Summary
Onvoorziene scheuten kunnen worden opgewekt op overslagfaciliteiten segmenten van ipecac zonder phytohormone behandeling. Om te beoordelen phytohormone dynamiek tijdens onvoorziene schieten vorming, we gemeten endogene auxine en cytokinine in overslagfaciliteiten segmenten door LC-MS/MS.
Abstract
Onvoorziene schieten formatie is een belangrijke techniek voor de verspreiding van economisch belangrijke gewassen en voor de regeneratie van transgene planten. Phytohormone behandeling is vereist voor de inductie van onvoorziene scheuten in de meeste soorten. Of onvoorziene scheuten kunnen worden opgewekt wordt bepaald door het evenwicht tussen auxine en cytokinine (CK) niveaus. Veel moeite gaat in het bepalen van de optimale concentraties en combinaties van fytohormonen in elk weefsel gebruikt als explantaten en bij elke plantensoorten. In Braakwortel, kunnen echter onvoorziene scheuten worden opgewekt op overslagfaciliteiten segmenten in een kweekvloeistof zonder phytohormone behandeling. Hierdoor is de inherente plasticiteit van ipecac voor celdifferentiatie worden geëvalueerd. Om onvoorziene scheuten in Braakwortel, gekweekt we overslagfaciliteiten segmenten bij 24 ° C onder de 15 µmol m−2 s−1 van licht in een donkere cyclus van 14-h licht/10-h op phytohormone-gratis B5 medium voor 5 weken met 0,2% gellan tandvlees verhard. Om te onderzoeken phytohormone dynamiek tijdens onvoorziene schieten vorming, we gemeten endogene indool-3-azijnzuur en CKs in de segmenten door vloeibare chromatografie-tandem massaspectrometrie LC-MS/MS. Met deze methode kunt analyse van endogene indool-3-azijnzuur en CKs niveaus op een eenvoudige manier. Het kan worden toegepast om te onderzoeken van de dynamiek van endogene auxine en CK tijdens organogenese bij andere plantensoorten.
Introduction
Gottlieb Haberlandt (1854-1945) voorgesteld het concept van "totipotent", door welke plant kunnen cellen verdelen, differentiëren en regenereren van hele planten zelfs na hun voorafgaande differentiatie in specifieke celtypes in volwassen planten1. In de weefselkweek, wordt of plant regeneratie kan worden opgewekt, of niet bepaald door de combinatie en de concentratie van exogenously toegepaste fytohormonen in het groeimedium. Skoog en Miller gevonden dat onvoorziene scheuten kunnen worden opgewekt uit tabak eelt op kweekmedium dat een hoge verhouding van CKs tot auxines, overwegende dat de bijwortels kon worden geïnduceerd op medium met een lage verhouding2. Sinds dat zoeken, is weefselkweek wijd verbeid gebruikt voor de verspreiding van economisch belangrijke gewassen en voor de regeneratie van transgene planten3. Onvoorziene scheuten kunnen worden opgewekt uit weefsels dan schieten apicale meristeem, zoals bladeren, wortels en groeispurt. Phytohormone behandeling is vereist voor de inductie van onvoorziene scheuten in meeste plantensoorten. Echter, de optimale concentratie en de combinaties verschillen per soort en onder weefsels als explantaten gebruikt. Dus, veel moeite gaat in het bepalen van de optimale concentraties en combinaties van fytohormonen voor experimenten.
Carapichea ipecacuanha (Brot.) L. Andersson (Braakwortel) is een medicinale plant die alkaloïden zoals emetine en Phosphatidylethanolamine, vooral in de wortels4 bevat. Root extracten worden gebruikt als een braakmiddel, een slijmoplossend en een amoebicide5. Hoewel Braakwortel natuurlijk in de tropische regenwouden van Brazilië groeit, het is terughoudend om zaden in cultuur, en de kiemkracht tarief vermindert tijdens de opslag van het zaad in Japan, met haar kouder klimaat6. In plaats daarvan, het is vermeerderd door weefselkweek, in die onvoorziene schieten formatie op de groeispurt is de meest efficiënte methode7,8. Interessant, kunnen onvoorziene scheuten worden opgewekt in deze soort zonder phytohormone behandeling8.
Onvoorziene scheuten worden gevormd op de epidermis in de apicale regio van overslagfaciliteiten segmenten zonder callusing, maar niet in de basale regio9. Dit verschil geeft aan weefsel polariteit in overslagfaciliteiten segmenten, die waarschijnlijk is onder phytohormonal verordening. De Braakwortel cultuur systeem maakt het mogelijk een unieke gelegenheid om veranderingen in de endogene phytohormone analyseren tijdens onvoorziene schieten vorming. Hier introduceren wij onze werkwijze voor de analyse van de endogene niveaus van één auxine (indool-3-azijnzuur (IAA)) en vier CKs (isopentenyl adenine (iP), isopentenyl adenine riboside (iPR), trans-Zeatine (tZ), en trans-Zeatine riboside (tZR)) in overslagfaciliteiten segmenten met behulp van LC-MS/MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: Ipecac (C. ipecacuanha) werd gebruikt in deze studie omdat het vergemakkelijkt de analyse van endogene fytohormonen.
1. groei omstandigheden voor het opwekken van onvoorziene scheuten van Ipecac
- Phytohormone-gratis B5 medium aangepast aan de pH 5.710bereiden en toevoegen van 0,2% gellan tandvlees. Steriliseren in autoclaaf.
- Giet 25 mL van de gesteriliseerde met autoclaaf medium in een steriele petrischaal (90 × 20 mm).
- 8-mm overslagfaciliteiten segmenten van ipecac plantjes met een chirurgische scalpel met een mes nr. 22 op een steriele acryl plaat knippen, en plaats op het medium (Figuur 1).
- Cultuur op phytohormone-gratis B5 medium bij 24 ° C onder de 15 µmol m−2 s−1 van licht in een donkere cyclus van 14-h licht/10-h voor 5 weken.
- Identificeren van de regio's ik (apicaal) tot en met IV (basale) in elk segment (Figuur 1B). Het aantal onvoorziene scheuten > 0.3 mm lengte in elke regio onder een Microscoop eenmaal per week.
2. extractie en zuivering van fytohormonen
- Een 5-mm Zirkonia parel in elk van de vier 2-mL monster buisjes plaatsen
- De segmenten in regio's gesneden I tot en met IV (elk 2 mm in lengte) met behulp van een chirurgische scalpel op een steriele acryl plaat.
- Verzamelen van acht segmenten van elke regio in aparte monster buizen (10-30 mg vers gewicht).
- Weeg, en vervolgens het bevriezen van de monsters in vloeibare stikstof.
- Crush de bevroren monsters met behulp van een kraal gebaseerde homogenizer.
- Opschorten van de geplette monsters in 1 mL acetonitril met 500 pg van elke interne standaard van auxine en CKs (d5-IAA d5- tZ, d5- tZR, d6- iP, d6- iPR) met behulp van een vortex-mixer.
- Houd bij 4 ° C gedurende 1 h, dan Centrifugeer bij 3.500 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Het wassen van de pellet in 80% (v/v) acetonitril met 1% (v/v) azijnzuur. Centrifugeer nogmaals op 3.500 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Combineer het supernatant (uit stap 2.7 en 2.8) in een wegwerp glazen buis.
- Toevoegen van 600 µL water met 1% (v/v) azijnzuur aan elke gecombineerde supernatant en verdampen van de met behulp van een vacuüm concentrator acetonitril.
- Equilibreer hydrofiele lipofiele-evenwichtige (HLB) kolom patronen door het toepassen van elk 1 mL acetonitril, methanol en water met 1% (v/v) azijnzuur.
- Toepassing één monsteroplossing per geëquilibreerd HLB cartridge.
- Het wassen van de cartridges met 1 mL water met 1% (v/v) azijnzuur.
- Elueer alle hormonen met 2 mL 80% (v/v) acetonitril met 1% (v/v) azijnzuur in een glazen buis.
- Verdampen de acetonitril in het eluaat extract in water met 1% (v/v) azijnzuur met behulp van een vacuüm concentrator verkrijgen.
Let op: Dit niet volledig drogen. - Gemengde modus, sterke catie-uitwisseling (MCX) kolom cartridges equilibreer door het toepassen van 1 mL acetonitril, 1 mL methanol, 0,5 mL 0,1 M HCl en 1 mL water met 1% (v/v) azijnzuur.
- Toepassing één monsteroplossing per geëquilibreerd MCX cartridge.
- Het wassen van de cartridges met 1 mL water met 1% (v/v) azijnzuur.
- IAA Elueer met 2 mL 30% (v/v) acetonitril met 1% (v/v) azijnzuur in een glazen buis.
- Het wassen van de cartridges met 2 mL 80% (v/v) acetonitril met 1% (v/v) azijnzuur.
- Wassen van de cartridges met 2 mL en 1 mL water met 5% waterige ammoniak.
- Elueer de CKs met 2 mL 60% (v/v) acetonitril met 5% waterige ammoniak in een glazen buis.
- Damp het oplosmiddel van elk hormoon breuk met behulp van een vacuüm concentrator en bewaren op −30 ° C tot de LC-MS/MS-analyse.
3. LC-MS/MS analyse van IAA en CKs
- Los van elk hormoon uittreksel in een buis met 600 µL van methanol en breng de oplossing over in een schroef flacon voor de volledige terugvordering van de nek. Damp het oplosmiddel met behulp van een vacuüm concentrator.
- Los de IAA breuk in 20 µL 30% (v/v) acetonitril, en de CK breuken in 20 µL water met 1% (v/v) azijnzuur in schroef nek volledige terugvordering flesjes.
- Analyseer de monsters in positieve ion-modus op een triple-vierpolige MS systeem uitgerust met een systeem van HPLC.
Opmerking: We stellen de HPLC-voorwaarden zoals vermeld in tabel 1.- Voor de IAA elutie, gebruiken een binaire verloop van 5% - 50% oplosmiddel B meer dan 7 min, dan verhogen door 98% oplosmiddel B en houd voor 1 min en vervolgens equilibreer gedurende 2 min op 5% oplosmiddel B door nest injectie.
- Voor de CK elutie, gebruiken een binaire helling van 2% - 40% oplosmiddel B meer dan 5 min, 40% - 70% oplosmiddel B in 7 min, dan verhogen door 95% oplosmiddel B Houd voor 1 min en vervolgens equilibreer gedurende 2 min op 2% oplosmiddel B door injectie nesten.
- Instellen van de electrospray ionisatie (ESI)-MS parameters van ion bron zoals vermeld in tabel 2.
- Gebruik de meerdere reactie controle (MRM) overgang voor kwantificering van elke analyt vermeld in tabel 3.
- Endogene IAA en CK niveaus tegen een standaard curve van de verhouding van labelloze deuterium-geëtiketteerden normen te kwantificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Op de 1st -week, had geen onvoorziene scheuten gevormd. Tijdens de week van 2nd verscheen de kleine scheuten. Op de 3rd en 4th weken, schiet vooral in de apicale regio's (I en II) het aantal toegenomen(Figuur 2). Op de 5th -week, het aantal van scheuten was ongeveer 7 in regio ik en 5 regio II (Figuur 2B). In tegenstelling, werden alleen een paar scheuten gevormd in regio's III en IV.
Voor cultuur, de IAA niveau lag iets hoger in regio ik (4.1 pg/mg, vers gewicht (FW)) dan in regio's II-IV (~ 2.5 pg/mg FW; Figuur 3). Bij de 1st -week, de IAA niveau sterk toegenomen in regio IV (11.4 pg/mg FW) en daalde licht in regio's I-III (1.5-2.2 pg/mg FW). Tijdens de week van 2nd , het niveau van de IAA in regio IV daalde tot ~ 4.4 pg/mg FW, die aangeeft dat de IAA accumulatie in de basale regio van voorbijgaande aard was. Met 5 weken van cultuur ontstaan een gradiënt van de concentratie IAA, met niveaus verhogen uit regio ik tot regio IV.
Voor cultuur waren er slechts traceringsniveaus voor meeste CKs (Figuur 3). Bij de 1st -week, het tZR verhoogd 13.8 pg/mg FW in regio II en 18.1 pg/mg FW in regio III. De niveaus daalde vervolgens geleidelijk over 5 weken van cultuur. Aan de andere kant, de niveaus van tZ, IP- en intellectuele-eigendomsrechten slechts lichtjes veranderd tijdens cultuur.
Figuur 1 : Voorbereiding van ipecac voor onvoorziene schieten vorming. (A) een overslagfaciliteiten segment (8 mm lang) wordt gesneden van geregenereerde Braakwortel op een schone bankje. (B) de eerste stengellid werd gebruikt voor onvoorziene schieten vorming. (C) segmenten worden gekweekt op 25 mL phytohormone-vrije B5 medium in petrischalen ertoe onvoorziene scheuten. Schaal bar = 1 cm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Verdeling van onvoorziene scheuten gevormd op een overslagfaciliteiten segment. (A) onvoorziene scheuten gevormd na 0 tot en met 5 weken van cultuur. Schaal bar = 5 mm. (B) segmenten waren opgedeeld in vier regio's (I-IV), en het aantal onvoorziene scheuten in elke regio werd geteld bij week 5. Gegevens zijn middelen ± SEM (n = 3). Tien scènes werden gebruikt in elk experiment. N.F. = niet gevonden. Dit cijfer is gewijzigd van Koike et al. 9 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Tijdsverloop analyse voor phytohormone levels in overslagfaciliteiten segmenten. Segmenten zijn opgedeeld in vier regio's (I-IV). Endogene IAA en CKs (tZ, tZR, IP- en intellectuele-eigendomsrechten) in elke regio werden gekwantificeerd door LC-MS/MS. Omdat IP- en intellectuele-eigendomsrechten niveaus zeer laag waren, werd een ingezoomde grafiek ingevoegd binnen dezelfde grafiek. Gegevens zijn middelen ± SEM (n = 3). Acht segmenten werden gebruikt in elk experiment. Dit cijfer is gewijzigd van Koike et al. 9 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Kolom | IAA: ACQUITY BEH C18 φ2.1 × 100 1.7 µm |
| CKs: Poroshell EG-C18 φ2.1 × 50 2.7 µm | |
| Temperatuur | 40ºC |
| Mobiele fase | Oplosmiddel A: gedistilleerd water + 0,05% azijnzuur |
| Oplosmiddel B: acetonitril + 0,05% azijnzuur | |
| Debiet | 0.35 ml/min |
| Geïnjecteerd volume | 18 µl |
Tabel 1: HPLC voorwaarde in IAA en CK analyse.
| Gordijn gas (a.u.)* | 10 / 40 ** |
| Botsing gas (a.u.)* | 5 / 3 ** |
| Ion spray spanning (V) | 5500 |
| Temperatuur (ºC) | 600 |
| Ion bron gas 1 (a.u.)* | 30 |
| Ion bron gas 2 (a.u.)* | 40 / 80 ** |
| Resolutie | Eenheid |
Tabel 2: Parameters van ion bron. * willekeurige eenheden. ** IAA analyse/CK analyse. Deze tabel is gewijzigd van Koike et al. 9
| Q1 (m/z) | Q3 (m/z) | Declustering potentieel (V) | Ingang potentiële (V) | Botsing energie (V) | |
| IAA | 176 | 130 | 26 | 6.5 | 21 |
| d5-IAA | 181 | 134 | 36 | 4.0 | 23 |
| tZ | 220 | 136 | 36 | 5.0 | 23 |
| d5- tZ | 225 | 137 | 31 | 5.0 | 21 |
| tZR | 352 | 220 | 41 | 5.5 | 23 |
| d5- tZR | 357 | 225 | 51 | 5.0 | 21 |
| iP | 204 | 136 | 31 | 9.0 | 19 |
| d6- iP | 210 | 137 | 31 | 5.5 | 21 |
| intellectuele-eigendomsrechten | 336 | 204 | 31 | 5.0 | 21 |
| d6- intellectuele-eigendomsrechten | 342 | 210 | 36 | 5.5 | 21 |
Tabel 3: MRM overgangen van IAA en CKs in LC-MS/MS analyse. Deze tabel is gewijzigd van Koike et al. 9
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ter identificatie van de verdeling van fytohormonen betrokken is in de organogenese, het is belangrijk om het gebruik van plantaardig materiaal waarin organogenese kan worden waargenomen op de drager van de phytohormone-vrij, omdat wanneer fytohormonen exogenously worden toegepast op explantaten voor inducerende scheuten of wortels, beïnvloeden ze de hele explant, waardoor het moeilijk is om te evalueren van de inherente plasticiteit van planten in de celdifferentiatie en organogenese. Onvoorziene scheuten kunnen worden opgewekt op phytohormone-vrije cultuur media in andere plantensoorten zoals Dianthus caryophyllus L.11 Aegle marmelos (L.) Corrêa12, Bacopa monnieri (L.) Pennell13, Lagochilus paniculatus Willd. 14, en Poelln van de blossfeldiana van de Kalanchoë . 15. het zou mogelijk zijn om het protocol bij deze plantensoorten te passen.
We IAA, tZ, tZR, IP- en intellectuele-eigendomsrechten in acetonitril gewonnen en gezuiverd hen door solid-phase extraction. De originele methode maakt gebruik van drie soorten cartridge kolommen (HLB MCX en zwakke anion uitwisseling (WAX)) omdat alle fytohormonen gezuiverde (met inbegrip van gibberellins, abscisic zuur, jasmonic zuur en salicylzuur)16. De HLB kolom gebruikt een polymere omgekeerde-fase sorptiemiddel, de MCX-kolom gebruikt hetzelfde met catie-uitwisseling groepen en de kolom WAX gebruikt hetzelfde met zwakke anion-uitwisseling groepen. De originele methode GC CKs (basis) met 60% acetonitril met waterige ammoniak op een MCX-kolom in de tweede stap, waarna de IAA (zure) met 80% acetonitril met 1% azijnzuur op een WAX-kolom in de laatste stap. Onze focus is auxine en CKs, die op elkaar antagonistically inwerken voor het regelen van de plant groei17, het vereenvoudigde protocol gebruikt alleen de HLB en MCX kolommen; IAA wordt geëlueerd met 30% acetonitril met 1% azijnzuur op de HLB-kolom in de eerste stap. Het duurt twee dagen van monstervoorbereiding LC-MS/MS-analyse.
Het oplosmiddel acetonitril mogen niet uitdrogen tijdens het zuiveringsproces ongehinderd de phytohormone in de kolommen van de cartridge. Zo ja, resuspendeer de steekproef in acetonitril om te voorkomen dat de fytohormonen vast aan de glazen buis en verloren uit het monster. In dit protocol, is de detectiegrens met de ion-trap MS systeem ~ 10 pg voor IAA en CKs uit 10-30 mg verse weefsels. Om kleinere bedragen te analyseren, zou het noodzakelijk veel meer monster verzameld of gebruiken van MS met hogere gevoeligheid.
Phytohormone-analyse is een belangrijke techniek voor de beoordeling van de plantengroei en ontwikkeling. Met behulp van deze methode, zou wij kunnen bepalen de timing van auxine en CK behandeling voor onvoorziene schieten vorming in plantensoorten waar de optimale cultuur voorwaarde is nog onbekend. Zoals phytohormone kwantificering steeds belangrijker wordt, het protocol van de LC-MS/MS hier beschreven zal in staat stellen de analyse van kleine steekproeven met hoge gevoeligheid en resolutie. Onze vereenvoudiging van een vorige methode zal vergemakkelijken van zuivering en analyse, en brengen hoge veelzijdigheid en reproduceerbaarheid. In de toekomst kan deze methode worden toegepast om te onderzoeken van de dynamiek van de endogene auxine en CK tijdens organogenese bij andere plantensoorten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen conflicten van interesse hebben.
Acknowledgments
Wij zijn dankbaar aan Mr. Akira Murakami van de Vakgroep Toegepaste biowetenschappen, Toyo Universiteit en Mr. Koudai Taniguchi van het Gunma Agricultural Technology Center voor hun technische bijstand. Wij zijn ook dank aan Professor Shosaku Kashiwada en Dr. Uma Maheswari Rajagopalan, Toyo Universiteit voor hun suggesties. Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door het Research Center for Life en milieuwetenschappen, Toyo Universiteit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [2H5]indole-3-acetic acid | Olchemlm Ltd | 031 1531 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin | Olchemlm Ltd | 030 0301 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin riboside | Olchemlm Ltd | 030 0311 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenine | Olchemlm Ltd | 030 0161 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenosine | Olchemlm Ltd | 030 0171 | Internal standard for LC-MS/MS |
| indole-3-acetic acid | Wako | 098 00181 | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin | SIGMA-ALDRICH | Z0876 5MG | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin riboside | Wako | 262 01081 | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenine | SIGMA-ALDRICH | D7674 1G | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenosine | ACROS ORGANICS | 22648 1000 | standard for LC-MS/MS |
| acetonitrile hypergrade for LC-MS LiChrosolv | MERCK | 1.00029.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| Water for chromatography LiChrosolv | MERCK | 1.15333.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| HPLC | SHIMADZU | Prominence | |
| MS | Sciex | 3200QTRAP | |
| Oasis HLB 30 mg/1 cc | Waters | WAT094225 | cartridge column |
| Oasis MCX 30 mg/1 cc | Waters | 186000252 | cartridge column |
| screw neck total recovery vial | Waters | 186002805 | |
| blue, 12 x 32mm screw neck cap and PTFE/silicone septum | Waters | 186000274 | |
| Acquity UPLC BEH C18, 2.1x100 mm | Waters | 186002350 | UPLC column |
| Proshell 120 EC-C18, 2.1x50 mm | Agilent | 699775-902 | UPLC column |
| Digital microscope | Leica | DHS1000 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Surgical blade | Feather | No. 22 | |
| Scalpel handle | Feather | No. 4 | |
| Savant SpeedVac/Refregerated vapor trap | Thermo Fisher Scientific | SPD111/RVT4104 | vacuum concentrartor |
| Disposable glass tobe (13x100 mm) | IWAKI | 9832-1310 | |
| Sterile petri dish | INA OPTICA | I-90-20 |
References
- Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).
- Skoog, F., Miller, C. O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).
- Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N. Transgenic plants and crops. Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. , CRC Press. Ch. 4 69-84 (2002).
- Teshima, D., Ikeda, K., Satake, M., Aoyama, T., Shimomura, K. Production of emetic alkaloid by in vitro culture of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 278-280 (1988).
- Chatterjee, S. K., Nandi, R. P., Ghosh, N. C. Cultivation and utilixzation of medicinal plants. Regional Research Laboratory, Council of Scientific and Industrial Research. Atal, C. K., Kapur, B. M. , Jammu-Tawi, India. 295-301 (1982).
- Bajaj, Y. P. S. Biotechnology in Agriculture and Forestry 21, Medicinal and Aromatic Plants IV. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 87-103 (1993).
- Ideda, K., Teshima, D., Aoyama, T., Satake, M., Shimomura, K. Clonal propagation of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 288-291 (1988).
- Yoshimatsu, K., Shimomura, K. Efficient shoot formation on internodal segments and alkaloid formation in the regenerates of Cephaelis ipecacuanha A. Richard. Plant Cell Rep. 9 (10), 567-570 (1991).
- Koike, I., Taniguchi, K., Shimomura, K., Umehara, M. Dynamics of endogenous indole-3-acetic acid and cytokinins during adventitious shoot formation in ipecac. J. Plant Growth Regul. , (2017).
- Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50 (1), 151-158 (1968).
- Watad, A. A., et al. Adventitious shoot formation from carnation stem segments: a comparison of different culture procedures. Scientia Hortic. 65 (4), 313-320 (1996).
- Ajithkumar, D., Seeni, S. Rapid clonal multiplication through in vitro axillary shoot proliferation of Aegle marmelos (L.) Corr., a medicinal tree. Plant Cell Rep. 17 (5), 422-426 (1998).
- Tiwari, V., Tiwari, K. N., Singh, B. D. Comparative studies of cytokinins on in vitro propagation of Bacopa monniera. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 66 (1), 9-16 (2001).
- Rao, M. S., Purohit, S. D. In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd. Biol. Plant. 50 (4), 501-506 (2006).
- Sanikhani, M., Frello, S., Serek, M. TDZ induces shoot regeneration in various Kalanchoë blossfeldiana Poelln cultivars in the absence of auxin. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 85 (1), 75-82 (2006).
- Yoshimoto, K., et al. Autophagy negatively regulates cell death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis. Plant Cell. 21 (9), 2914-2927 (2009).
- Schaller, G. E., Bishopp, A., Kieber, J. J. The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development. Plant Cell. 27 (1), 44-63 (2015).
