Summary
Germogli avventizi possono essere indotta su segmenti internodale di ipecac senza trattamento di fitormoni. Per valutare la dinamica di fitormoni durante la formazione di sparo accidentale, abbiamo misurato endogeno dell'auxina e citochinina in segmenti internodale mediante LC-MS/MS.
Abstract
Formazione di sparo accidentale è una tecnica importante per la propagazione delle colture economicamente importanti e per la rigenerazione di piante transgeniche. Trattamento di fitormoni è necessaria per l'induzione di germogli avventizi in maggior parte delle specie. Se possono essere indotta germogli avventizi è determinata dall'equilibrio tra auxine e citochinine (CK) livelli. Molto sforzo va a determinare le concentrazioni ottimale e combinazioni di fitormoni in ogni tessuto utilizzato come espianti e in ogni specie di pianta. In ipecac, tuttavia, germogli avventizi possono essere indotto sui segmenti internodale in terreno di coltura senza trattamento di fitormoni. Questo consente la plasticità intrinseca di ipecac per differenziazione delle cellule deve essere valutata. Per indurre i germogli avventizi in ipecac, abbiamo coltivato internodale segmenti a 24 ° C sotto 15 µmol m− 2 s− 1 di luce in un ciclo di buio luce/10-h 14-h il medium di B5 senza fitormoni solidificato con gomma di gellan 0,2% per 5 settimane. Per studiare dinamiche di fitormoni durante la formazione di sparo accidentale, abbiamo misurato acido di indole-3-acetic endogeno e CKs nei segmenti di liquida cromatografia-spettrometria di massa LC-MS/MS. Questo metodo permette l'analisi di acido di indole-3-acetic endogeno e livelli di CKs in modo semplice. Può essere applicato per studiare le dinamiche di auxina endogena e CK durante l'organogenesi in altre specie vegetali.
Introduction
Gottlieb Haberlandt (1854-1945) ha proposto il concetto di "totipotenza", da quale pianta cellule possono dividere, differenziare e rigenerare le piante intere anche dopo la loro prima differenziazione in tipi cellulari specifici in piante mature1. Nella coltura del tessuto, se pianta rigenerazione può essere indotta o non è determinata dalla combinazione e concentrazione di fitormoni esogenicamente applicate nel mezzo di crescita. Skoog e Miller trovato che germogli avventizi potrebbero essere indotto dal callo di tabacco su terreno di coltura contenente un alto rapporto di CKs di auxine, mentre radici avventizie potrebbero essere indotto su terreno contenente un rapporto basso2. Da tale constatazione, la coltura del tessuto è stato ampiamente utilizzata per la propagazione delle colture economicamente importanti e per la rigenerazione di piante transgeniche3. Germogli avventizi possono essere indotta da tessuti diversi meristema apicale di sparare, come foglie, radici e internodi. Trattamento di fitormoni è necessaria per l'induzione di germogli avventizi nella maggior parte delle specie di piante. Tuttavia, le concentrazioni ottimale e combinazioni differiscono da specie e tra tessuti utilizzati come espianti. Così, molto sforzo va a determinare le concentrazioni ottimale e le combinazioni di fitormoni per esperimenti.
Psychotria ipecacuanha (Brot.) L. Andersson (ipecac) è una pianta medicinale che contiene alcaloidi come la emetine e Cefelina, principalmente in radici4. Gli estratti della radice sono utilizzati come espettorante, emetico e un amoebicide5. Anche se ipecacuana cresce spontaneamente nelle foreste pluviali tropicali del Brasile, è riluttante a impostare semi nella cultura, e il tasso di germinazione diminuisce durante la conservazione del seme in Giappone, con il clima più freddo6. Invece, si propaga dalla coltura del tessuto, in cui avventizi spara formazione su internodi è il più efficiente metodo7,8. Interessante, i germogli avventizi possono essere indotta in questa specie senza fitormoni trattamento8.
Germogli avventizi si formano sull'epidermide della regione apicale della internodale segmenti senza forzatura, ma non nella regione basale9. Questa differenza indica la polarità di tessuto nei segmenti internodale, che è probabilmente ai sensi del regolamento phytohormonal. Il sistema di cultura ipecacuana permette un'occasione unica per analizzare i cambiamenti nei livelli endogeni fitormoni durante la formazione di sparo accidentale. Qui vi presentiamo il nostro metodo per l'analisi dei livelli endogeni di uno auxina (acido indolo-3-acetico (IAA)) e quattro CKs (isopentenyl adenina (iP), isopentenyl adenina riboside (iPR), trans-zeatina (tZ) e trans-zeatin riboside (tZR)) nei segmenti internodale attraverso l'uso di LC-MS/MS.
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Protocol
Nota: Ipecac (c. ipecacuanha) è stato utilizzato in questo studio perché facilita l'analisi dei fitormoni endogeni.
1. crescita condizioni per indurre i germogli avventizi di Ipecac
- Preparare privo di fitormoni B5 supporto regolata a pH 5.710e aggiungere 0,2% gellano. Sterilizzare in autoclave.
- Versare 25 mL di terreno sterilizzato nell'autoclave in una piastra Petri sterile (90 mm × 20 mm).
- Tagliare 8 mm segmenti internodale piantine di ipecacuana usando un bisturi chirurgico con una lama n. 22 su una lastra di acrilico sterile di e posto sul supporto (Figura 1).
- Cultura il medium di B5 senza fitormoni a 24 ° C sotto 15 µmol m− 2 s− 1 di luce in un ciclo di buio luce/10-h 14-h per 5 settimane.
- Identificare le aree ho (apicale) IV (basale) in ogni segmento (Figura 1B). Contare il numero di germogli avventizi > 0,3 mm di lunghezza in ogni regione sotto un microscopio una volta a settimana.
2. estrazione e purificazione di fitormoni
- Mettere una perlina di zirconia di 5 mm in ciascuna delle quattro provette 2 mL del campione.
- Tagliare i segmenti in regioni I a IV (ogni 2 mm di lunghezza) usando un bisturi chirurgico su una lastra di acrilico sterile.
- Raccogliere otto segmenti di ciascuna regione in provette separate (10-30 mg di peso fresco).
- Pesare e quindi bloccare i campioni in azoto liquido.
- Schiacciare i campioni congelati utilizzando un omogeneizzatore basati sul tallone.
- Sospendere i campioni schiacciati in 1 mL acetonitrile contenente 500 pg di ogni standard interno di auxina e CKs (d5-IAA, d5- tZ, d5- tZR, d6- iP, d6- iPR) utilizzando un miscelatore vortex.
- Mantenere a 4 ° C per 1 h, quindi centrifugare a 3.500 × g per 5 min a temperatura ambiente.
- Lavare la pallina in acetonitrile 80% (v/v) contenente acido acetico 1% (v/v). Centrifugare nuovamente a 3.500 × g per 5 min a temperatura ambiente. Combinare i surnatanti (da punti 2.7 e 2.8) in un tubo di vetro monouso.
- Aggiungere 600 µ l acqua che contengono l'acido acetico 1% (v/v) per ogni surnatante combinato ed evaporare l'acetonitrile utilizzando un concentratore a vuoto.
- Equilibrare le cartucce di colonna (HLB) idrofilo-lipofilo-bilanciato applicando 1 mL ciascuno di acetonitrile, metanolo e l'acqua contenente acido acetico 1% (v/v).
- Applicare una soluzione di esempio per cartuccia HLB equilibrato.
- Lavare le cartucce con 1 mL di acqua contenente acido acetico 1% (v/v).
- Eluire tutti gli ormoni con 2 mL 80% (v/v) acetonitrile contenente acido acetico 1% (v/v) in un tubo di vetro.
- Evaporare l'acetonitrile nell'eluito per ottenere l'estratto in acqua contenente acido acetico 1% (v/v) utilizzando un concentratore a vuoto.
Nota: Non si asciughi completamente. - Equilibrare le cartucce di colonna di scambio cationico misto, forte (MCX) applicando 1 mL di metanolo, acetonitrile 1 mL, 0,5 mL 0.1 M HCl e 1 mL di acqua contenente acido acetico 1% (v/v).
- Applicare una soluzione di esempio per cartuccia MCX equilibrato.
- Lavare le cartucce con 1 mL di acqua contenente acido acetico 1% (v/v).
- Eluire IAA con 2 mL 30% (v/v) acetonitrile contenente acido acetico 1% (v/v) in un tubo di vetro.
- Lavare le cartucce con 2 mL 80% (v/v) acetonitrile contenente acido acetico 1% (v/v).
- Lavare le cartucce con 2 mL di acqua e 1 mL di acqua contenente ammoniaca acquosa 5%.
- Eluire il CKs con acetonitrile 60% (v/v) di 2 mL contenente ammoniaca acquosa al 5% in un tubo di vetro.
- Far evaporare il solvente di ogni frazione di ormone utilizzando un concentratore a vuoto e conservare a − 30 ° C fino all'analisi LC-MS/MS.
3. LC-MS/MS analisi di IAA e CKs
- Sciogliere ogni ormone Estratto in una provetta con 600 µ l di metanolo e trasferire la soluzione in un flaconcino di recupero totale del collo a vite. Far evaporare il solvente utilizzando un concentratore a vuoto.
- Sciogliere la frazione di IAA in 20 µ l 30% (v/v) acetonitrile e le frazioni CK in acqua di 20 µ l contenente acido acetico 1% (v/v) in vite collo recupero totale fiale.
- Analizzare i campioni in modalità ioni positivi su un sistema di MS triplo quadrupolo equipaggiato con un sistema HPLC.
Nota: Impostiamo le condizioni HPLC come elencato nella tabella 1.- Per l'eluizione di IAA, usare un gradiente binario di 5% - 50% solvente B in 7 minuti, quindi aumentare di 98% solvente B premuto per 1 min e poi equilibrare per 2 min a solvente B al 5% per iniezione di nido.
- Per l'eluizione di CK, usare un gradiente binario di 2% - 40% solvente B in 5 minuti, 40% - 70% solvente B in 7 min, poi aumentare da 95% solvente B premuto per 1 min e poi equilibrare per 2 min a 2% solvente B di iniezione del nido.
- Impostare l'ionizzazione electrospray (ESI)-MS parametri di sorgente di ioni come elencato nella tabella 2.
- Utilizzare la reazione più monitoraggio transizione (MRM) per la quantificazione di ciascun analita riportato nella tabella 3.
- Quantificare i livelli endogeni di IAA e CK contro una curva standard del rapporto di adenoide deuterio-etichetta standard.
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Representative Results
A 1 settimana dist , germogli avventizi non avevano formato. Alla settimana 2nd , piccoli germogli apparso. Presso i 3rd e 4 settimane dith , il numero di spara aumentato soprattutto nelle regioni apicale (I e II) (Figura 2A). Presso il 5° settimana, il numero di germogli era circa 7 in regione e 5 nella regione II (Figura 2B). Al contrario, solo un paio di tiri sono stato formato nelle regioni III e IV.
Prima cultura, il livello di IAA era leggermente più alto nella regione I (4,1 pg/mg, peso fresco (FW)) che nelle regioni II-IV (~ 2,5 pg/mg FW; Figura 3). A 1 settimana dist , il livello di IAA è aumentato notevolmente in regione IV (11,4 pg/mg FW) ed è diminuito leggermente in regioni-III (1.5-2.2 pg/mg FW). Alla settimana 2nd , il livello di IAA in regione IV è diminuito a ~ 4,4 pg/mg FW, indicando che l'accumulo di IAA nella regione basale era transitoria. Da 5 settimane di cultura, un gradiente di concentrazione di IAA è emerso, con i livelli aumentanti da regione ho della regione IV.
Prima di cultura, c'erano solo i livelli di traccia della maggior parte dei CKs (Figura 3). A 1 settimana dist , il livello di tZR aumentato a 13,8 pg/mg FW nella regione II e a 18,1 pg/mg FW nella regione III. I livelli diminuiti quindi gradualmente oltre 5 settimane di cultura. D'altra parte, i livelli di tZ, iP e iPR ha cambiato solo leggermente durante la coltura.
Figura 1 : Preparazione di ipecac per formazione di sparare avventizi. (A) un segmento internodale (8 mm di lunghezza) è tagliato dalla ipecac rigenerato su un banco pulito. (B), il primo internodo è stato utilizzato per la formazione di sparo accidentale. (C) segmenti sono coltivate su medium di B5 senza fitormoni 25 mL in piastre di Petri per indurre i germogli avventizi. Barra della scala = 1 cm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Distribuzione di avventizi spara formata su un segmento internodale. (A) germogli avventizi formate dopo 0 a 5 settimane di cultura. Barra della scala = 5 mm (B) segmenti sono stati divisi in quattro regioni (I-IV), e il numero di germogli avventizi in ogni regione è stato contato alla settimana 5. Dati sono mezzi ± SEM (n = 3). Dieci segmenti sono stati utilizzati in ogni esperimento. N.F. = non trovato. Questa figura è stata modificata da Koike et al. 9 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Analisi di tempo-corso di fitormoni livelli nei segmenti internodali. I segmenti sono stati separati in quattro regioni (I-IV). Endogeno IAA e CKs (tZ, tZR, iP e diritti di proprietà intellettuale) in ogni regione sono stati quantificati mediante LC-MS/MS. Perché iP e iPR livelli erano molto bassi, un grafico ingrandito è stato inserito all'interno di uno stesso grafico. Dati sono mezzi ± SEM (n = 3). Otto segmenti sono stati utilizzati in ogni esperimento. Questa figura è stata modificata da Koike et al. 9 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Colonna | IAA: ACQUITY BEH C18 φ2.1 × 100 1.7 µm |
| CKs: Poroshell CE-C18 φ2.1 × 50 2.7 µm | |
| Temperatura | -40 º C |
| Fase mobile | R: solvente distillato acqua + 0.05% acido acetico |
| Solvente b: acetonitrile + 0.05% acido acetico | |
| Tasso di flusso | 0,35 ml/min |
| Volume di iniezione | 18 µ l |
Tabella 1: Condizione HPLC nell'analisi di IAA e CK.
| Gas di tenda (a.u.)* | 10 / 40 * * |
| Gas di collisione (a.u.)* | 5 / 3 * * |
| Tensione di spruzzo dello ione (V) | 5500 |
| Temperatura (º c) | 600 |
| Gas di origine dello ione 1 (a.u.)* | 30 |
| Gas di origine dello ione 2 (a.u.)* | 40 / 80 * * |
| Risoluzione | Unità |
Tabella 2: parametri di sorgente di ioni. * unità arbitrarie. * * Analisi di analisi/CK IAA. Questa tabella è stata modificata da Koike et al. 9
| Q1 (m/z) | Q3 (m/z) | Declustering potenziale (V) | Ingresso potenziale (V) | Energia di collisione (V) | |
| IAA | 176 | 130 | 26 | 6.5 | 21 |
| d5-IAA | 181 | 134 | 36 | 4.0 | 23 |
| tZ | 220 | 136 | 36 | 5.0 | 23 |
| d5- tZ | 225 | 137 | 31 | 5.0 | 21 |
| tZR | 352 | 220 | 41 | 5.5 | 23 |
| d5- tZR | 357 | 225 | 51 | 5.0 | 21 |
| iP | 10W | 136 | 31 | 9,0 | 19 |
| d6- iP | 210 | 137 | 31 | 5.5 | 21 |
| diritti di proprietà intellettuale | 336 | 10W | 31 | 5.0 | 21 |
| d6- iPR | 342 | 210 | 36 | 5.5 | 21 |
Tabella 3: transizioni di MRM di IAA e CKs in analisi LC-MS/MS. Questa tabella è stata modificata da Koike et al. 9
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Discussion
Per identificare la distribuzione dei fitormoni coinvolti nell'organogenesi, è importante utilizzare materiali vegetali in cui organogenesi può essere osservato su medium senza fitormoni, poiché quando fitormoni esogenicamente vengono applicati agli espianti per l'induzione germogli o radici, colpiscono l'espianto intero, rendendo difficile valutare la plasticità intrinseca delle piante nella differenziazione cellulare e l'organogenesi. Germogli avventizi possono essere indotta su terreni di coltura privo di fitormoni in altre specie di piante quali Dianthus caryophyllus L.11, Corrêa marmelos di Aegle (L.)12, Bacopa monnieri (L.) Pennell13, Celastrus paniculatus Willd. 14e Kalanchoë blossfeldiana Poelln. 15. sarebbe possibile applicare il protocollo in queste specie di piante.
Abbiamo estratto IAA, tZ, tZR, iP e iPR in acetonitrile e li purificato mediante estrazione in fase solida. Il metodo originale utilizza tre tipi di colonne di cartuccia (HLB, MCX e scambio anionico debole (cera)) perché tutti i fitormoni sono purificato (comprese le gibberelline, acido abscissico, acido jasmonico e acido salicilico)16. La colonna HLB utilizza una polimerica inverso-fase sorbente, la colonna MCX utilizza lo stesso con i gruppi di scambio cationico e la colonna di cera utilizza lo stesso con i gruppi di scambio anionico debole. Il metodo originale eluisce CKs (base) con 60% acetonitrile contenente ammoniaca acquosa su una colonna MCX nel secondo passaggio e quindi IAA (acida) con 80% acetonitrile contenente acido acetico 1% su una colonna di cera nell'ultimo passaggio. Come la nostra attenzione è auxina e CKs, che interagiscono antagonistico di regolare pianta crescita17, il protocollo semplificato utilizza solo le colonne HLB e MCX; IAA è eluito con 30% acetonitrile contenente acido acetico 1% sulla colonna di HLB nel primo passaggio. Ci vogliono due giorni dalla preparazione del campione per analisi LC-MS/MS.
L'acetonitrile non solvente deve essere ad asciugarsi durante la purificazione di fitormoni nelle colonne cartuccia. Se lo fa, risospendere il campione in acetonitrile per impedire i fitormoni di diventare bloccato per il tubo di vetro e perso dal campione. In questo protocollo, il limite di rilevamento con il sistema MS trappola ionica è ~ 10 pg per IAA e CKs da tessuti freschi 10-30 mg. Per analizzare più piccoli importi, sarebbe necessario raccogliere molto più campione o utilizzare MS con maggiore sensibilità.
Analisi di fitormoni sono una tecnica importante per la valutazione della crescita delle piante e lo sviluppo. Utilizzando questo metodo, potremmo riuscire a determinare i tempi di auxina e trattamento CK per formazione di sparo accidentale nella specie vegetali dove la condizione ottimale di cultura è ancora sconosciuta. Come quantificazione di fitormoni diventa sempre più importante, il protocollo di LC-MS/MS qui descritto consentirà l'analisi di campioni di piccole dimensioni con elevata sensibilità e risoluzione. La semplificazione di un metodo precedente faciliterà la purificazione e l'analisi e portare riproducibilità ed elevata versatilità. In futuro, questo metodo può essere applicato per studiare le dinamiche dell'auxina endogena e CK durante l'organogenesi in altre specie vegetali.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Siamo grati al signor Akira Murakami del dipartimento di scienze biologiche applicate, Università Toyo e signor Koudai Taniguchi del Gunma Agricultural Technology Center per la loro assistenza tecnica. Siamo anche grati al Professor Shosaku Kashiwada e Dr. Uma Maheswari Rajagopalan, Toyo University per i loro suggerimenti. Questo studio è stato sostenuto in parte dal centro di ricerca per la vita e scienze ambientali, Università Toyo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [2H5]indole-3-acetic acid | Olchemlm Ltd | 031 1531 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin | Olchemlm Ltd | 030 0301 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin riboside | Olchemlm Ltd | 030 0311 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenine | Olchemlm Ltd | 030 0161 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenosine | Olchemlm Ltd | 030 0171 | Internal standard for LC-MS/MS |
| indole-3-acetic acid | Wako | 098 00181 | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin | SIGMA-ALDRICH | Z0876 5MG | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin riboside | Wako | 262 01081 | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenine | SIGMA-ALDRICH | D7674 1G | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenosine | ACROS ORGANICS | 22648 1000 | standard for LC-MS/MS |
| acetonitrile hypergrade for LC-MS LiChrosolv | MERCK | 1.00029.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| Water for chromatography LiChrosolv | MERCK | 1.15333.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| HPLC | SHIMADZU | Prominence | |
| MS | Sciex | 3200QTRAP | |
| Oasis HLB 30 mg/1 cc | Waters | WAT094225 | cartridge column |
| Oasis MCX 30 mg/1 cc | Waters | 186000252 | cartridge column |
| screw neck total recovery vial | Waters | 186002805 | |
| blue, 12 x 32mm screw neck cap and PTFE/silicone septum | Waters | 186000274 | |
| Acquity UPLC BEH C18, 2.1x100 mm | Waters | 186002350 | UPLC column |
| Proshell 120 EC-C18, 2.1x50 mm | Agilent | 699775-902 | UPLC column |
| Digital microscope | Leica | DHS1000 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Surgical blade | Feather | No. 22 | |
| Scalpel handle | Feather | No. 4 | |
| Savant SpeedVac/Refregerated vapor trap | Thermo Fisher Scientific | SPD111/RVT4104 | vacuum concentrartor |
| Disposable glass tobe (13x100 mm) | IWAKI | 9832-1310 | |
| Sterile petri dish | INA OPTICA | I-90-20 |
References
- Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).
- Skoog, F., Miller, C. O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).
- Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N. Transgenic plants and crops. Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. , CRC Press. Ch. 4 69-84 (2002).
- Teshima, D., Ikeda, K., Satake, M., Aoyama, T., Shimomura, K. Production of emetic alkaloid by in vitro culture of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 278-280 (1988).
- Chatterjee, S. K., Nandi, R. P., Ghosh, N. C. Cultivation and utilixzation of medicinal plants. Regional Research Laboratory, Council of Scientific and Industrial Research. Atal, C. K., Kapur, B. M. , Jammu-Tawi, India. 295-301 (1982).
- Bajaj, Y. P. S. Biotechnology in Agriculture and Forestry 21, Medicinal and Aromatic Plants IV. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 87-103 (1993).
- Ideda, K., Teshima, D., Aoyama, T., Satake, M., Shimomura, K. Clonal propagation of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 288-291 (1988).
- Yoshimatsu, K., Shimomura, K. Efficient shoot formation on internodal segments and alkaloid formation in the regenerates of Cephaelis ipecacuanha A. Richard. Plant Cell Rep. 9 (10), 567-570 (1991).
- Koike, I., Taniguchi, K., Shimomura, K., Umehara, M. Dynamics of endogenous indole-3-acetic acid and cytokinins during adventitious shoot formation in ipecac. J. Plant Growth Regul. , (2017).
- Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50 (1), 151-158 (1968).
- Watad, A. A., et al. Adventitious shoot formation from carnation stem segments: a comparison of different culture procedures. Scientia Hortic. 65 (4), 313-320 (1996).
- Ajithkumar, D., Seeni, S. Rapid clonal multiplication through in vitro axillary shoot proliferation of Aegle marmelos (L.) Corr., a medicinal tree. Plant Cell Rep. 17 (5), 422-426 (1998).
- Tiwari, V., Tiwari, K. N., Singh, B. D. Comparative studies of cytokinins on in vitro propagation of Bacopa monniera. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 66 (1), 9-16 (2001).
- Rao, M. S., Purohit, S. D. In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd. Biol. Plant. 50 (4), 501-506 (2006).
- Sanikhani, M., Frello, S., Serek, M. TDZ induces shoot regeneration in various Kalanchoë blossfeldiana Poelln cultivars in the absence of auxin. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 85 (1), 75-82 (2006).
- Yoshimoto, K., et al. Autophagy negatively regulates cell death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis. Plant Cell. 21 (9), 2914-2927 (2009).
- Schaller, G. E., Bishopp, A., Kieber, J. J. The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development. Plant Cell. 27 (1), 44-63 (2015).
