Summary
우발적인 촬영 phytohormone 치료 없이 ipecac의 internodal 세그먼트에 유도 될 수 있다. 우발적인 촬영 형성 동안 phytohormone 역학을 평가 하기 위해 내 생 auxin 및 LC-MS/MS에 의해 internodal 세그먼트에서 시 토 키 닌을 측정 했습니다.
Abstract
우발적인 촬영 형성 유전자 변형 식물의 재생 및 경제적으로 중요 한 작물의 전파에 대 한 중요 한 기술입니다. Phytohormone 치료는 대부분의 종에서 우발적인 촬영의 유도 필요 합니다. Auxin과 시 토 키 닌 (CK) 사이의 균형에 의해 결정 됩니다 여부 우발적인 촬영 유도 될 수 있는 수준. 많은 노력 결정 최적 농도 및 explants로 사용 하는 각 조직에 각 식물 종에 phytohormones의 조합으로 간다. 그러나 Ipecac에서, 우발적인 촬영 수 유도 될 phytohormone 치료 없이 문화 매체에서 internodal 세그먼트에. 평가할 셀 차별화 ipecac의 고유한 소성 수 있습니다. Ipecac 우발적인 촬영 유도, 우리 phytohormone 무료 B5 중간 5 주 동안 0.2 %gellan 껌으로 고형화에 14 h 빛/10-h 어두운 주기에 internodal 세그먼트 15 µmol m−2의 − 1 의 빛에서 24 ° C에서 경작. 우발적인 촬영 형성 동안 phytohormone 역학 조사, 우리 생 indole-3-아세트산 및 CKs 세그먼트에 의해 측정 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 LC-MS/MS. 이 메서드는 간단한 방식으로 생 indole-3-아세트산 및 CKs 레벨의 분석을 수 있습니다. 그것은 다른 식물 종에 organogenesis 동안 내 생 auxin과 CK의 역학 조사에 적용할 수 있습니다.
Introduction
고트 Haberlandt (1854-1945 년) "totipotency", 어떤 식물에 의해 세포 수, 차별화, 분열과 성숙한 식물1에서 특정 세포 유형으로 차별화 그들의 이전 후에 전체 식물을 재생성의 개념을 제안 했다. 조직 문화에서 조합 및 성장 매체에 적용 된 것 phytohormones의 농도 의해 결정 됩니다 여부 식물 재생 여부 유도 될 수 있다. Skoog와 밀러 우발적인 뿌리 매체 포함 된 낮은 비율2에 유도 될 수 있는 반면 우발적인 촬영에 auxins, CKs의 높은 비율을 포함 하는 문화 매체에 굳은 살 담배에서에서 유도 될 수 있는 발견. 그 발견 이후 조직 문화는 널리 이용 된다 경제적으로 중요 한 작물의 전파 및 유전자 변형 식물3의 재생. 우발적인 촬영 촬영 정점 분열 조직, 잎, 뿌리, internodes 등 다른 조직에서 유도 될 수 있다. Phytohormone 치료는 대부분의 식물 종에서 우발적인 촬영의 유도 필요 합니다. 그러나, 최적 농도 조합 다 종에 의해 및 explants로 사용 하는 조직 중. 따라서, 많은 노력 결정 최적 농도 실험에 대 한 phytohormones의 조합으로 간다.
Carapichea ipecacuanha (Brot) L. 앤더슨 (ipecac)는 emetine 등 뿌리4에 주로 cephaeline, 알 카 로이드를 포함 하는 약용 식물 이다. 루트 추출 물 expectorant, 토 제, 그리고 amoebicide5로 사용 됩니다. 비록 ipecac 브라질의 열 대 우림에 자연적으로 성장, 문화, 씨앗을 설정 하기를 꺼 려 이며 발 아 율 감소는 추운 기후6일본, 씨앗 보관. 대신, 조직 문화에 의해 전파, 어떤 우발적인 촬영 internodes에 가장 효율적인 방법7,8. 흥미롭게도, 우발적인 촬영 phytohormone 치료8없이이 종에서 유도 될 수 있다.
우발적인 촬영 표 피 기저 지역9에 callusing, 없이 internodal 세그먼트의 꼭대기 지역에 형성 된다. 이 차이 아마도 phytohormonal 규정 internodal 세그먼트에서 조직 극성을 나타냅니다. Ipecac 문화 시스템 우발적인 촬영 형성 동안 내 생 phytohormone 레벨에 변화를 분석 하는 독특한 기회를 허용 합니다. 한 auxin (indole-3-아세트산 (IAA)) 및 4 개의 CKs 생 레벨의 분석에 대 한 우리의 방법을 소개 (isopentenyl 아데닌 (iP), isopentenyl 아데닌 아 (iPR), 트랜스-제 (tZ), 및 트랜스-제 아 (tZR)) 액정-MS/MS 사용 internodal 세그먼트.
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Protocol
참고: Ipecac (C. ipecacuanha)에 사용 되었다이 연구 생 phytohormones의 분석을 용이 하 게 하기 때문에.
1. 성장 조건 Ipecac의 우발적인 촬영 유도
- PH 5.710, 조정 phytohormone 무료 B5 매체를 준비 하 고 0.2 %gellan 껌을 추가. 압력가 마로 소독 하 여 소독.
- 멸 균 페 트리 접시 (90 m m × 20 m m)에 압력가 하는 매체의 25 mL를 붓으십시오.
- Ipecac plantlets 수술 메스를 사용 하 여 살 균 아크릴 플레이트에 블레이드 번호 22의 8 밀리미터 internodal 세그먼트를 잘라내어 매체 (그림 1)에 배치.
- 24 ° C 15 µmol m−2의 − 1 5 주 동안 14 h 빛/10-h 어두운 주기에서 빛의 아래에 B5 매체 phytohormone 무료에 문화.
- 지역 식별 난 (꼭대기) 4 (기저) 각 세그먼트 (그림 1B). 일주일에 한 번 우발적인 촬영 > 0.3 m m 길이 현미경으로 각 지역에서의 수를 계산 합니다.
2. 추출 및 Phytohormones의 정화
- 각 4 개의 2 mL 샘플 튜브 5 m m 지 르 코니 아 비드를 넣어.
- 지역으로 세그먼트를 잘라 iv (각 2 m m에 길이) 수술 메스를 사용 하 여 살 균 아크릴 판에 나.
- 별도 샘플 튜브 (10-30 mg 신선한 무게)에 각 지역의 8 개 세그먼트를 수집 합니다.
- 무게, 그리고 그 후 액체 질소에 샘플을 동결.
- 비드 기반 균질 화기를 사용 하 여 얼음된 샘플을 짝사랑.
- Auxin의 각 내부 표준의 500 pg와 紀 (d5-IAA, d5tZ, d5tZR, d6-iP, d6-지적재산권)를 포함 하는 1 mL 이기에 짓 눌린된 샘플 일시 중지와 동 믹서를 사용 하 여.
- 1 시간에 4 ° C에서 누른 다음 실 온에서 5 분 동안 3500 × g 에서 원심.
- 1% (v/v) 초 산을 포함 하는 80% (v/v) 이기에 펠 릿을 세척. 원심 분리기 다시 3500 × g 에서 실 온에서 5 분. 일회용 유리 튜브에서 (2.7, 2.8 단계)에서 supernatants 결합.
- 추가 600 µ L 각 결합된 상쾌한을 포함 1% (v/v) 초 산 물이 고 이기는 진공 집중 장치를 사용 하 여 증발.
- 이기, 메탄올, 및 1% (v/v) 초 산을 포함 하는 물의 1 mL를 각각 적용 하 여 친수성 닥터지-평형 (HLB) 열 카트리지를 equilibrate.
- Equilibrated HLB 카트리지 당 하나의 샘플 솔루션을 적용 합니다.
- 1 mL 물 1% (v/v) 초 산을 포함 하는 카트리지를 씻어.
- 포함 하는 유리 튜브에 1% (v/v) 초 산 2 mL 80% (v/v) 이기와 모든 호르몬을 elute.
- 포함 하는 1% (v/v) 초 산 진공 집중 장치를 사용 하 여 물에 추출 eluate에 이기를 증발.
참고:이 완전히 건조 하지 않습니다. - 1 mL 이기, 1 mL 메탄올, 0.5 mL를 적용 하 여 혼합 모드, 강한 양이온 교환 (MCX) 열 카트리지 equilibrate 0.1 M HCl, 그리고 포함 하는 1% (v/v) 초 산 1 mL 물.
- Equilibrated MCX 카트리지 당 하나의 샘플 솔루션을 적용 합니다.
- 1 mL 물 1% (v/v) 초 산을 포함 하는 카트리지를 씻어.
- 포함 하는 유리 튜브에 1% (v/v) 초 산 2 mL 30% (v/v) 이기와 IAA elute.
- 씻어 카트리지 포함 하는 1% (v/v) 아세트산 2 mL 80% (v/v) 이기.
- 씻으십시오 2 mL 물, 1 mL 물 5% 수성 암모니아를 포함 하는 카트리지.
- 유리 튜브에 5% 수성 암모니아를 포함 하는 2 mL 60% (v/v) 이기와는 CKs을 elute.
- 진공 농축 기를 사용 하 여 각 호르몬 분수의 용 매를 증발 하 고 LC-MS/MS 분석까지 −30 ° C에 저장 합니다.
3. LC-MS/MS 분석 IAA 및 CKs
- 각 호르몬 추출 메탄올의 600 µ L 튜브에 녹이 고 나사 목 총 복구 유리병에 솔루션을 전송. 진공 집중 장치를 사용 하 여 용 매를 증발.
- 20 µ L 30% (v/v) 이기, IAA 분수와 CK 분수 나사 목 총 복구 튜브에 1% (v/v) 초 산을 포함 하는 20 µ L 물에 용 해.
- HPLC 시스템 트리플 4 극 자 MS 시스템에서 긍정적인 이온 모드에서 샘플을 분석 합니다.
표 1에 나열 된 참고: 우리 HPLC 조건을 설정 합니다.- IAA 차입에 대 한 5%-50% 용 매 B 7 분 이상의 이진 그라디언트를 사용 하 여 다음 98% 용 매 B에 의해 증가 1 분 동안 누른 다음 둥지를 주입 하 여 5% 용 매 B에 2 분 동안 equilibrate.
- CK 차입에 대 한 2%-40% 용 매 B 5 분 이상 40%-70% 용 매 B 7 분에서의 이진 그라디언트를 사용 하 여 다음 95% 용 매 B 늘려 1 분 동안 누른 다음으로 2% 용 매 B에 2 분 동안 equilibrate 주입을 중첩.
- 분무 이온화 (ESI) 설정-MS 이온 소스 표 2에 나열 된 매개 변수.
- 여러 반응 (MRM) 전환 표 3에 나열 된 각 분석의 정량화에 대 한 모니터링을 사용 합니다.
- 계량 중수소 라는 표준 레이블 없는 비율의 표준 곡선에 대 한 내 생 IAA 및 CK 수준.
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Representative Results
1세인트 주에서 아니 우발적인 촬영 형성 했다. 2노스다코타 주에 작은 쏘고 나타났다. 3rd , 4번째 주에 수 꼭대기 지역 (I 및 II)에서 주로 증가 쏘고 (그림 2A). 5일 주에 수 촬영의 되었고 약 7 시내 지역 나 지역 II (그림 2B) 5. 대조적으로, 단지 몇 가지 촬영 영역 III 및 IV에에서 형성 되었다.
문화, 전에 IAA 수준 높았다 약간 지역에서 난 (4.1 pg/mg, 신선한 무게 (FW)) 보다 지역 II-4 (~ 2.5 pg/mg FW; 그림 3)입니다. 1세인트 주에서 IAA 레벨 지역 4에서 크게 증가 (11.4 pg/mg FW) 지역 난-3 (1.5-2.2 pg/mg FW)에서 약간 감소. 2노스다코타 주에서 지역 IV에서 IAA 수준 감소 ~ 4.4 pg/mg FW, 기초 지역에서 IAA 축적 했다 과도 나타내는. 문화의 5 주, IAA 농도 기온 변화도 등장, 지역 iv 나 지역에서 증가 하는 수준.
문화, 전에 대부분 CKs (그림 3)의 추적 수준을 했다. 1세인트 주 tZR 수준 증가 13.8 pg/mg 지역 II에서에서 FW 18.1 pg/mg 지역 III에에서 FW. 레벨은 다음 문화의 5 주 이상 점차적으로 줄였다. 다른 한편으로, tZ, iP, 지적재산권의 레벨 변경만 약간 문화 중.
그림 1 : Ipecac의 우발적인 촬영 형성에 대 한 준비. (A) internodal 세그먼트 (긴 8 m m) 깨끗 한 벤치에 재생성된 ipecac에서 잘라입니다. (B) 첫 번째 위치인 우발적인 촬영 형성을 위해 사용 되었다. (C) 세그먼트 우발적인 촬영 유도를 접시에 25 mL phytohormone 무료 B5 매체에 교양. 눈금 막대 = 1 cm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 :의 우발적인 쏘고 internodal 세그먼트에 형성. (A) 우발적인 촬영 문화의 0 ~ 5 주 후 형성. 눈금 막대 = 5 mm. (B) 세그먼트는 4 개의 영역 (I-IV)으로 분할 했다 그리고 각 지역에서 우발적인 촬영의 수 주 5에서 계산 했다. 데이터는 의미 ± SEM (n = 3). 10 개의 세그먼트는 각 실험에서 사용 되었다. N.F. 발견 =. 이 그림에서 코 외. 수정 되었습니다. 9 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : Phytohormone 수준 internodal 세그먼트의 시간 과정 분석. 세그먼트는 4 개의 영역 (I-IV)으로 분리 되었다. 내 생 IAA와 각 지역에서 (tZ, tZR, iP, 및 지적재산권) CKs LC-MS/MS에 의해 정량 했다. IP 및 지적재산권 수준이 매우 낮은 있기 때문에, 확대 된 그래프를 같은 그래프 안에 삽입 되었다. 데이터는 의미 ± SEM (n = 3). 8 개의 세그먼트는 각 실험에서 사용 되었다. 이 그림에서 코 외. 수정 되었습니다. 9 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 열 | IAA: ACQUITY BEH C18 φ2.1 × 100 1.7 µ m |
| CKs: Poroshell EC-C18 φ2.1 × 50 2.7 µ m | |
| 온도 | 40 ℃ |
| 모바일 단계 | 물 + 0.05% 초 산 용 매 a: 증 류 |
| 용 매 b: 이기 + 0.05% 아세트산 | |
| 흐름 율 | 0.35 ml/min |
| 사출 볼륨 | 18 µ l |
표 1: IAA와 CK 분석에서 HPLC 조건입니다.
| 커튼 가스 (a.u.)* | 10 / 40 * * |
| 충돌 가스 (a.u.)* | 5 / 3 * * |
| 이온 스프레이 전압 (V) | 5500 |
| 온도 (º C) | 600 |
| 이온 소스 가스 1 (a.u.)* | 30 |
| 이온 소스 가스 2 (a.u.)* | 40 / 80 * * * |
| 해상도 | 단위 |
표 2: 이온 소스 매개 변수. * 임의 단위입니다. * * IAA 분석/CK 분석입니다. 이 테이블에서 코 외. 수정 되었습니다. 9
| 1 분기 (m/z) | 3 분기 (m/z) | Declustering 잠재력 (V) | 잠재적인 입구 (V) | 충돌 에너지 (V) | |
| IAA | 176 | 130 | 26 | 6.5 | 21 |
| d5-IAA | 181 | 134 | 36 | 4.0 | 23 |
| tZ | 220 | 136 | 36 | 5.0 | 23 |
| d5-tZ | 225 | 137 | 31 | 5.0 | 21 |
| tZR | 352 | 220 | 41 | 5.5 | 23 |
| d5tZR | 357 | 225 | 51 | 5.0 | 21 |
| iP | 204 | 136 | 31 | 9.0 | 19 |
| d6-iP | 210 | 137 | 31 | 5.5 | 21 |
| 지적 재산권 | 336 | 204 | 31 | 5.0 | 21 |
| d6-지적재산권 | 342 | 210 | 36 | 5.5 | 21 |
표 3: LC-MS/MS 분석에 IAA와 CKs MRM 전환. 이 테이블에서 코 외. 수정 되었습니다. 9
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Discussion
Phytohormones의 분포를 식별 하기 위해 organogenesis에 관련 된 그것은 적용 될 때 phytohormones는 것 유도 위한 explants 때문에 있는 organogenesis phytohormone 무료 매체에 관찰 될 수 있다 식물 재료를 사용 하는 것이 중요 촬영 또는 뿌리, 그들은 전체 explant을, 세포 분화 및 organogenesis에 있는 식물의 고유한가 소성을 평가 하 고 어려운 영향을 미칩니다. 우발적인 촬영 phytohormone 무료 문화 미디어 Dianthus caryophyllus L.11, Aegle marmelos (L.) 코레아12, Bacopa monnieri (L.) Pennell13, 다른 식물 종에서에 유도 될 수 있다 노박 paniculatus Willd. 14, 그리고 Kalanchoë blossfeldiana Poelln. 15. 이러한 식물 종에 프로토콜을 적용할 수 있을 것 이다.
우리는 IAA, tZ, tZR, iP, 및 이기에 지적재산권을 추출 하 고 고체 상 추출에 의해 그들을 정화. 원래 방법은 모든 phytohormones (gibberellins, abscisic 산, jasmonic 산, 살리실산 등) 정화16때문에 세 가지 유형의 카트리지 열 (HLB, MCX, 및 약 음이온 교환 (왁 스))를 사용 합니다. HLB 열 사용 하는 고분자 역 상 매, MCX 열 양이온 교환 그룹와 같은 사용 하 고 왁 스 열 약한 음이온 교환 그룹과 동일한 사용. 원래 방법 elutes 60% 이기 포함 하는 두 번째 단계에서 MCX 열에 수성 암모니아와 (기본) CKs 그리고 마지막 단계에서 왁 스 열에 1% 초 산을 포함 하는 80% 이기와 IAA (산 성). 우리의 초점은 auxin 및 식물 성장17규제 antagonistically 작용, CKs 간단한 프로토콜 사용 하 여만 HLB 및 MCX 열; IAA는 eluted 30% 이기 포함 하는 첫 번째 단계에서 HLB 열에 1% 초 산으로. LC-MS/MS 분석 샘플 준비에서 2 일 소요 됩니다.
이기 용 매 카트리지 열에서 phytohormone 정화 동안 건조 하지 허용 되어야 한다. 않으면, 유리 튜브에 붙어 하 고 샘플에서 분실 되는 phytohormones를 방지 하기 위해 이기에 샘플 resuspend. 이 프로토콜에서 이온 함정 MS 시스템 검출 한계는 ~ IAA와 10-30 mg 신선한 조직에서 紀 10 세. 작은 금액을 분석 하는 훨씬 더 많은 샘플을 수집 하거나 MS를 사용 하 여 높은 감도와 필요한 것입니다.
Phytohormone 분석 식물의 성장과 개발의 평가 대 한 중요 한 기술입니다. 이 방법을 사용 하 여, 우리 수 있습니다 auxin 및 우발적인 촬영 형성 식물 종에 대 한 CK 치료의 타이밍을 결정 하 어디 최적의 문화 상태는 여전히 알. 마찬가지로 phytohormone 정량화 되 고 점점 더 중요 한, 여기에 설명 된 LC-MS/MS 프로토콜 높은 감도와 해상도 작은 샘플의 분석을 하면 수 있습니다. 이전 방법의 우리의 단순화 정화 및 분석을 용이 하 게 하 고 높은 다양성 및 재현성을가지고. 미래에,이 메서드는 다른 식물 종에 organogenesis 동안 내 생 auxin과 CK의 역학 조사에 적용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자 들은 관심 없음 충돌 선언 합니다.
Acknowledgments
우리는 그들의 기술 지원에 대 한 응용된 생물 과학 부, 도요 대학, 군마 농업 기술 센터의 씨 Koudai 타 니 구치의 씨 아키라 무라카미에 감사. 우리는 또한 그들의 제안에 대 한 교수 Shosaku Kashiwada 박사 우 Maheswari Rajagopalan, 도요 대학에 감사입니다. 이 연구는 생명 및 환경 과학, 도요 대학에 대 한 연구 센터에 의해 부분에서 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [2H5]indole-3-acetic acid | Olchemlm Ltd | 031 1531 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin | Olchemlm Ltd | 030 0301 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin riboside | Olchemlm Ltd | 030 0311 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenine | Olchemlm Ltd | 030 0161 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenosine | Olchemlm Ltd | 030 0171 | Internal standard for LC-MS/MS |
| indole-3-acetic acid | Wako | 098 00181 | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin | SIGMA-ALDRICH | Z0876 5MG | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin riboside | Wako | 262 01081 | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenine | SIGMA-ALDRICH | D7674 1G | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenosine | ACROS ORGANICS | 22648 1000 | standard for LC-MS/MS |
| acetonitrile hypergrade for LC-MS LiChrosolv | MERCK | 1.00029.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| Water for chromatography LiChrosolv | MERCK | 1.15333.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| HPLC | SHIMADZU | Prominence | |
| MS | Sciex | 3200QTRAP | |
| Oasis HLB 30 mg/1 cc | Waters | WAT094225 | cartridge column |
| Oasis MCX 30 mg/1 cc | Waters | 186000252 | cartridge column |
| screw neck total recovery vial | Waters | 186002805 | |
| blue, 12 x 32mm screw neck cap and PTFE/silicone septum | Waters | 186000274 | |
| Acquity UPLC BEH C18, 2.1x100 mm | Waters | 186002350 | UPLC column |
| Proshell 120 EC-C18, 2.1x50 mm | Agilent | 699775-902 | UPLC column |
| Digital microscope | Leica | DHS1000 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Surgical blade | Feather | No. 22 | |
| Scalpel handle | Feather | No. 4 | |
| Savant SpeedVac/Refregerated vapor trap | Thermo Fisher Scientific | SPD111/RVT4104 | vacuum concentrartor |
| Disposable glass tobe (13x100 mm) | IWAKI | 9832-1310 | |
| Sterile petri dish | INA OPTICA | I-90-20 |
References
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