) في الخلايا بعد ترنسفكأيشن البلازميد 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أشكر أعضاء فاسكيز المختبر لإجراء مناقشات مفيدة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية لل/ معهد الصحة الوطني للسرطان [CA097175، CA093279 إلى KMV]. والوقاية من السرطان ومعهد بحوث من تكساس [RP101501]. تمويل مقابل رسوم الوصول المفتوح: المعاهد الوطنية للصحة / المعهد الوطني للسرطان [CA093279 إلى KMV].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5'HMT Psoralen-AG30 Midland Certified Reagent Co., Midland, TX Custom order HPLC (or gel) purified
Simple ChIP Enzymatic Chromatin IP Kit Cell signaling Inc. 9003 Manufacturer suggested protocol is optimized for chromatin IP and not for plasmid IP. The control IgG and H3 antibodies as well as the Protein G beads and micrococcal nuclease are supplied by the manufacturer.
GoTaq Green Promega M7122 PCR master mix
HMGB1 antibody Abcam Ab18256
Wizard Gel and PCR cleanup kit Promega A9281
Chloroquine-diphosphate salt Sigma C6628-50G For two-dimensional agarose gel electrophoresis
EcoRI New England BioLabs R0101S
GenePORTER transfection reagent Genlantis T201015
Vaccinia Topoisomerase I Invitrogen 38042-024
Blak-Ray long wave ultraviolet lamp Upland, CA B 100 AP UVA lamp
EpiSonic Multi-Functional Bioprocessor 1100 Epigentek EQC-1100 Water bath sonicator
Mylar filter GE Healthcare Life Sciences 80112939
Agarose Sigma-Aldrich A6111
BIO-RAD Chemidoc BIO-RAD XRS+ system DNA imaging system
Glycine Fisher Scientific BP381-500
37% Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775-25ML Used for crosslinking 
Proteinase K New England Biolabs P8107S
DMEM ThermoFisher 11965092 Cell culture media
PBS ThermoFisher 70013073 Cell culture
Trypsin-EDTA ThermoFisher 25200056 Cell culture
Bromocresol green Sigma-Aldrich 114-359 DNA loading dye
Siliconized tubes Fisher Scientific  02-681-320 Low retention microfuge tube
Tris base Fisher Scientific BP152-1
Boric Acid Fisher Scientific A74-1
EDTA Fisher Scientific BP24731
Photometer InternationalLight Technologies ILT1400-A UVA dose measurement
Cell lines
Human U2OS osteosarcoma ATCC ATCC HTB-96 Cultured according to supplier’s recommendation
Human cervical adenocarcinoma HeLa ATCC ATCC-CCL-2 Cultured according to supplier’s recommendation
Proximal forward primer 5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac
Proximal reverse primer 5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg
Distal forward primer 5′-aat acc gcg cca cat agc ag
Distal reverse primer 5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moser, H. E., Dervan, P. B. Sequence-specific cleavage of double helical DNA by triple helix formation. Science. 238, 645-650 (1987).
  2. Cooney, M., Czernuszewicz, G., Postel, E. H., Flint, S. J., Hogan, M. E. Site-specific oligonucleotide binding represses transcription of the human c-myc gene in vitro. Science. 241, 456-459 (1988).
  3. Beal, P. A., Dervan, P. B. Second structural motif for recognition of DNA by oligonucleotide-directed triple-helix formation. Science. 251, 1360-1363 (1991).
  4. Vasquez, K. M., Dagle, J. M., Weeks, D. L., Glazer, P. M. Chromosome targeting at short polypurine sites by cationic triplex-forming oligonucleotides. J Biol Chem. 276, 38536-38541 (2001).
  5. Vasquez, K. M., Christensen, J., Li, L., Finch, R. A., Glazer, P. M. Human XPA and RPA DNA repair proteins participate in specific recognition of triplex-induced helical distortions. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 5848-5853 (2002).
  6. Mukherjee, A., Vasquez, K. M. Triplex technology in studies of DNA damage, DNA repair, and mutagenesis. Biochimie. 93, 1197-1208 (2011).
  7. Chin, J. Y., Glazer, P. M. Repair of DNA lesions associated with triplex-forming oligonucleotides. Mol Carcinog. 48, 389-399 (2009).
  8. Seidman, M. M., Glazer, P. M. The potential for gene repair via triple helix formation. J Clin Invest. 112, 487-494 (2003).
  9. Vasquez, K. M. Targeting and processing of site-specific DNA interstrand crosslinks. Environ Mol Mutagen. 51, 527-539 (2010).
  10. Wang, G., Levy, D. D., Seidman, M. M., Glazer, P. M. Targeted mutagenesis in mammalian cells mediated by intracellular triple helix formation. Mol Cell Biol. 15, 1759-1768 (1995).
  11. Wang, G., Seidman, M. M., Glazer, P. M. Mutagenesis in mammalian cells induced by triple helix formation and transcription-coupled repair. Science. 271, 802-805 (1996).
  12. Chen, Z., Xu, X. S., Yang, J., Wang, G. Defining the function of XPC protein in psoralen and cisplatin-mediated DNA repair and mutagenesis. Carcinogenesis. 24, 1111-1121 (2003).
  13. Derheimer, F. A., Hicks, J. K., Paulsen, M. T., Canman, C. E., Ljungman, M. Psoralen-induced DNA interstrand cross-links block transcription and induce p53 in an ataxia-telangiectasia and rad3-related-dependent manner. Mol Pharmacol. 75, 599-607 (2009).
  14. Vare, D., et al. DNA interstrand crosslinks induce a potent replication block followed by formation and repair of double strand breaks in intact mammalian cells. DNA repair. 11, 976-985 (2012).
  15. Huang, Y., Li, L. DNA crosslinking damage and cancer - a tale of friend and foe. Transl Cancer Res. 2, 144-154 (2013).
  16. Mukherjee, A., Vasquez, K. M. HMGB1 interacts with XPA to facilitate the processing of DNA interstrand crosslinks in human cells. Nucleic Acids Res. 44, 1151-1160 (2016).
  17. Bidney, D. L., Reeck, G. R. Purification from cultured hepatoma cells of two nonhistone chromatin proteins with preferential affinity for single-stranded DNA: apparent analogy with calf thymus HMG proteins. Biochem Biophys Res Commun. 85, 1211-1218 (1978).
  18. Bianchi, M. E., Beltrame, M., Paonessa, G. Specific recognition of cruciform DNA by nuclear protein HMG1. Science. 243, 1056-1059 (1989).
  19. Jung, Y., Lippard, S. J. Nature of full-length HMGB1 binding to cisplatin-modified DNA. Biochemistry. 42, 2664-2671 (2003).
  20. Reddy, M. C., Christensen, J., Vasquez, K. M. Interplay between human high mobility group protein 1 and replication protein A on psoralen-cross-linked DNA. Biochemistry. 44, 4188-4195 (2005).
  21. Das, D., Scovell, W. M. The binding interaction of HMG-1 with the TATA-binding protein/TATA complex. J Biol Chem. 276, 32597-32605 (2001).
  22. Little, A. J., Corbett, E., Ortega, F., Schatz, D. G. Cooperative recruitment of HMGB1 during V(D)J recombination through interactions with RAG1 and DNA. Nucleic Acids Res. 41, 3289-3301 (2013).
  23. Lange, S. S., Mitchell, D. L., Vasquez, K. M. High mobility group protein B1 enhances DNA repair and chromatin modification after DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10320-10325 (2008).
  24. Lange, S. S., Reddy, M. C., Vasquez, K. M. Human HMGB1 directly facilitates interactions between nucleotide excision repair proteins on triplex-directed psoralen interstrand crosslinks. DNA repair. 8, 865-872 (2009).
  25. Park, J. Y., Ahn, B. Effect of DNA topology on plasmid DNA repair in vivo. FEBS letters. , 174-178 (2000).
  26. Wu, Q., et al. High-affinity triplex-forming oligonucleotide target sequences in mammalian genomes. Mol Carcinog. 46, 15-23 (2007).
  27. Sheflin, L. G., Spaulding, S. W. High mobility group protein 1 preferentially conserves torsion in negatively supercoiled DNA. Biochemistry. 28, 5658-5664 (1989).
  28. Betous, R., et al. Role of TLS DNA polymerases eta and kappa in processing naturally occurring structured DNA in human cells. Mol Carcinog. 48, 369-378 (2009).
  29. Luo, Z., Macris, M. A., Faruqi, A. F., Glazer, P. M. High-frequency intrachromosomal gene conversion induced by triplex-forming oligonucleotides microinjected into mouse cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 9003-9008 (2000).
  30. Vasquez, K. M., Wang, G., Havre, P. A., Glazer, P. M. Chromosomal mutations induced by triplex-forming oligonucleotides in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 27, 1176-1181 (1999).
  31. Puri, N., et al. Minimum number of 2'-O-(2-aminoethyl) residues required for gene knockout activity by triple helix forming oligonucleotides. Biochemistry. 41, 7716-7724 (2002).
  32. Christensen, L. A., Finch, R. A., Booker, A. J., Vasquez, K. M. Targeting oncogenes to improve breast cancer chemotherapy. Cancer Res. 66, 4089-4094 (2006).
  33. Boulware, S. B., et al. Triplex-forming oligonucleotides targeting c-MYC potentiate the anti-tumor activity of gemcitabine in a mouse model of human cancer. Mol Carcinog. 53, 744-752 (2014).

Tags

علم الوراثة، العدد 117، النوكليوتيد تشكيل ثلاثي، وإصلاح الحمض النووي، interstrand الحمض النووي crosslinks، البلازميد رقاقة فحص، 2D supercoiling الفحص، HMGB1
أدوات لدراسة دور HMGB1 البروتين المعماري في تجهيز اللولب تشويه، والحمض النووي الخاصة بالموقع Interstrand Crosslinks
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mukherjee, A., Vasquez, K. M. Tools… More

Mukherjee, A., Vasquez, K. M. Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks. J. Vis. Exp. (117), e54678, doi:10.3791/54678 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter