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Neuroscience

चूहों और उनके Hippocampi के अंश में Electroconvulsive बरामदगी Postsynaptic घनत्व प्रोटीन में जब्ती प्रेरित परिवर्तन की जांच करने के लिए

Published: August 15, 2017 doi: 10.3791/56016
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2
1Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Neuroscience Program, University of Illinois at Urbana-Champaign

Summary

Electroconvulsive जब्ती (ईसीएस) गंभीर अवसाद के लिए Electroconvulsive चिकित्सा का एक प्रायोगिक पशु मॉडल है । ईसीएस वैश्विक रूप से हिप्पोकैंपस में गतिविधि को उत्तेजित करता है, synaptogenesis और synaptic प्लास्टिक के लिए अग्रणी । यहां, हम चूहों में ईसीएस प्रेरण के लिए तरीकों का वर्णन और उनके hippocampi के सेलुलर अंश के लिए synaptic प्रोटीन में जब्ती प्रेरित परिवर्तन की जांच ।

Abstract

Electroconvulsive जब्ती (ईसीएस) Electroconvulsive चिकित्सा, गंभीर अवसाद के लिए सबसे प्रभावी उपचार का एक प्रायोगिक पशु मॉडल है । ईसीएस कम मृत्यु दर और न्यूरॉन की मौत के साथ सामान्यीकृत टॉनिक-क्लोनल बरामदगी और विरोधी मिरगी दवाओं स्क्रीन करने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल मॉडल है लाती है । यहां, हम एक ईसीएस प्रेरण विधि का वर्णन जिसमें एक संक्षिप्त ५५-mA वर्तमान ०.५ एस के लिए पुरुष चूहों २००-२५० जी के लिए वजन में कान क्लिप इलेक्ट्रोड के माध्यम से दिया है । इस तरह के द्विपक्षीय उत्तेजना चरण 4-5 क्लोनल बरामदगी है कि के बारे में पिछले 10 एस का उत्पादन किया । तीव्र या जीर्ण ईसीएस की समाप्ति के बाद, ज्यादातर चूहों को शर्मसार "नहीं जब्ती" चूहों से व्यवहार से अलग हो बरामद किया । क्योंकि ईसीएस दुनिया भर में मस्तिष्क गतिविधि तरक्की, यह भी synaptic प्रोटीन की गतिविधि पर निर्भर परिवर्तन और synaptic शक्ति कई तरीकों का उपयोग कर अपने प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । विशेष रूप से, postsynaptic घनत्व के उपसेलुलर भिन्नीकरण (PSD) पश्चिमी सोख्ता के साथ संयोजन में इस विशेष synaptic संरचना में synaptic प्रोटीन की बहुतायत के मात्रात्मक निर्धारण के लिए अनुमति देता है. एक पिछले अंश विधि है कि कुतर दिमाग की बड़ी राशि की आवश्यकता के विपरीत, हम यहां का वर्णन एक छोटे पैमाने पर भिन्नीकरण विधि एक एकल चूहे के hippocampi से PSD को अलग करने के लिए, सुक्रोज ढाल केंद्रापसारक के बिना । इस विधि का प्रयोग, हम बताते है कि अलग PSD अंश postsynaptic झिल्ली प्रोटीन, PSD95, GluN2B, और GluA2 सहित शामिल हैं । Presynaptic मार्कर synaptophysin और घुलनशील cytoplasmic प्रोटीन α-tubulin psd अंश से बाहर रखा गया था, सफल psd अलगाव का प्रदर्शन । इसके अलावा, पुरानी ईसीएस psd में GluN2B अभिव्यक्ति की कमी हुई, यह दर्शाता है कि हमारे छोटे पैमाने psd भिन्नीकरण विधि आनुवंशिक, औषधीय, या यांत्रिक उपचार के बाद एक भी चूहे से हिप्पोकैम्पस PSD प्रोटीन में परिवर्तन का पता लगाने के लिए लागू किया जा सकता .

Introduction

Electroconvulsive चिकित्सा गंभीर दवा प्रतिरोधी अवसाद, द्विध्रुवी अवसाद, पार्किंसंस रोग, और एक प्रकार का पागलपन1,2सहित प्रमुख अवसादग्रस्तता विकारों के साथ रोगियों का इलाज करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । इस चिकित्सा में, जब्ती विद्युत उत्तेजना epicranial इलेक्ट्रोड के माध्यम से anesthetized रोगियों के सिर को दिया द्वारा उत्पन्न होता है1,2,3. ईसीएस के दोहराव प्रशासन चिकित्सकीय दवा प्रतिरोधी अवसादग्रस्तता विकारों के लिए फायदेमंद रहा है1,2,3। हालांकि, मानव में एंटी इफेक्ट की दीर्घकालिक प्रभावकारिता अंतर्निहित सटीक तंत्र मायावी बनी हुई है । ईसीएस electroconvulsive थेरेपी का एक पशु मॉडल है और इसकी चिकित्सीय व्यवस्था की जांच के लिए व्यापक रूप से प्रयोग किया जाता है । कुतर में, दोनों तीव्र ईसीएस और जीर्ण ईसीएस उपचार hippocampi में वयस्क neurogenesis को बढ़ावा देने और तंत्रिका नेटवर्क को पुनर्गठित4,5, जो संज्ञानात्मक लचीलेपन में सुधार करने के लिए योगदान करने की संभावना है । इसके अलावा, ईसीएस द्वारा मस्तिष्क गतिविधि के वैश्विक उन्नयन इस तरह के एक मस्तिष्क व्युत्पंन neurotropic कारक के रूप में टेप की बहुतायत बदल जाता है6, और metabotropic ग्लूटामेट रिसेप्टर 17 और एन मिथाइल-डी-aspartate सहित कई प्रोटीन, (एनएमडीए) प्रकार ग्लूटामेट रिसेप्टर7यूनिटों । इन परिवर्तनों को हिप्पोकैंपस में synapse संख्या, संरचना, और शक्ति की लंबी अवधि के संशोधन मध्यस्थता में शामिल कर रहे हैं7,8,9।

ईसीएस मॉडल में, बिजली की उत्तेजना stereotaxically प्रत्यारोपित इलेक्ट्रोड, corneal इलेक्ट्रोड, या कान इलेक्ट्रोड के माध्यम से कुतर दिया है सामान्यीकृत टॉनिक-क्लोनल बरामदगी10,11पैदा करने के लिए । इलेक्ट्रोड के Stereotaxic आरोपण मस्तिष्क शल्य चिकित्सा शामिल है और चोट को कम करने के लिए प्रयोगकर्ता शल्य चिकित्सा कौशल में सुधार करने के लिए महत्वपूर्ण समय की आवश्यकता है । कम इनवेसिव corneal इलेक्ट्रोड corneal घर्षण और सूखापन पैदा कर सकता है और संज्ञाहरण की आवश्यकता होती है । कान क्लिप इलेक्ट्रोड का उपयोग इन सीमाओं को दरकिनार क्योंकि वे सर्जरी या संज्ञाहरण के बिना कुतर पर इस्तेमाल किया जा सकता है और न्यूनतम चोट का कारण । दरअसल, हमने पाया है कि वर्तमान कान क्लिप इलेक्ट्रोड के माध्यम से जाग चूहों को दिया मज़बूती से स्टेज 4-5 टॉनिक-क्लोनिंग बरामदगी और उनके hippocampi10में synaptic प्रोटीन बदल जाता है ।

synaptic प्रोटीन के विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों में ईसीएस प्रेरित बहुतायत की जांच करने के लिए, यह महत्वपूर्ण है प्रयोगात्मक तरीकों कि उनके पता लगाने और ठहराव के लिए सबसे उपयुक्त है का चयन करने के लिए । मस्तिष्क की सेल् फी घुलनशील cytosolic प्रोटीन के क्रूड अलगाव के लिए अनुमति देता है; झिल्ली प्रोटीन; organelle-सीमा प्रोटीन; और भी विशेष उपसेलुलर संरचनाओं में प्रोटीन, जैसे PSD12,13,14। PSD एक घने और अच्छी तरह का आयोजन किया है, जिसमें synaptic प्रोटीन अत्यधिक और postsynaptic झिल्ली के पास पर केंद्रित कर रहे है ंयूरॉंस में सेलुलर डोमेन12,13,15। psd के अलगाव synaptic प्रोटीन के अध्ययन के लिए उपयोगी psd पर समृद्ध है, बहुतायत और postsynaptic ग्लूटामेट रिसेप्टर्स, मचान प्रोटीन के समारोह में गतिशील परिवर्तन के बाद से, और संकेत transduction प्रोटीन में12 psd , 15 , 16 , 17 synaptic प्लास्टिक और synaptopathy कई स्नायविक विकारों17,18में मनाया के साथ संबंधित हैं । एक पिछले उपसेलुलर अंश विधि सुक्रोज ढाल14के अंतर केंद्रापसारक द्वारा मस्तिष्क के कच्चे झिल्ली अंश से डिटर्जेंट-अघुलनशील अंश के अलगाव शामिल PSD को शुद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया, 19. इस पारंपरिक विधि के साथ प्रमुख चुनौती यह है कि इसे कुतर दिमाग की बड़ी मात्रा14,19की आवश्यकता है । 10-20 कुतर के उपचार प्रति PSD अंश को अलग करने की तैयारी व्यापक लागत और समय निवेश की आवश्यकता है और व्यावहारिक रूप से संभव नहीं है अगर वहां कई उपचार कर रहे हैं ।

इस चुनौती को दूर करने के लिए, हम एक सरल तरीका है कि सीधे psd अंश को अलग अनुकूलित किया है, सुक्रोज ढाल केंद्रापसारक20,21के बिना, और यह संशोधित करने के लिए एक ही चूहे की hippocampi से psd अलगाव लागू हो मस्तिष्क. हमारे छोटे पैमाने psd अंश विधि 2 hippocampi से psd प्रोटीन के 30-50 µ जी के बारे में पैदावार, कई जैव रासायनिक परख में उपयोग के लिए पर्याप्त immunoprecipitation और पश्चिमी सोख्ता सहित, । पश्चिमी सोख्ता postsynaptic घनत्व प्रोटीन ९५ (psd-९५) और presynaptic मार्कर synaptophysin और घुलनशील cytoplasmic प्रोटीन α-tubulin के बहिष्कार के संवर्धन खुलासा द्वारा PSD अलग करने के लिए हमारी विधि की सफलता दर्शाता है । हमारे ईसीएस प्रेरण और छोटे पैमाने psd भिन्नीकरण तरीकों आसानी से अन्य कुतर मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए अनुकूलनीय हैं और PSD प्रोटीन की अभिव्यक्ति पर ईसीएस के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक अपेक्षाकृत सरल और विश्वसनीय तरीका प्रदान करते हैं ।

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Protocol

पशु विषयों सहित सभी प्रायोगिक प्रक्रियाओं Urbana-Champaign पर इलिनोइस विश्वविद्यालय में संस्थागत जानवरों की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. एक चूहा कॉलोनी बनाए रखने

  1. नस्ल Sprague-Dawley चूहों ( सामग्री की तालिकादेखें) और एक 12-एच प्रकाश अंधेरे चक्र और भोजन और पानी के लिए विज्ञापन libitum का उपयोग के साथ मानक स्थितियों में उन्हें बनाए रखने.
  2. प्रसव दिवस (पी) 28 और उंहें 2-4 पुरुष या महिला littermates के समूहों में सभा में चूहा पिल्ले ।
  3. पहचान के लिए एक गैर विषैले स्थाई काले मार्कर के साथ पुरुष चूहों की पूंछ मार्क ।
  4. पुरुष चूहों प्रति सप्ताह 3 बार तौलना और उनके bodyweights रिकॉर्ड ।

2. एक ईसीएस मशीन की तैयारी

  1. पर 7:30 हूं, पशु तैयारी कक्ष में बेंच को संक्रमित और बेंच पर एक ईसीएस मशीन (पल्स जनरेटर) जगह है ।
  2. एक ढक्कन के साथ एक साफ, खाली पिंजरे में एक व्यक्ति पुरुष २००-२५० जी वजनी चूहा रखें । सभी पुरुष चूहों के लिए इस दोहराएं ईसीएस प्रेरण के साथ इलाज किया जाएगा । 30 मिनट के लिए चूहों को habituate दें ।
  3. जबकि चूहों उनके पिंजरों में habituating हैं, १०० दालों की आवृत्ति के लिए ईसीएस प्रेरण के लिए एक पल्स जनरेटर सेट/s, ०.५ ms, ०.५ s की एक सदमे की अवधि की एक पल्स चौड़ाई, और ५५ mA के वर्तमान (चित्रा 1).
  4. "रीसेट" बटन धक्का और सुनिश्चित करना है कि "तैयार" बटन जलाया जाता है द्वारा पल्स जनरेटर तैयार । सुनिश्चित करें कि कान क्लिप एक पल्स जनरेटर से जुड़े नहीं हैं और फिर कुछ सेकंड के लिए "सदमे" बटन दबाएँ.
    नोट: इस बिंदु पर, पल्स जनरेटर ईसीएस प्रेरण के लिए तैयार है ।
  5. पल्स जनरेटर में कान क्लिप प्लग ।

3. तीव्र ईसीएस की प्रेरण

नोट: चित्रा 1बी, शीर्ष पैनल देखें.

  1. गीला बाँझ खारा के साथ कान क्लिप और सुनिश्चित करें कि वे संतृप्त हैं ।
  2. एक चूहे के कानों को खारा-भिगोई हुई धुंध में लपेटकर बाँझ खारा के साथ गीले कर दें । एक बार जब वे भीग रहे हैं, धुंध हटा दें ।
  3. कान के प्रति एक क्लिप, मुख्य उपास्थि बैंड से परे की स्थिति देते हैं ।
  4. ईसीएस मशीन है कि एक सच्चे पाश की स्थापना की है पर पुष्टि करें; यदि नहीं, तो एक त्रुटि संदेश या "1" का पठन मशीन पर दिखाई देगा ।
  5. एक मोटी, गैर धातु दस्ताने पहनते हैं । जबकि एक दस्ताने हाथ में धीरे चूहे पकड़े हुए, कुछ सेकंड के लिए "सदमे" बटन दबाएं और धीरे चूहे पर पकड़ रिहाई के लिए जब्ती का निरीक्षण । अन्तर्वासना के लिए "कोई जब्ती" (एनएस) नियंत्रण, चूहे को हूबहू संभालना लेकिन करंट न पहुंचाना ।
  6. कान क्लिप डिस्कनेक्ट के रूप में clonus शुरू होता है और एक संशोधित रेसिन के पैमाने पर22 के अनुसार जब्ती व्यवहार रिकॉर्ड है कि "मुंह और चेहरे आंदोलनों" (चरण 1), "शामिल सिर हिलाना" (चरण 2), "forelimb clonus" (चरण 3), "forelimb clonus के साथ पालन" (चरण 4), और "पालन और forelimb clonus के साथ गिरने" (चरण 5) । जब्ती लगभग 10 एस पिछले चाहिए; जब्ती अवधि एक टाइमर का उपयोग कर रिकॉर्ड ।
  7. जब्ती समाप्ति के बाद, अपने घर पिंजरे में चूहे वापस । एक और 5 मिनट के लिए चूहे की जब्ती से चूहे की वसूली की सुनिश्चित बनाने के लिए निगरानी । इसे रखें गाते हुए पिंजरे में रखे और वापस वसूली के कमरे में पिंजरे में ।
  8. अगले चूहे पर ईसीएस प्रेरण दोहराएं ।
  9. दिन के शेष भर में चूहों पर नजर रखने और सुबह में एक बार और दोपहर अगले दिन में एक बार जब तक वे प्रयोगों के लिए euthanized हैं.
    नोट: ईसीएस प्रेरण विधि एक घटनात्मक पक्ष प्रभाव है, जो ध्यान देने की आवश्यकता के रूप में नैदानिक संकेत करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, ईसीएस प्रेरण प्रोटोकॉल बरामदगी कि 15 से अधिक पिछले एस और चूहों को अनावश्यक संकट के कारण पैदा कर सकता है । इस मामले में, डायजेपाम (10 मिलीग्राम/kg, आईएफसआई) या pentobarbital (25-30 मिलीग्राम/kg, आईएफसआई) का उपयोग कर जब्ती समाप्त । यदि चूहों श्वसन संकट या गंभीर व्यवहार असामान्यताओं जब्ती समाप्ति के बाद विकसित, कार्बन डाइऑक्साइड decapitation द्वारा पीछा साँस लेना द्वारा उन्हें euthanize.

4. क्रोनिक ईसीएस की प्रेरण

नोट: चित्रा 1बी, नीचे पैनल देखें.

  1. सुबह में एक ही समय में एक ईसीएस प्रति दिन प्रेरित के रूप में 1-3 चरणों में वर्णित है, ऊपर, लगातार सात दिनों के लिए ।
  2. चूहों को एक दिन में दो बार मॉनिटर करने के बाद वे अपने घर पिंजरों को लौट रहे हैं ।

5. चूहा Hippocampi का Homogenization और अंश

नोट: चित्र 2देखें ।

  1. एक ताजा homogenization बफर (समाधान एक) है कि ३२० मिमी सुक्रोज, 5 मिमी सोडियम pyrophosphate, 1 मिमी EDTA, 10 मिमी HEPES पीएच ७.४, २०० एनएम okadaic एसिड, और चिढ़ाने अवरोधों शामिल तैयार करते हैं । फिल्टर-वैक्यूम छानने का स्थान के लिए एक ०.२२ µm ताकना आकार के साथ फिल्टर का उपयोग बफर और बर्फ पर जगह है ।
  2. एक निश्चित समय एक्यूट ईसीएस या पुरानी ईसीएस (चित्रा 1) के बाद बिंदु पर, सह द्वारा euthanize चूहा2 साँस लेना 5-10 मिनट के लिए, एक गिलोटिन का उपयोग decapitation द्वारा पीछा किया.
  3. मस्तिष्क निकालें और बर्फ पर रखा धातु प्लेट पर hippocampi टुकड़े, जैसा कि पहले23,24वर्णित है ।
  4. एक 30 मिमी ऊतक संस्कृति पकवान पर एक चूहे से दो hippocampi प्लेस और उंहें कैंची का उपयोग कर छोटे टुकड़ों में कीमा ।
  5. कीमा बनाया हुआ hippocampi एक मैनुअल गिलास homogenizer एक 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करने के लिए स्थानांतरण और 1 मिलीलीटर बर्फ शीत homogenization बफर (समाधान ए, चरण ५.१) जोड़ें । एक गिलास homogenizer में एक गोल मूसल डालें । जबकि गिलास homogenizer बर्फ पर है, धीरे और लगातार स्ट्रोक ऊपर और नीचे 1 मिनट के लिए मूसल 10-15 बार पर, जब तक हिप्पोकैम्पस ऊतक के छोटे टुकड़े गायब हो जाते हैं ।
  6. एक १.७ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब एक 1-एमएल पिपेट का उपयोग करने के लिए homogenate हस्तांतरण और ८०० एक्स जी पर 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर homogenate केंद्रापसारक ऊतक और postnuclear (P1 अंश) युक्त गोली से supernatant नाभिक (एस 1 अंश) अलग करने के लिए । स्थानांतरण ५० µ एल और ९५० µ एल एस 2 अलग करने के लिए, नई १.७ मिलीलीटर microcentrifuge एक 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर ट्यूबों और बर्फ पर इन ट्यूबों की दुकान । बर्फ पर P1 अंश गोली बचाओ ।
  7. १३,८०० x g और 4 डिग्री सेल्सियस से कम 10 मिनट के लिए एस 1 अंश (९५० µ एल) supernatant (S2 के अंश) अलग, cytosolic घुलनशील प्रोटीन से समृद्ध है, और गोली (P2 अंश), झिल्ली से समृद्ध, प्रोटीन synaptosomal सहित प्रोटीन, बाध्य । एक नया १.७ मिलीलीटर एक 1-एमएल पिपेट का उपयोग कर microcentrifuge और बर्फ पर स्टोर करने के लिए S2 के अंश हस्तांतरण ।
  8. एक 1-एमएल पिपेट का उपयोग बर्फ ठंडा शुद्ध पानी की ४९८ µ एल में गोली (P2 अंश) reसस्पेंड । 4 मिमी HEPES (ph ७.४) की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 20 µ l पिपेट का उपयोग करके 1 M HEPES (ph ७.४) का 2 µ l जोड़ें । 30 मिनट के लिए आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर मशीन बर्फ पर reसस्पैंड P2 अंश की दुकान ।
  9. एक बीसीए परख का उपयोग कर एस एक, S2, और P2 अंश के प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण । जोड़ें ५० mM HEPES (पीएच ७.४) प्रत्येक अंश को प्राप्त करने के लिए एक 1 मिलीग्राम/एमएल एकाग्रता और स्टोर पर-८० ° c का उपयोग करें, या P2 अलग करने के लिए PSD भिंन प्रक्रिया ।

6. कच्चे झिल्ली प्रोटीन (P2) अंश से PSD का अलगाव

  1. लीजड supernatant (LS2 अंश) और लीजड गोली (LP1 अंश) को अलग करने के लिए २५,००० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए P2 अंश (५०० µ l) को केंद्रापसारक करें । एक नया १.७ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब एक 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर और यह बर्फ पर स्टोर करने के लिए LS2 अंश स्थानांतरण ।
  2. ५० mM HEPES के २५० µ एल में LP1 गोली reसस्पेंड (पीएच ७.४) 1x पंजाब में 1% डिटर्जेंट के २५० µ एल के साथ मिश्रित एक 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग कर बफर । 15 मिनट के लिए कोमल आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
  3. २५,००० x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 ज के लिए reसस्पैंड LP1 गोली के लिए supernatant (गैर-गोली से psd अंश) अलग (psd अंश) । एक १.७-एमएल microcentrifuge ट्यूब करने के लिए supernatant निकालें और ५० mM HEPES (पीएच ७.४) के १०० µ एल में PSD गोली एक २०० µ एल पिपेट का उपयोग कर reसस्पैंड ।
  4. LS2 के प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण, गैर psd, और psd अंश एक बीसीए परख का उपयोग कर । जोड़ें ५० mM HEPES (पीएच ७.४) प्रत्येक अंश को प्राप्त करने के लिए एक 1 मिलीग्राम/एमएल एकाग्रता और स्टोर पर-८० ° c उपयोग तक ।
    नोट: सभी समाधान 5-6 कदम( यानी, समाधान एक, HEPES बफर, और पंजाबियों बफर में इस्तेमाल किया जाना चाहिए शुद्ध पानी ईओण और कार्बनिक पदार्थों और कणों से मुक्त के साथ किया जाना चाहिए ।

7. वेस्टर्न सोख्ता

  1. बर्फ पर प्रत्येक प्रोटीन अंश गल. हस्तांतरण के 12 µ l प्रत्येक अंश (S2, P2, और PSD में 1 मिलीग्राम/एमएल) के लिए एक नया १.७ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब का उपयोग कर एक 20-µ l पिपेट.
  2. 5x एसडीएस नमूना बफर के 3 µ एल जोड़ें और एक पानी स्नान में 30 मिनट के लिए ७५ ° c पर मशीन । कमरे के तापमान (आरटी) के लिए नीचे नमूने शांत ।
  3. 4-20% के प्रत्येक कुआं में प्रोटीन नमूने के 10 µ एल लोड ढाल 15-खैर कंघी एसडीएस-polyacrylamide जेल ट्रो (एसडीएस-PAGE) जेल एक का उपयोग कर 20 µ l पिपेट. एसडीएस-पृष्ठ उपकरण में और 80-100 V पर चल रहे बफ़र (25 mm Tris, १९० mm glycine, और ०.१% एसडीएस; pH ८.३) में जेल चलाएं ।
    नोट: प्रत्येक जेल तीव्र या जीर्ण ईसीएस के बाद विभिन्न समय अंक में एनएस चूहों और ईसीएस चूहों से प्रोटीन के नमूनों को शामिल करना चाहिए.
  4. स्थानांतरण बफ़र में 9-12 h (25 mm Tris, १९० mm glycine, और 20% मेथनॉल; pH ८.३) के लिए 25-30 V (६० mA) पर स्थानांतरण उपकरण में एसडीएस-पृष्ठ जेल से एक polyvinyl difluoride (PVDF) झिल्ली के लिए प्रोटीन स्थानांतरित करें ।
  5. स्थानांतरण उपकरण से PVDF झिल्ली निकालें और RT पर एक बहुउद्देश्यीय रोटेटर पर 5 मिनट के लिए Tris-बफ़र्ड खारा (टीबीएस) में इसे धो लें ।
  6. 5% दूध में झिल्ली ब्लॉक और ०.१% के बीच-20 टीबीएस में 1 एच के लिए । यह प्राथमिक एंटीबॉडी में मशीन (तालिका 1) (1% दूध धोने बफर में और ०.१% के बीच-20 टीबीएस में) रातोंरात एक बहुउद्देश्यीय रोटेटर पर 4 डिग्री सेल्सियस (कमजोर पड़ने के लिए सामग्री की तालिका देखें) ।
  7. धोने बफर में 10 मिनट प्रत्येक के लिए 4 बार झिल्ली धो और फिर सहिजन peroxidase (एचआरपी) के साथ यह मशीन-1 ज के लिए वाशिंग बफर में संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी आरटी पर एक बहुउद्देश्यीय रोटेटर पर ।
  8. धो झिल्ली धो बफर में 10 मिनट प्रत्येक के लिए 4 बार और फिर टीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए ।
  9. 1 मिनट के लिए बढ़ाया chemifluorescence सब्सट्रेट के साथ झिल्ली गर्मी और यह एक्स-रे फिल्म के लिए बेनकाब । एक फिल्म प्रोसेसर के साथ उजागर फिल्म का विकास ।

8. पश्चिमी दाग के ठहराव

  1. पश्चिमी दाग को एक TIFF फ़ाइल के रूप में स्कैन करें और इस फ़ाइल को कंप्यूटर पर सहेजें ।
  2. ImageJ प्रोग्राम में पश्चिमी ब्लाटर फ़ाइल को ग्रेस्केल छवि के रूप में खोलें, "फ़ाइल," "खुली छवि," दायां तीर "धूसर स्केल" के अंतर्गत ।
  3. ImageJ टूलबार से आयताकार चयन उपकरण चुनें और एक आयत है कि ब्याज की एक प्रोटीन की एक एकल पश्चिमी दाग बैंड को शामिल किया गया ड्रा ।
  4. के तहत "विश्लेषण," हिट "माप" क्षेत्र और एक चयनित बैंड का मतलब घनत्व प्राप्त करने के लिए ।
  5. आयत को उसके आकार और आकृति को बदले बिना किसी पृष्ठभूमि क्षेत्र में ले जाएं । क्षेत्र और एक पृष्ठभूमि का मतलब घनत्व के लिए ८.४ कदम दोहराएं ।
  6. एक पश्चिमी दाग बैंड की है कि से एक पृष्ठभूमि बैंड का मतलब घनत्व मूल्य घटाना, पृष्ठभूमि-ब्याज के प्रोटीन के घटाया बैंड घनत्व दे रही है ।
  7. ब्याज की सभी पश्चिमी दाग बैंड के लिए ८.२-८.६ चरणों को दोहराएँ ।
  8. इस तरह α-Tubulin के रूप में एक गृह व्यवस्था जीन उत्पाद की पृष्ठभूमि-घटाई बैंड घनत्व के द्वारा ब्याज के प्रोटीन के बैकग्राउंड-घटाई बैंड घनत्व विभाजित; यह कदम ब्याज की प्रोटीन की सामान्यीकृत मूल्य पैदावार ।

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Representative Results

विस्तृत प्रक्रिया का प्रयोग यहां प्रस्तुत, एक बिजली के झटके (५५ mA, १०० पल्स एस ०.५ s के लिए/कान के माध्यम से दिया क्लिप इलेक्ट्रोड-चूहों में आवर्ती चरण 4-5 टॉनिक-क्लोनल बरामदगी प्रेरित (चित्रा 1A-B) । चूहों की कुल 8 तीव्र ईसीएस प्रेरण प्राप्त किया और प्रदर्शित चरण 4-5 टॉनिक-क्लोनल बरामदगी । बरामदगी के बारे में पिछले 10 एस, और सभी चूहों जब्ती समाप्ति के 1-2 मिनट के भीतर बरामद किया । अन्तर्वासना "कोई बरामदगी" चूहों एक बिजली के झटके प्राप्त नहीं किया और इसलिए बरामदगी प्रदर्शित नहीं किया । कुल 4 अन्तर्वासना चूहों का इस्तेमाल किया गया । पुरानी ईसीएस प्रेरण के लिए, चूहों के लिए प्रति दिन एक बिजली के झटके प्राप्त 7 लगातार दिनों और स्टेज 4-5 टॉनिक-प्रत्येक बिजली के झटके पर क्लोनी बरामदगी (चित्रा 1बी) । चूहों की कुल 8 पुरानी ईसीएस प्रेरण और 4 अन्तर्वासना चूहों की कुल प्राप्त "कोई बरामदगी" चूहों के रूप में इस्तेमाल किया गया. हालांकि अधिकांश चूहों कि पुरानी ईसीएस प्राप्त "नहीं जब्ती" चूहों, कुछ विकसित शरीर के झटके और 7वें बिजली के झटके से कम खोजपूर्ण गतिविधि से व्यवहार से अलग थे ।

यदि ईसीएस-प्रेरित गतिविधि के वैश्विक उंनयन hippocampi में प्रोटीन अभिव्यक्ति बदल, चूहों 3 एच और 24 एच में तीव्र ईसीएस के बाद और 24 एच और ९६ एच में अंतिम ईसीएस उपचार (चित्रा 1बी) के बाद पर बलिदान किया गया की जांच करें । प्रत्येक चूहे से दो hippocampi तेजी से विच्छेदित और हमारे अनुकूलित छोटे पैमाने पर भिन्नीकरण प्रोटोकॉल (चित्रा 2) के अधीन थे. अघुलनशील ऊतक और नाभिक (एस सी अंश) से मुक्त दो hippocampi के प्रारंभिक homogenate 10 मिनट के लिए १३,८०० x g पर फिर से शुरू किया गया था जिसमें घुलनशील cytoplasmic प्रोटीन (S2 अंश) से युक्त कच्चे झिल्ली की गोली से supernatant अलग करने के लिए synaptosomes (P2 अंश) (चित्र 2) । हमारे पश्चिमी दाग S2 के अंशों में cytoplasmic प्रोटीन α-tubulin का पता चला, लेकिन नहीं P2 अंश, तीव्र और जीर्ण ईसीएस के साथ इलाज चूहों से hippocampi की (चित्रा 3 और चित्रा 4), के सफल अंश का प्रदर्शन cytosolic क्रूड झिल्ली छर्रों से घुलनशील प्रोटीन ।

PSD95 झिल्ली के एक सदस्य-जुड़े ग्वानिलेट कळेनासे (MAGUK) परिवार और PSD के एक प्रमुख घटक है12,18,25। PSD95 और एनएमडीए रिसेप्टर उपइकाई GluN2B P2 अंशों में विशेष रूप से पता लगाया गया है, लेकिन नहीं S2 के अंशों (चित्रा 3 और चित्रा 4). एक और glutamatergic α की मजबूत अभिव्यक्ति-एमिनो-3-hydroxy-5-मिथाइल-4-isoxazolepropionic एसिड (AMPA) रिसेप्टर उपइकाई GluA2 P2 अंशों में hippocampi में S2 के अंशों की तुलना में पता चला था (चित्रा 3 और चित्रा 4), यह दर्शाता है कि postsynaptic झिल्ली प्रोटीन कच्चे झिल्ली P2 अंश छर्रों में समृद्ध कर रहे हैं । दिलचस्प है, synaptic पुटिका प्रोटीन synaptophysin और अभिंन झिल्ली प्रोटीन Striatal समृद्ध Tyrosine फॉस्फेट ६१ (चरण६१)26 S2 और P2 भागों (चित्रा 3 और चित्रा 4) में समान रूप से पता लगाया गया । synaptic बुलबुले के छोटे आकार को ध्यान में रखते-३९ एनएम27 और endosomes के एक औसत व्यास के साथ, केंद्रापसारक कच्चे झिल्ली गोली (P2 अंश) को अलग करने के लिए सभी synaptic बुलबुले और endosomes गोली पर्याप्त नहीं हो सकता है । इन परिणामों को एक साथ संकेत मिलता है कि हमारे कच्चे अंश प्रोटोकॉल झिल्ली बंधे प्रोटीन और transmembrane प्रोटीन है कि synaptic बुलबुले के साथ जुड़े नहीं है और संभवतः कच्चे तेल की झिल्ली में endosomes साथ P2 अंश को समृद्ध कर सकते हैं ।

अगर ईसीएस प्रेरित गतिविधि के वैश्विक उंनयन hippocampi में postsynaptic प्रोटीन की अभिव्यक्ति बदल, कच्चे झिल्ली P2 अंश बर्फ में लीजड-ठंडा पानी था, HEPES बफर में reसस्पैंड, और 20 मिनट के लिए २५,००० x g पर केंद्रापसारक को अलग करने के लिए । लीजड गोली (LP1) (चित्रा 2) । LP1 गोली HEPES 1% ट्राइटन x-१०० डिटर्जेंट युक्त बफर में reसस्पैंड और 3 ज पर २५,००० x g पर केंद्रापसारक को PSD गोली (चित्रा 2) प्राप्त था । PSD भागों के बाद पश्चिमी दाग PSD95, GluN2B, और GluA2 (चित्रा 3 और चित्रा 4), जो postsynaptic प्रोटीन17,25,28जाना जाता है पता चला । हालांकि, PSD अंश α-tubulin कमी आई है और, महत्वपूर्ण बात, presynaptic मार्कर synaptophysin (चित्रा 3 और चित्रा 4) । चरण६१, जो dephosphorylates GluN2B और GluA2 और उनके नकारात्मक नियामक के रूप में कार्य करता है29,30,31, PSD भागों में नहीं मिला (आंकड़ा 3 और चित्रा 4), हाल ही में कदम६१के synaptic अपवर्जन का प्रदर्शन रिपोर्ट के अनुरूप, PSD95 द्वारा मध्यस्थता26PSD में समृद्ध । कुल मिलाकर, इन परिणामों से संकेत मिलता है कि हमारे छोटे पैमाने पर अंश विधि सफलतापूर्वक कच्चे झिल्ली P2 अंश से PSD प्रोटीन को अलग ।

पश्चिमी सोख्ता के ठहराव से पता चला है कि GluN2B अभिव्यक्ति P2 अंश में अनछुए था, लेकिन 3 एच में PSD अंश में एक बढ़ती हुई प्रवृत्ति और 24 एच तीव्र ईसीएस के बाद (n = 4) (चित्रा 3बी) प्रदर्शित किया । GluA2 अभिव्यक्ति पर P2 और PSD भिंन दोनों में नहीं बदला गया था 3 ज और 24 एच एक्यूट ईसीएस के बाद (चित्रा 3सी) । क्रोनिक ईसीएस के बाद 24 ज और ९६ ज पर, GluN2B व्यंजक ने P2 अंश में घटते रुझान को प्रदर्शित किया और PSD अंश में काफी कम कर दिया गया (24 h: p < 0.05, n = 4; ४८ h: p < 0.01, n = 4) (आरेख 4B) । इसके विपरीत, पुरानी ईसीएस P2 और PSD भिंन (n = 4) (चित्रा 4सी) में GluA2 अभिव्यक्ति को प्रभावित नहीं किया ।

Figure 1
चित्र 1 : तीव्र ईसीएस और क्रोनिक ईसीएस की प्रेरण के लिए स्कीमा. (क) एक चूहा कान क्लिप इलेक्ट्रोड और एक बिजली के झटके के माध्यम से एक पल्स जनरेटर से जुड़ा था (५५ mA, ०.५ s के लिए १०० पल्सेस/) मंच पर 4-5 टॉनिक-क्लोनिंग बरामदगी के लिए आवेदन किया गया था । (ख) एक्यूट ईसीएस एक बिजली के झटके से प्रेरित किया गया था । जीर्ण ईसीएस लगातार 7 दिनों के लिए प्रति दिन एक बिजली के झटके से मिलाया गया था । दिखाया गया समय hippocampi के विच्छेदन से पहले तीव्र ईसीएस या पुरानी ईसीएस प्रेरण के लिए अंतिम ईसीएस की प्रेरण के बाद की अवधि का प्रतिनिधित्व करते हैं । अन्तर्वासना "कोई जब्ती" (एनएस) नियंत्रण वाले चूहों को हूबहू संभाला गया लेकिन एक बिजली के झटके नहीं मिले । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : एक एकल चूहे के Hippocampi से S2, P2, और PSD भागों को अलग करने के लिए उपसेलुलर भिन्नीकरण का कार्यप्रवाह. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: हिप्पोकैम्पस S2, P2 में Synaptic प्रोटीन की परीक्षा, और चूहों कि एनएस या तीव्र ईसीएस प्राप्त से PSD भिन्न. (A) प्रतिनिधि पश्चिमी दाग एनएमडीए रिसेप्टर उपइकाई GluN2B, AMPA रिसेप्टर GluA2 के प्रोटीन अभिव्यक्ति दिखाने के लिए, और S2, P2 में कदम६१ , और अन्तर्वासना के hippocampi से भिन्नों PSD "कोई जब्ती" (एन एस) चूहों और चूहों कि तीव्र ईसीएस प्राप्त किया. cytoplasmic घुलनशील प्रोटीन α-tubulin S2 के अंश में समृद्ध है । Synaptophysin एक presynaptic पुटिका प्रोटीन है और कच्चे झिल्ली P2 अंश में समृद्ध है, लेकिन PSD अंश में नहीं है । psd-९५ दोनों P2 और PSD भागों में समृद्ध है । (ख-ग) ठहराव के GluN2B (ख) और GluA2 (सी) में P2 और PSD भागों में 3 और 24 एच एक्यूट ईसीएस के बाद (n = 4 चूहों के समय बिंदु) । P2 अंश में GluN2B और GluA2 व्यंजक को α-Tubulin में S2 अंश में सामान्यीकृत किया गया. psd अंश में GluN2B और GluA2 अभिव्यक्ति psd में ९५-psd अंश सामान्यीकृत था । डेटा प्रतिशत ± SEM के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: हिप्पोकैम्पस S2, P2 में Synaptic प्रोटीन की परीक्षा, और चूहों कि एनएस या पुरानी ईसीएस प्राप्त से PSD भिन्न. α के प्रतिनिधि पश्चिमी दाग-tubulin; synaptophysin; चरण६१; और PSD95, GluN2B सहित postsynaptic प्रोटीन, और GluA2, S2, P2 में, और शम "कोई जब्ती" (एन एस) चूहों और चूहों कि क्रोनिक ईसीएस प्राप्त की hippocampi से PSD अंश । cytoplasmic घुलनशील प्रोटीन α-tubulin S2 के अंश में समृद्ध है । Synaptophysin एक presynaptic पुटिका प्रोटीन है और कच्चे झिल्ली P2 अंश में समृद्ध है, लेकिन PSD अंश में नहीं है । psd-९५ दोनों P2 और PSD भागों में समृद्ध है । (B-C) ठहराव के GluN2B (ख) और GluA2 (सी) में P2 और PSD भागों में 24 और ९६ एच जीर्ण ईसीएस के बाद (n = 4 चूहों के प्रति समय बिंदु). P2 अंश में GluN2B और GluA2 व्यंजक को α-Tubulin में S2 के अंश में सामान्यीकृत किया गया. psd अंश में GluN2B और GluA2 अभिव्यक्ति psd में ९५-psd अंश सामान्यीकृत था । डेटा प्रतिशत ± SEM के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं; * p < 0.05, * * p < 0.01 नियंत्रण (ANOVA and Tukey ' s पोस्ट-हॉक परीक्षण) की तुलना में । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अंश प्रोटीन अंश प्रोटीन मार्कर
p1 परमाणु Histon H1
s1 Cytosol/membrances क-tubulin (cytoskeleton) और GAPDH (cytosol)
p2 क्रूड synaptosomes AMPA और एनएमडीए रिसेप्टर उपइकाईयों
s2 Cytosol/हल् membrances GAPDH (cytosol) और LAMP1 (lysosome)
Synaptosomal झिल्ली Synaptosome/mitochondria AMPA और NMDAR रिसेप्टर उपइकाई, Synaptophysin (presynaptic मार्कर)
psd psd AMPA और एनएमडीए रिसेप्टर उपइकाईयों, PSD95, PICK1, CaMKII

तालिका 1: प्रोटीन मार्करों और एंटीबॉडी की सूची उपसेलुलर भागों भेद करने के लिए.

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Discussion

यहां, हम चूहों में एक ईसीएस प्रेरण पद्धति का वर्णन है कि उनके hippocampi में न्यूरॉन गतिविधि के वैश्विक उत्तेजना बटोरता है । ईसीएस electroconvulsive थेरेपी के एक पशु मॉडल है, जो नैदानिक मानव में दवा दुर्दम्य अवसादग्रस्तता विकारों के इलाज के लिए प्रयोग किया जाता है1,2,3। गंभीर अवसाद का इलाज करने के लिए electroconvulsive थेरेपी का उपयोग करने के बावजूद, सटीक अंतर्निहित तंत्र अस्पष्ट रहता है । क्योंकि ईसीएस विरोधी अवसादग्रस्तता-जैसे व्यवहार को कुतर में लाती है और हिप्पोकैम्पस neurogenesis4,३२, ईसीएस को जांच के लिए बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है यदि नए वयस्क जनित न्यूरॉन्स की dentate गाइरस में हिप्पोकैंपस विरोधी अवसादग्रस्तता व्यवहार करने के लिए योगदान5,३२।

ईसीएस stereotaxically प्रत्यारोपित इलेक्ट्रोड, corneal इलेक्ट्रोड, या कान क्लिप इलेक्ट्रोड३३,३४के माध्यम से वर्तमान डिलीवरी पर कुतर में गंभीर सामान्यीकृत टॉनिक-क्लोनी बरामदगी के लिए हल्के लाती है । रोगियों में ईईजी रिकॉर्डिंग से पता चला है कि द्विपक्षीय विद्युत उत्तेजना एकतरफा उत्तेजना से अधिक प्रमुख और अब सामान्यीकृत बरामदगी का कारण बनता है३५,३६। हमारे ईसीएस प्रेरण विधि में, टॉनिक-क्लोनी बरामदगी, दोनों कानों से जुड़ी इनवेसिव कान क्लिप इलेक्ट्रोड के माध्यम से वर्तमान प्रसव द्वारा प्रेरित कर रहे हैं, द्विपक्षीय उत्तेजना३६से पैदा हुई मनुष्यों में बरामदगी नकल उतार । हालांकि हम चूहों में ईसीएस की प्रभावकारिता की जांच नहीं की है जो बेहोश करने की बीमारी या संज्ञाहरण लागू किया जाता है, यह संभव है कि चूहों को संवेदनाहारी दवाओं देने विद्युत उत्तेजना, जो इस तथ्य के कारण हो सकता है द्वारा प्रेरित दौरे की डिग्री को कम कर सकता है कि संज्ञाहरण राज्य शारीरिक बढ़ाया निरोधात्मक और मस्तिष्क नेटवर्क में भीगा हुआ उत्तेजक टोन के साथ जुड़ा हुआ है । इसके अलावा, ईसीएस प्रेरण विधि में महत्वपूर्ण कदम के लिए प्रयोग करने के लिए वर्तमान तीव्रता डायल करने के लिए चरण 4-5 सामान्यीकृत टॉनिक-क्लोनल बरामदगी उंर, वजन, और कुतर की प्रजातियों पर आधारित है ।  हमारे ईसीएस प्रेरण विधि Dawley २००-२५० जी का वजन चूहों जाग पुरुष Sprague में कुछ सेकंड के भीतर स्टेज 4-5 बरामदगी उत्प्रेरण के लिए अनुकूलित किया गया है यदि संज्ञाहरण राज्य के तहत चूहों ईसीएस प्रेरण के लिए उपयोग किया जाता है, तीव्रता, अवधि, और वर्तमान देने की आवृत्ति 4 से 5 चरण से लेकर जब्ती की सफल प्रेरण के लिए संशोधित किया जाना चाहिए ।

ईसीएस भी न्यूरॉन्स में सक्रियता उत्तेजक का लाभ प्रदान करता है और बहुत कम मृत्यु दर३३के साथ तीव्र क्षणिक बरामदगी के कारण, chemoconvulsants के विपरीत, pilocarpine और kainite सहित, जो स्थिति एपिलेप्टिकस और कारण के लिए प्रेरित सहज आवर्तक बरामदगी और गंभीर ऊतकीय परिवर्तन के जीर्ण अभिव्यक्ति३७,३८। ईसीएस को नियमित रूप से स्क्रीन एंटी-मिरगी दवाओं का उपयोग किया गया है३३,३४, एक्यूट ईसीएस और क्रोनिक ईसीएस पुरानी मिर्गी की पीढ़ी में परिणाम नहीं है और इस प्रकार epileptogenesis अध्ययन करने के लिए एक पशु मॉडल में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता. इसके बजाय, ईसीएस व्यापक रूप से जो करने के लिए मस्तिष्क गतिविधि के व्यापक उन्नयन अभिव्यक्ति और/ vivo मेंsynaptic प्रोटीन के posttranslational संशोधनों, जो synaptic में लगातार परिवर्तन करने के लिए योगदान की जांच करने के लिए नियोजित किया गया है शक्ति और संरचनाओं (चित्रा 3 और चित्रा 4)10,४०। इस अध्ययन में, हम केवल पुरुष चूहों का इस्तेमाल किया ईसीएस के बाद PSD प्रोटीन की मात्रा पर मादा चूहों के मद चक्र चरण के अप्रत्याशित प्रभाव को बाहर । हालांकि, यह देखा गया था कि मचान प्रोटीन में कोई लिंग अंतर नहीं है, psd-९५ और SAP102 सहित ललाट प्रांतस्था और हिप्पोकैंपस३९के psd क्षेत्र में है, कि हार्मोनल परिवर्तन मद चक्र के संचालन का अर्थ है कि बेसल प्रभावित नहीं हो सकता है PSD प्रोटीन की मात्रा ।

कई तरीकों के लिए जो ईसीएस neurogenesis, synaptogenesis, और synaptic प्लास्टिक5,6,7,8,9में परिवर्तन लाती है की जांच करने के लिए नियोजित किया गया है, 11 , ४०. उत्तेजक postsynaptic वर्तमान (EPSC) के Electrophysiological रिकॉर्डिंग व्यापक रूप से synaptic glutamatergic उत्तेजक21की synapses ताकत में परिवर्तन का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है । उदाहरण के लिए, लघु EPSC रिकॉर्डिंग से पता चला है की समस्थिति downscaling में उत्तेजक synaptic शक्ति की परतें द्वितीय-III चूहों की तीव्र ईसीएस४१के बाद cortical. हालांकि, ईसीएस-प्रेरित synaptic प्लास्टिक में योगदान करने वाले synaptic प्रोटीन की पहचान चुनौतीपूर्ण है क्योंकि electrophysiological रिकॉर्डिंग को आनुवंशिक नॉकआउट या विशेष उंमीदवार synaptic प्रोटीन के नॉकआउट के साथ जोड़ा जाना चाहिए । postsynaptic झिल्ली और synaptic प्रोटीन में ग्लूटामेट रिसेप्टर्स के स्तर में परिवर्तन की शक्ति और उत्तेजक synaptic ट्रांसमिशन की प्रभावकारिता को विनियमित17,18,25. हालांकि immunohistochemistry synaptic प्रोटीन की अभिव्यक्ति में ईसीएस प्रेरित परिवर्तन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इस तकनीक के एक समय में केवल 1-2 उंमीदवार synaptic प्रोटीन की जांच कर सकते है और अच्छी तरह से पुष्टि एंटीबॉडी कि विशेष रूप से उंहें पहचान की आवश्यकता गैर विशिष्ट कारण के बिना धुंधला ।

पश्चिमी सोख्ता के साथ संयोजन में मस्तिष्क ऊतक के उपसेलुलर अंश synaptic प्रोटीन है कि ईसीएस द्वारा बदल रहे हैं की पहचान करने में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और immunohistochemistry से अधिक लाभ प्रदान करता है. मस्तिष्क ऊतक के उपसेलुलर अंश है एक तेजी से और कच्चे तेल के लिए जैव रासायनिक विधि अलग घुलनशील cytosolic प्रोटीन (S2 अंश) से क्रूड झिल्ली (P2 अंश), सहित एर और Golgi झिल्ली, झिल्ली बंधे organelles, प्लाज्मा झिल्ली, और synaptic टर्मिनल झिल्ली कि रिसील करने के लिए फार्म का synaptosomes४२,४३,४४। PSD अंश आगे P2 अंश से अलग किया जा सकता है synaptic प्रोटीन४२,४३,४४समृद्ध । psd अंश के निष्पक्ष proteomic विश्लेषण सभी psd प्रोटीन जिसका स्तर ईसीएस द्वारा बदल रहे है की पहचान सकता है । पश्चिमी सोख्ता तेजी से किया जा सकता है PSD प्रोटीन है, जो आसानी से गैर विशिष्ट बैंड से पहचाना जा सकता है की अभिव्यक्ति परिवर्तन की जांच ।

मस्तिष्क भिन्नता के पिछले विधि एक व्यक्ति से घुलनशील या झिल्ली प्रोटीन की जांच जब उपयोग के लिए चुनौतीपूर्ण इस तकनीक बनाने,४२,४३,४४कुतर मस्तिष्क ऊतक की एक बड़ी राशि की आवश्यकता है एक ही ब्रेन से मूषक मस्तिष्क या विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र । वहां एक बढ़ती मांग को मात्रात्मक एक मस्तिष्क क्षेत्र से दूसरे और एक नियंत्रण पशु से एक ट्रांसजेनिक पशु या एक जानवर है कि एक विशिष्ट उपचार आया है करने के लिए proteome तुलना करने के लिए है । इसलिए, हम संशोधित किया है और एक एकल चूहे के दो hippocampi से कच्चे तेल में घुलनशील और झिल्ली भिन्न अलग करने के लिए पारंपरिक मस्तिष्क भिन्नीकरण विधि अनुकूलित. हमारे छोटे पैमाने पर क्रूड अंश प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक cytosolic S2 घुलनशील अंशों से कच्चे p2 झिल्ली भिंन अलग, के रूप में cytoplasmic प्रोटीन की कमी से संकेत α-tubulin P2 अंशों में, जबकि झिल्ली बंधे PSD95 में पाया गया था P2 लेकिन नहीं S2 के अंश (चित्रा 3एक और आंकड़ा 4एक) । विधि का प्रयोग यहां वर्णित है, हम मात्रात्मक दिखाया है कि तीव्र ईसीएस काफी कदम६१ अभिव्यक्ति बढ़ जाती है और उसके सब्सट्रेट, GluN2B और extracellular संकेत के tyrosine फास्फारिलीकरण कम हो जाती है-विनियमित कळेनासे 1/2 क्रूड में झिल्ली ४८ एच में चूहे hippocampi के P2 अंश एक्यूट ईसीएस10निंनलिखित ।

अप्रत्याशित रूप से, S2 के अंशों निहित synaptophysin; चरण६१; और, एक बहुत कम हद तक, GluA2 (चित्रा 3एक और आंकड़ा 4एक) । चरण६१ एक ग्लाइकोसिलेटेड अभिंन झिल्ली प्रोटीन है26 endoplasmic जालिका (एर) और PSD४५के साथ जुड़े । यह संभव है कि केंद्रापसारक कच्चे झिल्ली गोली (P2 अंश) को अलग करने के लिए सभी synaptic synaptosomes युक्त बुलबुले गोली पर्याप्त नहीं हो सकता है, साथ ही साथ endosomes और lysosomes युक्त GluA2 और चरण६१। फिर भी, GluN2B के स्पष्ट संवर्धन, GluA2, और PSD95 और P2 अंशों में α-tubulin की कमी से संकेत मिलता है कि हमारे आंशिक प्रोटोकॉल झिल्ली से बंधे प्रोटीन और transmembrane प्रोटीन है कि synaptic बुलबुले के साथ जुड़े नहीं है समृद्ध कर सकते है और क्रूड झिल्ली P2 अंश में endosomes ।

हालांकि कच्चे झिल्ली p2 अंश synaptosomes शामिल हैं, synaptic प्रोटीन के P2 अंश में गतिविधि-निर्भर परिवर्तन की जांच की एक सीमा है कि उनके परिवर्तनों का सही स्थान निर्धारित नहीं किया जा सकता है । यदि synaptic प्रोटीन psd में समृद्ध करने के लिए निर्धारित किया जाना था, तो आगे जैव रासायनिक भिन्नीकरण psd को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । PSD अंश की पिछले विधि को कुतर मस्तिष्क ऊतक (यानी, 10-20 कुतर दिमाग) और सुक्रोजढाल४२, ४३, ४४ की एक बड़ी मात्रा की आवश्यकता है । क्योंकि इस पारंपरिक विधि एक चूहे के दो hippocampi से psd अंश की पर्याप्त मात्रा को अलग करने के लिए अपर्याप्त है, हम एक सरल तरीका है कि सीधे PSD अंश अलग, एक सुक्रोज ढाल के बिना अनुकूलित है20,21 . इस विधि PSD प्रोटीन के बारे में 30-50 µ जी पैदावार, कई जैव रासायनिक परख के लिए पर्याप्त, पश्चिमी सोख्ता सहित । हमारी विधि PSD95, GluN2B, और GluA2, जो psd अंश में केंद्रित किया जाना जाता है को समृद्ध करता है, और psd अंश में GluN2B अभिव्यक्ति में परिवर्तन का पता लगाता है पुरानी ईसीएस प्रेरण (चित्रा 3 और चित्रा 4) निंनलिखित ।

यहां, हमारे मात्रात्मक पश्चिमी दाग विश्लेषण GluA2 अभिव्यक्ति में P2 और PSD भिंन में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन में पता चला 3 और एच 24 एच एक्यूट ईसीएस (चित्रा 3के बादसी) । GluN2B अभिव्यक्ति P2 अंश में अनछुए लेकिन तीव्र ईसीएस (चित्रा 3बी) के बाद 3 एच और 24 एच में PSD अंश में एक बढ़ती हुई प्रवृत्ति प्रदर्शित किया गया था, synaptic बनाम extrasynaptic के संभावित अंतर विनियमन का सुझाव GluN2B-युक्त एनएमडीए रिसेप्टर्स. हम यह भी कहा कि GluN2B अभिव्यक्ति पुरानी ईसीएस के बाद P2 अंश में एक कम प्रवृत्ति प्रदर्शित और काफी PSD अंश में 24 और ९६ एच में कम पुरानी ईसीएस (चित्रा 4बी) के बाद किया गया । हालांकि उच्च सट्टा, ईसीएस के दोहराव प्रेरण निंनलिखित psd से GluN2B के हटाने के कई तंत्र द्वारा मध्यस्थता की जा सकती है, psd झिल्ली या पार्श्व प्रसार से extrasynaptic साइटों को प्रत्यक्ष internalization सहित । हमारी पिछली रिपोर्ट को ध्यान में रखते हुए कि लंबे समय तक वृद्धि ंयूरॉन गतिविधि के स्पष्ट रूप से कदम६१ अभिव्यक्ति बढ़ जाती है और कम कर देता है Tyr-फास्फारिलीकरण के P2 अंशों में GluN2B के कल्चरल हिप्पोकैम्पस ंयूरॉंस४६, हमारे निष्कर्षों का सुझाव कि P2 में GluN2B अभिव्यक्ति में कमी और पुराने ईसीएस के बाद PSD भागों की संभावना बढ़ाया कदम६१ अभिव्यक्ति और extrasynaptic झिल्ली से GluN2B के बाद हटाने के कारण हो सकता है ।

सारांश में, हम ने दिखा दिया है कि हमारे छोटे पैमाने पर एक ईसीएस प्रेरण प्रोटोकॉल के साथ संयोजन में लघु PSD अलग विधि, हमें vivo में अंतर करने की अनुमति देता है postsynaptic झिल्ली में ग्लूटामेट रिसेप्टर्स के गतिविधि पर निर्भर विनियमन बनाम कुल प्लाज्मा झिल्ली, extrasynaptic झिल्ली सहित । इस प्रोटोकॉल को आसानी से उत्तेजक synapses पर किसी भी synaptic प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता है और ऊतक वजन के आधार पर प्रत्येक समाधान की मात्रा का समायोजन करके अंय कुतर hippocampi या अंय मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए संशोधित किया जा सकता है । इस प्रकार, हमारे छोटे पैमाने PSD आंशिकीकरण विधि बहुमुखी है और भविष्य के अनुप्रयोगों के लिए अपनाया जा सकता है vivo में परिवर्तन की जांच करने के लिए प्रत्येक जानवर में postsynaptic प्रोटीन पर आनुवंशिक, औषधीय, या यांत्रिक उपचार ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

लेखक हमें अंश के लिए अपने केंद्रापसारक का उपयोग करने की अनुमति के लिए डॉ एरिक सी बोल्तों धंयवाद और डॉ ग्राहम एच Diering है जॉन हॉपकिंस विश्वविद्यालय में डॉ रिचर्ड एल Huganir लैब में हमें छोटे पैमाने पर प्रोटोकॉल के साथ प्रदान करने के लिए PSD अंश के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spargue-Dawley rat Charles River Laboratories ECS supplies
A pulse generator Ugo Bsile, Comerio, Italy 57800 ECS supplies
MilliQ water purifying system EMD Millipore Z00Q0VWW Subcellular fractionation supplies
Sucrose Em science SX 1075-3 Subcellular fractionation supplies
Na4O7P2 SIGMA-ALDRICH 221368 Subcellular fractionation supplies
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) SIGMA-ALDRICH E9884 Subcellular fractionation supplies
HEPES SIGMA-ALDRICH H0527 Subcellular fractionation supplies
Okadaic acid TOCRIS 1136 Subcellular fractionation supplies
Halt Protease Inhibitor Thermo Scientific 78429 Subcellular fractionation supplies
NaVO3 SIGMA-ALDRICH 72060 Subcellular fractionation supplies
EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top Filters Fisher Scientific SCGPS05RE Subcellular fractionation supplies
Iris Scissors WPI (World Precision Instruments) 500216-G Subcellular fractionation supplies
30 mm tissue culture dish Fisher Scientific 08-772B Subcellular fractionation supplies
Glass homogenizer and a Teflon pestle VWR 89026-384 Subcellular fractionation supplies
1.7 mL microcentrifuge tube DENVILLE SCIENTIFIC INC.  C2170 (1001002) Subcellular fractionation supplies
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge  Thermo Fisher 75004521 Subcellular fractionation supplies
Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL Thermo Fisher #23228 Western blot supplies
Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL Thermo Fisher #1859078 Western blot supplies
SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) BIO-RAD #4561086S Western blot supplies
Running Buffer Made in the lab Western blot supplies. 
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gel BIO-RAD #1658004 Western blot supplies
Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane  Milipore IPVH00010 Western blot supplies
Transfer Buffer Made in the lab Western blot supplies. 
Tris-base Fisher Scientific BP152-1 Western blot supplies
Glycine Fisher Scientific BP381-5 Western blot supplies
Sodium dodecyl sulfate SIGMA-ALDRICH 436143 Western blot supplies
Methanol  Fisher Scientific A454-4 Western blot supplies
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500 detergent for PSD isolation
Mini Trans-Blot Module  BIO-RAD #1703935 Western blot supplies
Nonfat instant dry milk Great value Western blot supplies
Multi-purposee rotator  Thermo Scientific Model-2314 Western blot supplies
Hyblot CL Autoradiography Film DENVILLE SCIENTIFIC INC.  E3018 (1001365) Western blot supplies
Enhanced chemifluorescence substrate  Thermo Scientific 32106 Western blot supplies
a Konica SRX-101A film processor KONICA MINOLTA SRX-101A Western blot supplies
Name of Antibody
PSD-95 Cell Signaling #2507 Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
Synaptophysin Cell Signaling #4329 Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
alpha-Tubulin Santacruz SC-5286 Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
GluN2B Neuromab 75-097 Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
GluA2 Sigma-aldrich Sab 4501295 Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
STEP Santacruz SC-23892 Antibody dilution = 1:200 - 500, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoReserch laboratory 715-035-150 Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey
Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoReserch laboratory 711-035-152 Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey

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References

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तंत्रिका विज्ञान मुद्दा १२६ Electroconvulsive जब्ती हिप्पोकैंपस उपसेलुलर अंश postsynaptic घनत्व एनएमडीए रिसेप्टर पश्चिमी सोख्ता
चूहों और उनके Hippocampi के अंश में Electroconvulsive बरामदगी Postsynaptic घनत्व प्रोटीन में जब्ती प्रेरित परिवर्तन की जांच करने के लिए
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Jang, S. S., Jeong, H. G., Chung, H. … More

Jang, S. S., Jeong, H. G., Chung, H. J. Electroconvulsive Seizures in Rats and Fractionation of Their Hippocampi to Examine Seizure-induced Changes in Postsynaptic Density Proteins. J. Vis. Exp. (126), e56016, doi:10.3791/56016 (2017).

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