Summary
Gendeletionsmutanter frembragt ved homolog rekombination er guldstandarden for genfunktionsstudier. OSCAR (One Step Construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids) fremgangsmåden til hurtig generering af deletionskonstruktioner er beskrevet. Agrobacterium- medieret svamptransformation følger. Endelig præsenteres en PCR-baseret bekræftelsesmetode for gendeletioner i svamptransformanter.
Abstract
Præcis sletning af gen (er) af interesse, medens resten af genomet uændret giver det ideelle produkt til at bestemme det pågældende gens funktion i den levende organisme. I denne protokol beskrives OSCAR-metoden for præcis og hurtig deletionsplasmidkonstruktion. OSCAR er afhængig af kloningsystemet, hvori en enkelt rekombinase-reaktion udføres, der indeholder de oprensede PCR-amplificerede 5'- og 3'-flanker af genet af interesse og to plasmider, pA-Hyg OSCAR (markørvektoren) og pOSCAR vektor). Bekræftelse af den korrekt monterede deletionsvektor udføres ved hjælp af restriktionsfordøjelsesmapping efterfulgt af sekventering. Agrobacterium tumefaciens anvendes derefter til at mediere introduktion af deletionskonstruktionen i svampesporer (benævnt ATMT). Endelig beskrives et PCR-assay for at bestemme, om deletionskonstruktionen integreres ved homolog eller ikke-homolog rekombination, indikerende gendeletion ellerEktopisk integration, henholdsvis. Denne fremgangsmåde er blevet anvendt til sletning af talrige gener i Verticillium dahliae og i Fusarium verticillioides blandt andre arter.
Introduction
Genetisk dissektion er en kraftfuld metode til bestemmelse af den funktionelle betydning af individet eller kombinationer af gener. En standard tilgang til at forstå rollen af specifikke gener er produktion af enkeltgenmutanter uændret i ethvert andet gen. Den mest kraftfulde og mindst potentielt konfronterende tilgang er fuldstændig og præcis deletion af et gen af interesse er åben læseramme (GOI ORF) uden skade på nogen anden genfunktion.
Fordi standardiseringsmetoder til sletning af plasmidgenerering kræver flere trin, var det rationelle for OSCAR 1 at producere en hurtigere in vitro- tilgang. Figur 1 viser samleprocessen i OSCAR-tilgangen. Fremgangsmåden beskrevet her har den fordel at kombinere hurtig konstruktion af individuelle gendeletionsvektorer i en enkelt multipartreaktion i kombination med efterfølgende Agrobacterium tumefaciens- medieret transfoRmation (ATMT). OSCAR er meget hurtig og sammenligner sig godt med andre strategier, såsom anvendelse af Gibson-samling i gær 2 . OSCAR-metoden er blevet anvendt succesfuldt med flere Ascomycota-svamparter. Disse arter omfatter: Fusarium verticillioides (upubliceret), Verticillium dahliae 3 , Setosphaeria turcica 4 , Metarhizium robertsii 5 , Fusarium oxysporum f. sp. Vasinfectum 6 , Pestalotiopsis microspora 7 , Colletotrichum higginsianum 8 og Dothistroma septosporum 9 og Sarocladium zeae (upubliseret) .
Denne protokol tilvejebringer trin-for-trin instruktion til fremgangsmåden inklusiv primer design, flank PCR amplifikation, OSCAR BP reaktion, deletion konstruktion struktur bekræftelse, transformatIon af Agrobacterium med konstruktionen efterfulgt af ATMT-baseret overførsel af deletionskonstruktionen i svampecellerne og endelig differentiering af svampe deletionsmutanter fra dem med ektopisk integrerede deletionskonstruktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Primer Design for PCR Amplification of Gene Flanks
- Download til en tekstbehandlingsfil den genomiske region af genet af interesse (GOI), herunder den åbne læseramme (ORF) og mindst 2 kb flankerer genet på hver side fra FungiDB eller anden genomisk datafilde.
- Fremhæv ORF'en beregnet til sletning og etiket start og stop kodoner.
- Identificer og markér tilstødende ORF'er inden for den downloadede sekvens.
- Brug 2-kb 5'-enden af GOI ORF og primerdesignværktøjet (se Materialeliste) til at designe PCR-primerpar O1 og O2 for at generere et minimumsstørrelsesprodukt på 1 kb. Pas på ikke at påvirke tilstødende ORF'er.
- Indsæt 2 kb 5'-flanken i "Sequence Entry" -vinduet. Klik på "Show Custom Parameters" boksen. Indtast følgende brugerdefinerede designparametre: primer TM 58 (min), 60 (opt) og 62 (max); Primer GC 40 (min), 50 (opt) og 60 (maks); Primerstørrelse 22 (min.), 24 (opt) og 26(Max); Amplicon Størrelse 1250 (min), 1500 (opt) og 2000 (max).
- Vælg det resultat, der placerer den omvendte primer (O2) tættest på ORF'en. Tag et skærmbillede af analyserne, og kopier og indsæt primer-sekvenserne i tekstbehandlingsdokumentet.
- Gentag processen til 3 'flank for at generere primere O3 og O4, denne gang vælger resultatet placeringen af den fremadrettede primer (O3) tættest på målet ORF.
- Tilføj passende vedhæftningssteder til 5'-ender af primere 1 til 4 (se tabel 1 ).
- Desuden skal du designe og bestille ORF-specifikke primere, der skal bruges til sletning af bekræftelse i afsnit 4 nedenfor. Parametrene skal være de samme som i trin 1.4.1, undtagen bruge Amplicon Size 500 (min), 750 (opt) og 1000 (max) justering for længden af ORF, hvis det er nødvendigt. Til sidst, til bekræftelse af homologe rekombinanter, genereres 5'-ud og 3'-out-primere lige udenfor flankerne inden for kromosomet. Disse "ud" primere vil blive brugt sammen medHenholdsvis hygR (210) og hygF (850) ( fig. 2 ).
- Ordreprimere.
2. Produktion af OSCAR Constructs
- Ved hjælp af en højfidelighed Taq udføres to reaktioner, en hver for 5'- og 3'-flankerne ved anvendelse af primere (100 μM) O1 og O2 i en reaktion og primere O3 og O4 i den anden. Reaktionsblandingen indeholder følgende: 29,5 μL sterilt destilleret vand (SDW), 5 μl 10x LA PCR-buffer, 8 μl 2,5 mM dNTP-blanding, 5 μl 25 mM MgCl2, 1 μl template (50 ng / μl), 0,5 μl hi- Fidelity Taq , 0,5 μL Primer O1 og 0,5 μL Primer O2 til 5'-flank (eller 0,5 μL Primer O3 og 0,5 μL Primer O4 til 3'-flank) Brug reaktionsbetingelser er som følger: 94 ° C i 1 min, derefter 30 cykler af 94 ° C i 30 s, 60 ° C i 30 s, 72 ° C i 2 minutter, derefter endelige trin på 72 ° C i 5 minutter og derefter holdes ubestemt ved 10 ° C.
- Kør 0,8%Agarose 1x TAE (40 mM Tris acetat pH 8,3, 1 mM EDTA) gelelektroforese til ca. 125 Vh i et standard minigelapparat til bestemmelse af produktstørrelse og relativ koncentration. Post pletter gelen med ikke-ethidium plet i henhold til producentens instruktioner. Visualiser på en UV-belysning.
- Hvis 5'- og 3'-flankprodukterne er i omtrent ens koncentration, kombineres dem og anvender et affinitetssøjle kit (eller PEG-udfældning 90 μl kombineret PCR-produkter, 240 μl TE buffer pH 7,5, 160 μl 30% polyethylenglycol PEG8000 30 mM MgCl 2 ) at co-rense PCR-produkterne i overensstemmelse med producentens protokol. Hvis de ikke er af lige koncentration, kombineres alt lavkoncentrationsprodukt med en estimeret lige stor mængde produkt fra reaktionen med højere udbytte.
- Brug et spektrofotometer til at måle renset DNA-koncentration.
- Udfør BP reaktion ved at blande følgende: 1 μL 60 ng / μl pOSCAR, 2 μL 60 ng /ΜL pA-Hyg-OSCAR, 1 μl 60 ng / μL kombinerede flanker, 1 μl klonase. Inkubér i 16 timer ved 25 ° C. Afslut reaktionen ved at tilsætte 0,5 μl proteinase K og inkuber i 10 minutter ved 37 ° C.
- Transform høj kompetence E. Coli celler. Både kommercielt tilgængelige kompetente celler og hjemmebaserede DH5a CaCl2 kompetente celler blev anvendt succesfuldt som modtagere som beskrevet af fabrikantens instruktioner. Plade på lav natrium (0,5 g / L NaCl) LB indeholdende 100 μg / ml spektinomycin (Spec).
- Identificer den korrekte konstruktion ved at udføre DNA minipreps 10 af kolonier frembragt ovenfor. Udfør dobbelt fordøjelse med Hin dIII og Kpn I som følger: pipette 5 μL DNA, 2 U af hvert enzym, 2 μl passende 10 x buffer med SDW til et totalt 20 μL volumen. Dette frigiver indsatsen (ca. 4,5 kb med 1,5 kb genflanker) fra vektoren ( ca. 7 kb) og skærer steder iFlanker, der kan give forudsigelige båndstørrelser.
- Sekvens 11 vælger kloner, der viser et passende båndmønster.
3. Agrobacterium tumefaciens medieret transformation (ATMT) af svampe
- Transform Agrobacterium tumefaciens stamme AGL1 med OSCAR deletion konstruktion 12 .
- Transform svamp med AGL1 indeholdende GOI OSCAR deletionsplasmidet. For at gøre dette udfør følgende trin:
- Forbered en svampespor suspension med sterilt vand ved 2 x 106 sporer / ml. Kvantificere sporer på en hæmocytometer eller automatiseret celletæller. Placer 500 μL af dette i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Denne opsætning er til 4 transformationsplader.
- Brug en blå steril engangsløjfe til at tilføje en let synlig gob (skal dække ca. 20% af sløjndiameteren) af deletionsplasmidet indeholdende AGL1 fra 2-3 dages gammelt LB-Spec 100 medium (se MAterials Liste for sammensætning) indeholdende plader og blandes i sporesuspensionen. Vortex til bakterieceller er godt dispergeret ( ca. 5 min mediumhastighed).
- Pipetter 100 μl af conidia-Agro-suspensionen på midten af et cellulosemembranfilter anbragt på hver af fire 6 cm petriskåle indeholdende co-dyrkningsmedium 12 .
- Spred suspensionen med sterile glasperler (ca. 4) for at dække hele overfladen af membranfilteret. Alternativt spred suspensionen ved hjælp af et traditionelt spreder værktøj. Lad membranfilteret tørre i en hætte i ca. 10 minutter, pakning med paraffinfilm. Gentag trin 3.2.2 og 3.2.3 for at konfigurere flere transformationer.
- Inkuber pladen i 2 dage ved stuetemperatur, inverteret.
- Overfør membranfilteret på 6 cm Aspergillus selektionsmedium 12 plader indeholdende hygromycin B (Hyg) 150 μg / ml, 200 mM cefotaxim og 100 μg / mlmoxalactam. Inkuber ved stuetemperatur i 5-7 dage inden isolering af Hyg-resistente kolonier.
- Med sterile tandstikkere, overfør formative transformanter på 6 cm kartoffel Dextrose Agar (PDA) plader indeholdende 150 μg / mL Hyg, 100 μg / mL kanamycin.
4. Deletion Mutant Identification by PCR
- Ekstraher DNA til PCR fra transformanter ved termolyse 13 .
- Når transformanter danner kolonier på PDA fra trin 3.2.7, skal du bruge et sterilt tandstikker til at overføre en lille mængde (2 mm x 2 mm) mycelium eller gærceller fra kolonien til 100 μl lysisopløsning (50 mM natriumphosphat, pH 7,4, 1 mM EDTA, 5% glycerol) i et mikrocentrifugerør.
- Inkuber blandingen ved 85-90 ° C i 20-30 minutter. Opbevar råproduktet, der indeholder genomisk DNA ved -20 ° C indtil anvendelse i trin 4.2.
- Udfør 4 PCR reaktioner pr. Transformant, en hver til dEtekter homolog rekombination af henholdsvis 5'- og 3'-flankerne, en for den selekterbare markør (hygromycinphosphotransferase i dette tilfælde) og en for GOI ORF.
BEMÆRK: Vi bruger generelt billig low-faith Taq til disse reaktioner. Reaktionsbetingelser er som beskrevet i trin 2.1 ovenfor og indeholder SDW 20 μL, 10x Taq buffer 2,5 μL, dNTPS (10 mM) 0,5 μl, hjemmelavet Taq 14 , 0,5 μl, Primer A (100 μM) 0,5 μl, Primer B (100 μM ) 0,5 μl, skabelon 0,5 μl. Lavere koncentrationsprimerlagre (10 μM) kan anvendes lige så godt. - Kør en agarosegel ( f.eks. 0,8%) af PCR-produkterne. Deletionsmutanter vil producere Hyg-båndet, men ikke et ORF-produkt. Ektopiske integanter vil vise begge bands. Vildtype vil kun producere ORF båndet.
- Gem permanent deletionsmutanter permanent (og en ektopisk transformant eller to til kontroller) til fremtidig brug.
BEMÆRK: 15% glycerol bruges til sRevede vores stammer langsigtet ved -80 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
OSCAR-metoden genererer i en enkelt reaktion et plasmid indeholdende flankerne af målgenet, der skal slettes omkring den selekterbare markørkassette. Produktionen af sletningskonstruktioner under anvendelse af OSCAR er meget effektiv. Systemet kan imidlertid producere partielle konstruktioner indeholdende nogle, men ikke alle tre fragmenter (de to genflanker og den selekterbare markør). Generelt indeholder størstedelen af E. coli transformanter den korrekte OSCAR konstruktion. For eksempel viser figur 2 OSCAR deletionskonstruktionen for Verticillium dahliae genet VDAG_06812. I dette tilfælde mangler flankerne af VDAG_06812 Hin dIII eller Kpnl-steder, og derfor bør en plasmidindsats på 4,247 bp frigives. Figur 3 viser Hin dIII- Kpn I restriktionsenzym dobbelt fordøjelsesbekræftelse af den korrekte plasmidstruktur undtagen for banerne 5 og 11, der repræsenterer anomaløs konstruktionts. Figur 4 viser endelig bekræftelse af to forskellige gen deletioner af Southern blot. Figur 5 viser en endelig PCR-tilgang som et alternativ til Southern blot.
Figur 1: OSCAR sletning konstruktion reaktion. OSCAR deletion-konstruktionsprocessen indbefatter separat PCR-amplifikation af 5'- og 3'-genflankerne efterfulgt af en BP-klonase-reaktion med de kombinerede rensede flankprodukter og de binære og selektionsmarkørplasmider. B1r, B2r, B3, B4, P1r, P2r, P3, P4, R1, R2, L3 og L4 repræsenterer lambda-rekombinationssteder. Genudskriv med tilladelse fra reference 1 .
Figur 2: OSCAR sletningskonstruktion til < Em> Verticillium dahliae gen VDAG_06812. Positioner af restriktionsenzymgenkendelse og primerglødningssteder for at verificere korrekt sletningskonstruktionsstruktur er vist. Genudskriv med tilladelse fra reference 1 .
Figur 3: Restriktionsfordøjelsesbekræftelse af deletionskonstruktionsstrukturen af VDAG_06812 med KpnI og Hin dIII. Plasmider blev dobbeltfordøjet og analyseret ved gelelektroforese på en 0,8% agarosegel. Den korrekte konstruktion frembringer to bånd, på ca. 6,9 kb og 4,2 kb, der repræsenterer den binære vektorbackbone og HygR-markøren fusioneret til målgenflankerne. Genudskriv med tilladelse fra reference 1 .
Figur 4: Southern blot hybridisering bekræfter sletning af VDAG_02161 og VDAG_09930 i V. dahliae ved anvendelse af OSCAR deletionskonstruktioner. Genomiske DNA'er blev fordøjet med Bcl I. De blev derefter probet samtidigt med VDAG_02161 og VDAG_09930 ORF prober. Hybridiseringsbånd er 2.757 bp og 1.426 bp for vildtype alleler af henholdsvis VDAG_02161 og VDAG_09930. Prøverne er som følger: Bane 1: Vildtype-stamme VdLs.17; Bane 2: deletionsmutantstamme 02161.1; Bane 3: deletionsmutantstamme 02161.3; Bane 4: ektopisk transformant stamme Ect 02161.2; Bane 5: deletionsmutantstamme 09930.3; Bane 6: deletionsmutantstamme 09930.10; Bane 7: ektopisk transformant stamme Ect 09930.4. Genudskriv med tilladelse fra Reference 1 .
Figur 5: Deletion mutant bekræftelse ved PCR. Analyse af deletion og ektopiske Fusarium verticillioides transformanter for gen FVEG_13253. Baner 1 top og bund, markør; Bane 2-6 top gel-transformant PCR 5'-out fragment amplifikation; Baner 7-11 top gel ORF amplifikation; Baner 2-6 bund gel Hyg gen amplifikation; Baner 7-11 bund gel 3 'ud fragment amplifikation. Prøver er deletionsstammer 11/31 (baner 2 og 7), 11/32 (baner 3 og 8), 11/33 (baner 4 og 9) og ektopiske transformanter 11/34 (baner 5 og 10) og 11 / 35 (banerne 6 og 11).
| Primer | Brug | sekvens |
| Primer O1- (attB2r) | Amplifikation af 5'flank,Primer fremad | 5'-GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGAA |
| Primer O2- (attB1r) | Amplifikation af 5'flank, primer omvendt | 5'-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGT |
| Primer O3- (attB4) | Amplifikation af 3'-flank, primer fremad | 5'-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGTT |
| Primer O4- (attB3) | Amplifikation af 3'-flank, primer omvendt | 5'-GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGT |
Tabel 1: Specifikke OSCAR primer 5'-forlængelser tilsat til genspecifikke primersekvenser.
| Primer | Brug | sekvens |
| OSC-F | 5'-CTAGAGGCGCGCCGATATCCT | |
| OSC-R | OSCAR reverse sekventerings primer, sekvenser anti-sense streng af 5'flank | 5'-CGCCAATATATCCTGTCAAACACT |
| HygR (210) | Reverse sekventerings primer, sekvenser antisensstreng af 5'flank | 5'-GCCGATGCAAAGTGCCGATAAACA |
| HygF (850) | Forward sekventerings primer, sekvenser mærker streng af 3'-flanken | 5'-AGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCG |
| Ny Hyg Marker Forward | For at amplificere hygromycinresistensgenet som en kontrol (sammen med New Hyg Marker Reverse Primer nedenfor) | 5'-GACAGGAACGAGGACATTATTA |
| Ny Hyg Marker Reverse | For at amplificere hygromycinresistensgenet som en kontrol (sammen med New Hyg Marker Forward primer ovenfor) | 5'-GCTCTGATAGAGTTGGTCAAG |
Tabel 2: Primerer til analyse af OSCAR deletionskonstruktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
One-Step Konstruktion af Agrobacterium- Recombination-ready-plasmids (OSCAR) har med succes været anvendt med et stadigt stigende antal Ascomycota svampe. Metoden bør også let kunne anvendes på Basidiomycota og arter fra andre svampepyla (med passende promotorer, der kører selekterbare markørgener), forudsat at Agrobacterium- medieret transformation og homolog rekombination er mulige. Yderligere markørvektorer er blevet dannet for at diversificere valg af anti-svampeforbindelse samt tillade fremstilling af dobbelt- og højere-ordensmutanter. Disse indbefatter resistens over for G418, nourseothricin, og for nylig har herbiciderne glufosinat ammonium og chlorimuronethyl 4 .
Metoden blev udarbejdet til brug med Verticillium dahliae, hvorfra billederne her præsenteres primært 1 . Mere for nylig OSCAR er blevet brugt udførligt til sletningAf gener i mycotoxigenic svampen Fusarium verticillioides. Over 60 deletionskonstruktioner er blevet fremstillet og deletionsmutanter for mere end 30 gener genereret (upubliceret).
I sin nuværende iteration kræver processen ca. 4-6 uger at have et sæt bekræftede deletionsmutanter i hånden. Følgende er en kort liste over de vigtigste OSCAR-trin og den omtrentlige tid, der er nødvendig for at opnå dem: 1) Design og indkøb af OSCAR-primere baseret på genomdata (5 dage), 2) flankforstærkning og kloning, (2 dage), 3) Klonbekræftelse ved miniprep og sekventering (1 uge), 4) indføring af plasmid i Agrobacterium for ATMT (4 dage), 5) produktion af transformanter ved ATMT i Fusarium verticillioides og vokse ud (2 uger, bemærk at dette afhænger af vækstrate Af svampen under undersøgelse), termolyse og PCR-bestemmelse af transformantgenotyper (2 dage), 6) enkeltsporing, genotype-bekræftelse og opbevaring (1-2 uger).
15 . Andre OSCAR-markørplasmider, såsom pA-Bar-OSCAR og pA-Sur-OSCAR, kan være tilgængelige fra forfattere 5 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker følgende grundskole- og gymnasieelever for deres arbejde med at generere OSCAR-mutanter i Fusarium verticillioiodes : Anjellica Miller, Athar Naseer, Xiu Lin, Katelyn Woodburry, Chelsea Patterson, Kathleen Robertson, Krystina Bradley, Ashton Rogers, Alexis McKensie, Manny Hernandez , Ashli Crepsac, Jeff Delong, Christian King, Gi Jeong, Maria Belding, Christy Burre, Daniel O'Meara, Lauren (Victoria) Cook, Jake Goodman, Sampriti De, Oge Okoye, Alyssa Beckstead, Garrett Hibbs, Nick Goldstein, Caroline Twum , Chris Benson, Louis Stokes, Hannah Itell, Jane Hulse, Jasim Mohammed, James Loggins, Kelli Russell, Gre'Nisha Jones, Kristin Sheaffer, Mariam Hammady, Ava Wilson, Katrina Bazemore, Toney Harper, Karlin McGhee, Mohmed Momin, Rima Momin , Thi Ngoc Le og Angel Pham.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FungiDB | Database/ http://fungidb.org/fungidb/ | ||
| IDT PrimerQuest | IDT | Primer design online software/ http://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index | |
| Microsoft Word | Sequence file manipulation | ||
| Low Na LB Spec 100 medium | E. coli transformant selection, composition: 1% tryptone, 0.05% NaCl, 0.5% yeast extract, 1.5% agar if for solid medium | ||
| Co-cultivation medium | ATMT transformation induction (Reference 12) | ||
| Aspergillus minimal medium with Hygromycin | Fungal transformant selection | ||
| PDA medium | Acumedia | 7149A | Single spore slant tubes |
| PDA-Hyg-Kan medium | Fungal ransformant isolation, PDA containing 150 μg/mL hygromycin B and 100 μg/mL Kanamycin | ||
| Glass beads | Genlantis | C400100 | Plate spreading |
| Nitrocellulose filters (47 mm) | Fisher | 09-719-555 | Co-culturing for ATMT |
| Various centifuge tubes | multiple preps | ||
| Petri plates (various) | Culturing of bacteria and Fungi | ||
| pA-Hyg OSCAR | Addgene | 29640 | Selectable marker vector |
| pOSCAR | Addgene | 29639 | Assembly vector |
| DH5α One Shot Competent E. coli cells | Life Technologies | 12297-016 | BP reaction transformation |
| ccdB survival E. coli cells | Life Technologies | A10460 | Maintenance of pOSCAR |
| Wooden transfer sticks | Colony streaking | ||
| Toothpicks | Colony picking | ||
| Microcentrifuge | Pelleting Bacteria, etc. | ||
| Preparative centrifuge | Fungal spore collection | ||
| Dissecting microscope | Single spore isolation | ||
| Automated Cell Counter | Spore suspension calculation | ||
| Compound microscope | Hemocytometer cell counting | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | PCR gene flank produict purification |
| TaKaRa LA Taq | Takara Bio USA | RR002A | Hi Fidelity taq polymerase for OSCAR flank generation |
| Hygromycin B | InvivoGen | ant-hg-5 | |
| Spectinomycin | Sigma | 22189-32-8 | |
| Cefotaxime | TCI America | C2224 | |
| Kanamycin | 11815032 | ||
| Moxalactam | Sigma-Aldrich | 43963 | |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | Post staining agarose gels |
| Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (Cat. No. 28104) | |||
| (OneShot_ Mach1TM T1R or One Shot_ OmniMAX™ 2 T1R from Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | C862003 | |
| Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Thermo Fisher Scientific | 11789020 | Used to assemble deletion construct in pOSAR |
References
- Paz, Z., García-Pedrajas, M. D., Andrews, D. L., Klosterman, S. J., Baeza-Montañez, L., Gold, S. E. One step construction of Agrobacterium-Recombination-ready-plasmids (OSCAR), an efficient and robust tool for ATMT based gene deletion construction in fungi. Fungal Genet Biol. 48 (7), 677-684 (2011).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Klosterman, S. J., et al. Comparative genomics yields insights into niche adaptation of plant vascular wilt pathogens. PLoS Pathog. 7 (7), (2011).
- Xue, C., Wu, D., Condon, B. J., Bi, Q., Wang, W., Turgeon, B. G. Efficient gene knockout in the maize pathogen Setosphaeria turcica using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Phytopathology. 103 (6), 641-647 (2013).
- Xu, C., et al. A high-throughput gene disruption methodology for the entomopathogenic fungus Metarhizium robertsii. PloS One. 9 (9), (2014).
- Crutcher, F. K., Liu, J., Puckhaber, L. S., Stipanovic, R. D., Bell, A. A., Nichols, R. L. FUBT, a putative MFS transporter, promotes secretion of fusaric acid in the cotton pathogen Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum. Microbiology. 161, 875-883 (2015).
- Yu, X., Wang, Y., Pan, J., Wei, D., Zhu, X. High frequency of homologous gene disruption by single-stranded DNA in the taxol-producing fungus Pestalotiopsis microspora. Ann Microbiol. 65 (4), 2151-2160 (2015).
- Korn, M., Schmidpeter, J., Dahl, M., Müller, S., Voll, L. M., Koch, C. A Genetic Screen for Pathogenicity Genes in the Hemibiotrophic Fungus Colletotrichum higginsianum Identifies the Plasma Membrane Proton Pump Pma2 Required for Host Penetration. PloS One. 10 (5), e0125960 (2015).
- Chettri, P. Regulation of dothistromin toxin biosynthesis by the pine needle pathogen Dothistroma septosporum: a thesis presented in the partial fulfilment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy (PhD) in Genetics at Massey University, Manawatu, New Zealand . , Massey University. Manawatu, New Zealand. (2014).
- Chen Zhou,, Yujun Yang,, Jong, A. Y.
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. P Natl Acad SciUSA. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Khang, C. H., Park, S. Y., Rho, H. S., Lee, Y. H., Kang, S. Filamentous fungi (Magnaporthe grisea and Fusarium oxysporum). Agrobacterium Protocols. Wang, K. an 2, Humana Press Inc. Totowa, NJ. 403-420 (2007).
- Zhang, Y. J., Zhang, S., Liu, X. Z., Wang Wen, H. A., M, A simple method of genomic DNA extraction suitable for analysis of bulk fungal strains. Lett Appl Microbiol. 51 (1), 114-118 (2010).
- Pluthero, F. G. Rapid purification of high-activity Taq DNA polymerase. Nucleic Acids Res. 21 (20), 4850-4851 (1993).
- McCluskey, K. Boosting Research and Industry by Providing Extensive Resources for Fungal Research. Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications. , Springer International Publishing. 361-384 (2016).
