Summary
Adventivskudd skudd kan bli indusert på internodal segmenter Ipecac uten phytohormone behandling. For å evaluere phytohormone dynamics under adventivskudd skyte formasjon, målte vi endogene auxin og cytokinin i internodal segmenter av LC--MS-/ MS.
Abstract
Adventivskudd skyte formasjon er en viktig teknikk for overføring av økonomisk viktigste avlinger og fornyelse av transgene planter. Phytohormone behandling kreves for induksjon av adventivskudd skudd i de fleste arter. Om adventivskudd skudd kan indusert bestemmes av balansen mellom auxin og cytokinin (CK) nivåer. Mye arbeid går inn å bestemme optimal konsentrasjon og kombinasjoner av phyto-hormoner i hvert vev som explants og i hver plantearter. I ipecac, kan det være indusert imidlertid adventivskudd skudd på internodal segmenter i kultur medium uten phytohormone behandling. Dette gjør at iboende plastisitet Ipecac for celledifferensiering evalueres. For å indusere adventivskudd skudd i ipecac, kultivert vi internodal segmenter på 24 ° C 15 µmol m2 s−1 lys i en 14-h lys/10-h mørke syklus på phytohormone-fri B5 medium befestet med 0,2% gellan tyggegummi i 5 uker. For å undersøke phytohormone dynamics under adventivskudd skyte formasjon, målte vi endogene indol-3-eddiksyre og CKs i segmenter av flytende kromatografi-tandem massespektrometri LC--MS-/ MS. Denne metoden tillater analyse av endogene indol-3-eddiksyre og CKs nivåer på en enkel måte. Den kan brukes for å undersøke dynamikken i endogene auxin og CK under organogenesen i andre plantearter.
Introduction
Gottlieb Haberlandt (1854-1945) foreslo konseptet "totipotency", av hvilke anlegg celler kan dele skille og regenerere hele planter selv etter deres tidligere differensiering inn spesifikke celletyper i eldre planter1. I vev kultur bestemmes om anlegget gjenfødelse kan bli indusert eller ikke av kombinasjonen og konsentrasjonen av exogenously anvendt phyto-hormoner i vekst medium. Skoog og Miller fant at adventivskudd skudd kan bli indusert fra tobakk callus på kultur medium som inneholder en høy andel av CKs til auxins, mens adventivskudd røtter kan bli indusert på medium som inneholder en lav ratio2. Siden at å finne, har vev kultur vært mye brukt for overføring av økonomisk viktigste avlinger og fornyelse av transgene planter3. Adventivskudd skudd kan bli indusert fra vev enn skyte apikal meristem, som blader, røtter og internodes. Phytohormone behandling kreves for induksjon av adventivskudd skudd i de fleste plantearter. Men varierer optimal konsentrasjon og kombinasjoner av arter og vev brukes som explants. Dermed går mye arbeid inn å bestemme optimal konsentrasjon og kombinasjoner av phyto-hormoner for eksperimenter.
Carapichea ipecacuanha (Brot.) L. Andersson (ipecac) er en medisinsk plante som inneholder alkaloider som emetine og cephaeline, hovedsakelig i røtter4. Rot ekstrakt brukes som en slimløsende, et brekkmiddel og en amoebicide5. Ipecac vokser naturlig i de tropiske regnskogene i Brasil, det er motvillig til å angi frø i kultur og spiring prisen synker under seed lagring i Japan, med sin kaldere klima6. I stedet det er overført av vev kultur, som adventivskudd skyte formasjon på internodes er den mest effektive metoden7,8. Interessant, kan adventivskudd skudd bli indusert i denne arten uten phytohormone behandling8.
Adventivskudd skudd er dannet på epidermis i regionen apikale internodal segmenter uten callusing, men ikke i den basale region9. Denne forskjellen angir vev polaritet i internodal segmenter, som sannsynligvis er under phytohormonal forskriften. Ipecac kultur systemet tillater en unik mulighet til å analysere endringer i endogene phytohormone nivåer under adventivskudd skyte formasjon. Her introduserer vi vår metode for analyse av endogene en auxin (indol-3-eddiksyre (IAA)) og fire CKs (isopentenyl adenine (iP), isopentenyl adenine riboside (iPR), trans-zeatin (tZ) og trans-zeatin riboside (tZR)) i internodal segmenter ved hjelp av LC--MS-/ MS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Ipecac (C. ipecacuanha) ble brukt i denne studien fordi det forenkler analyse av endogene phyto-hormoner.
1. vekst forhold å indusere adventivskudd skudd Ipecac
- Forberede phytohormone-fri B5 medium justert til pH 5.710, og legge til 0,2% gellan tyggegummi. Sterilisere av autoklavering.
- Hell 25 mL autoklaveres mediet i et sterilt Petriskål (90 mm × 20 mm).
- Skjær 8 mm internodal segmenter av ipecac plantlets med kirurgisk skalpell med blad nr 22 på en steril akryl plate, og Legg på mediet (figur 1).
- Kultur på phytohormone-fri B5 medium på 24 ° C 15 µmol m2 s−1 lys i en 14-h lys/10-h mørke syklus i 5 uker.
- Identifisere områder jeg (apikale) IV (basale) i hvert segment (figur 1B). Telle antall adventivskudd skudd > 0.3 mm lengde i hver region under et mikroskop ukentlig.
2. utvinning og rensing av phyto-hormoner
- Sette en 5 mm zirconia perle i hver av de fire 2-mL eksempel rørene.
- Skjær segmentene i regioner I til IV (hver 2 mm i lengde) bruker en kirurgisk skalpell på en steril akryl plate.
- Samle åtte segmenter på hvert område i separate eksempel rør (10-30 mg frisk vekt).
- Veier, og deretter fryse prøvene i flytende nitrogen.
- Knuse de frosne prøvene bruker en perle-baserte homogenizer.
- Suspendere knust prøvene i 1 mL acetonitrile som inneholder 500 pg av hver interne standard auxin og CKs (d5-IAA, d5- tZ, d5- tZR, d6- iP, d6- iPR) med en vortex blandebatteri.
- Holde på 4 ° C 1t, så sentrifuge 3500 × g i 5 minutter ved romtemperatur.
- Vask pellet i 80% (v/v) acetonitrile som inneholder 1% (v/v) eddiksyre. Sentrifuger igjen på 3500 × g i 5 minutter ved romtemperatur. Kombinere supernatants (fra trinn 2.7 og 2.8) i disponibel røret.
- Legge til 600 µL vann som inneholder 1% (v/v) eddiksyre til hver kombinert nedbryting og fordampe acetonitrile bruker en vakuum konsentrator.
- Equilibrate hydrofile-lipofile-balansert (HLB) kolonnen patroner ved å bruke 1 mL hver acetonitrile, metanol og vann med 1% (v/v) eddiksyre.
- Bruke en prøve løsning per equilibrated HLB kassett.
- Vask kassetter med 1 mL vann som inneholder 1% (v/v) eddiksyre.
- Elute alle hormoner med 2 mL 80% (v/v) acetonitrile som inneholder 1% (v/v) eddiksyre i røret.
- Fordampe acetonitrile i eluate å få trekke i vann med 1% (v/v) eddiksyre bruker en vakuum konsentrator.
Merk: Ikke tørr dette helt. - Equilibrate fleksible, sterke cation exchange (MCX) kolonnen patroner ved å bruke 1 mL acetonitrile, 1 mL metanol, 0,5 mL 0.1 M HCl og 1 mL vann som inneholder 1% (v/v) eddiksyre.
- Bruke en prøve løsning per equilibrated MCX kassett.
- Vask kassetter med 1 mL vann som inneholder 1% (v/v) eddiksyre.
- Elute IAA med 2 mL 30% (v/v) acetonitrile som inneholder 1% (v/v) eddiksyre i røret.
- Vask kassetter med 2 mL 80% (v/v) acetonitrile som inneholder 1% (v/v) eddiksyre.
- Vask kassetter med 2 mL vann og 1 mL vann som inneholder 5% vandig ammoniakk.
- Elute i CKs med 2 mL 60% (v/v) acetonitrile som inneholder 5% vandig ammoniakk i røret.
- Fordampe løsemiddelet hver hormon brøkdel bruker en vakuum konsentrator og lagre på −30 ° C før analysen LC--MS-/ MS.
3. LC-MS/MS analyse av IAA og CKs
- Oppløse hver hormon ekstrakt i et rør med 600 µL av metanol og overføre løsningen til skruen halsen total utvinning ampuller. Fordampe løsemiddelet bruker en vakuum konsentrator.
- Oppløse IAA brøken i 20 µL 30% (v/v) acetonitrile og CK fraksjoner i 20 µL vann som inneholder 1% (v/v) eddiksyre i skruen halsen total utvinning hetteglass.
- Analysere prøvene i positivt ion modus på en trippel-quadrupole MS systemet utstyrt med en såkalt HPLC-system.
Merk: Vi setter HPLC betingelsene som er oppført i tabell 1.- For IAA tilsettes, bruker en binær gradient 5% - 50% løsemiddel B over 7 min, og øke med 98% løsemiddel B og holde for 1 min, og deretter equilibrate i 2 minutter på 5% løsemiddel B ved reir injeksjon.
- CK tilsettes, bruke en binær stigning på 2% - 40% løsemiddel B over 5 min, 40% - 70% løsemiddel B i 7 min, og øke med 95% løsemiddel B og holde for 1 min, og deretter equilibrate i 2 minutter på 2% løsemiddel B ved neste injeksjon.
- Angi electrospray ionization (ESI)-MS parametere av ion kilde som er oppført i tabell 2.
- Bruk flere reaksjonen overvåking (MRM) overgang for kvantifisering av hver analytt oppført i tabell 3.
- Kvantifisere IAA og CK endogene mot en standard kurve av forholdet mellom umerkede deuterium-merket standarder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
På 1st week, hadde ingen adventivskudd skyter dannet. På 2nd uken, dukket opp små skudd. 3rd og 4th uker, antall skyter økt hovedsakelig i regionene apikale (I og II) (figur 2A). På 5th uken, nummeret av skudd var ca 7 i regionen jeg og 5 i regionen II (figur 2B). Derimot ble bare et par skudd dannet i regioner III og IV.
Før kultur, IAA nivået var litt høyere i regionen I (4.1 pg/mg, frisk vekt (FW)) enn i regioner II-IV (~ 2,5 pg/mg FW; Figur 3). På 1st week, hvilket IAA økte sterkt i region IV (11.4 pg/mg FW) og redusert litt i regioner I-III (1.5-2.2 pg/mg FW). På 2nd uken, IAA nivået i region IV redusert til ~ 4.4 pg/mg FW, indikerer at IAA akkumulering i regionen basale var forbigående. 5 uker av kultur, en IAA konsentrasjon gradient dukket opp, med nivåer øker fra regionen jeg region IV.
Før kultur var det bare sporingsnivåer av de fleste CKs (Figur 3). På 1st week, hvilket tZR økt 13,8 pg/mg FW i regionen II og 18.1 pg/mg FW i region III. Nivåene redusert deretter gradvis over 5 uker kultur. På den annen side, nivåer av tZ, iP og iPR endret bare litt under kultur.
Figur 1 : Forberedelse Ipecac for adventivskudd skyte formasjonen. (A) en internodal segment (8 mm lang) er kuttet fra Spartments ipecac på en ren benk. (B) første internode ble brukt for adventivskudd skyte-formasjonen. (C) segmenter er kultivert på 25 mL phytohormone gratis B5 medium i Petri retter å indusere adventivskudd skudd. Skala bar = 1 cm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Fordeling av adventivskudd skyter dannet en internodal segment. (A) adventivskudd skudd dannet etter 0 til 5 uker kultur. Skala bar = 5 mm. (B) segmenter ble delt i fire regioner (I-IV), og antall adventivskudd skudd i hver region ble regnet på uke 5. Data er betyr ± SEM (n = 3). Ti seksjoner ble brukt i hvert eksperiment. N.F. = ikke funnet. Dette tallet har blitt endret fra Koike et al. 9 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Tid-retters analyse av phytohormone i internodal segmenter. Segmenter ble delt inn i fire regioner (I-IV). Endogene IAA og CKs (tZ, tZR, iP og iPR) i hver region kvantifisert av LC--MS-/ MS. Fordi iP og iPR var svært lav, en zoomet Graf ble satt inn i den samme grafen. Data er betyr ± SEM (n = 3). Åtte segmenter ble brukt i hvert eksperiment. Dette tallet har blitt endret fra Koike et al. 9 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Kolonne | IAA: ACQUITY BEH C18 φ2.1 × 100 1.7 µm |
| CKs: Poroshell EF-C18 φ2.1 × 50 2.7 µm | |
| Temperatur | 40ºC |
| Mobile fase | Løsemiddel A: destillert vann + 0,05% eddiksyre |
| Løsemiddel B: acetonitrile + 0,05% eddiksyre | |
| Gjennomstrømning | 0,35 ml/min |
| Injeksjon volum | 18 µl |
Tabell 1: HPLC tilstand IAA og CK analyse.
| Gardin gass (a.u.)* | 10 / 40 ** |
| Kollisjon gass (a.u.)* | 5 / 3 ** |
| Ion spray spenning (V) | 5500 |
| Temperatur (ºC) | 600 |
| Ion kilde gass 1 (a.u.)* | 30 |
| Ion kilde gass 2 (a.u.)* | 40 / 80 ** |
| Oppløsning | Enhet |
Tabell 2: parametere av ion. * vilkårlig enheter. ** IAA analyse/CK analyse. Denne tabellen er endret fra Koike et al. 9
| Q1 (m/z) | Q3 (m/z) | Declustering potensial (V) | Inngangen potensielle (V) | Kollisjon energi (V) | |
| IAA | 176 | 130 | 26 | 6.5 | 21 |
| d5-IAA | 181 | 134 | 36 | 4.0 | 23 |
| tZ | 220 | 136 | 36 | 5.0 | 23 |
| d5- tZ | 225 | 137 | 31 | 5.0 | 21 |
| tZR | 352 | 220 | 41 | 5.5 | 23 |
| d5- tZR | 357 | 225 | 51 | 5.0 | 21 |
| iP | 204 | 136 | 31 | 9.0 | 19 |
| d6- iP | 210 | 137 | 31 | 5.5 | 21 |
| iPR | 336 | 204 | 31 | 5.0 | 21 |
| d6- iPR | 342 | 210 | 36 | 5.5 | 21 |
Tabell 3: MRM overganger IAA og CKs LC--MS-/ MS analyse. Denne tabellen er endret fra Koike et al. 9
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For å identifisere fordelingen av phyto-hormoner involvert i organogenesen, er det viktig å bruke plantemateriale som organogenesen kan sees på phytohormone-fri medium, fordi når phyto-hormoner, exogenously brukes på explants for induksjon skyter eller røtter, de påvirker det hele explant, noe som gjør det vanskelig å vurdere den iboende plastisitet av celledifferensiering og organogenesen. Adventivskudd skudd kan bli indusert på phytohormone-fri kultur medier i andre plantearter som Dianthus caryophyllus L.11, Aegle marmelos (L.) Correa12, Bacopa monnieri (L.) Pennell13, Celastrus paniculatus planter i slekten Heliotropium. 14og Kalanchoë blossfeldiana Poelln. 15. det ville være mulig å bruke protokollen i disse plantearter.
Vi utdraget IAA, tZ, tZR, iP og iPR i acetonitrile og renset dem ved solid-fase utvinning. Den opprinnelige metoden bruker tre typer patron kolonner (HLB, MCX og svak anion exchange (voks)) fordi alle phyto-hormoner er renset (inkludert gibberellins, abscisic acid, jasmonic syre og Salisylsyre)16. Kolonnen HLB bruker en polymere omvendt-fase absorberende, MCX kolonnen bruker samme med cation exchange grupper, og kolonnen voks bruker samme med svak anion exchange grupper. Den opprinnelige metoden elutes CKs (grunnleggende) med 60% acetonitrile som inneholder vandig ammoniakk en MCX kolonnen i det andre trinnet, og deretter IAA (Sure) med 80% acetonitrile med 1% eddiksyre en voks kolonnen i det siste trinnet. Vårt fokus er auxin og CKs, som samhandle antagonistically for å regulere anlegget vekst17, bruker forenklet protokollen bare HLB MCX kolonnene og; IAA er elut med 30% acetonitrile med 1% eddiksyre på kolonnen HLB i første omgang. Det tar to dager prøve forberedelse til LC--MS-/ MS analyse.
Acetonitrile løsemiddelet skal ikke tillates å tørke ut under phytohormone rensing i kolonnene patron. Fall resuspend prøven i acetonitrile å hindre at de phyto-hormoner bli stakk til glass røret og mistet fra utvalget. I denne protokollen, oppdagelsen grensen med ion-felle MS systemet er ~ 10 pg for IAA og CKs fra 10-30 mg friskt vev. Analysere mindre mengder, ville det være nødvendig å samle mye mer utvalg eller bruke MS med høyere følsomhet.
Phytohormone er en viktig teknikk for vurdering av plantevekst og utvikling. Bruker denne metoden, kunne vi finne tidspunktet for auxin og CK behandling for adventivskudd skyte formasjon i plantearter der optimal kultur betingelsen er fortsatt ukjent. Som phytohormone kvantifisering blir stadig viktigere, kan LC--MS-/ MS protokollen beskrevet her analyse av små utvalg med høy følsomhet og oppløsning. Våre forenkling av en tidligere metode vil rette rensing og analyse, og bringe høy allsidighet og reproduserbarhet. I fremtiden, kan denne metoden brukes for å undersøke dynamikken av endogene auxin og CK under organogenesen i andre plantearter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi er takknemlige til Mr. Akira Murakami av Institutt for anvendt biovitenskap, Toyo University og Mr. Koudai Taniguchi av Gunma Agricultural teknologisenteret for deres kundestøtte. Vi er også takknemlige for Professor Shosaku Kashiwada og Dr. Uma Maheswari Rajagopalan, Toyo universitet for sine forslag. Denne studien var støttes delvis av den Research Center for livet og miljøfag, Toyo University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [2H5]indole-3-acetic acid | Olchemlm Ltd | 031 1531 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin | Olchemlm Ltd | 030 0301 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin riboside | Olchemlm Ltd | 030 0311 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenine | Olchemlm Ltd | 030 0161 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenosine | Olchemlm Ltd | 030 0171 | Internal standard for LC-MS/MS |
| indole-3-acetic acid | Wako | 098 00181 | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin | SIGMA-ALDRICH | Z0876 5MG | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin riboside | Wako | 262 01081 | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenine | SIGMA-ALDRICH | D7674 1G | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenosine | ACROS ORGANICS | 22648 1000 | standard for LC-MS/MS |
| acetonitrile hypergrade for LC-MS LiChrosolv | MERCK | 1.00029.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| Water for chromatography LiChrosolv | MERCK | 1.15333.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| HPLC | SHIMADZU | Prominence | |
| MS | Sciex | 3200QTRAP | |
| Oasis HLB 30 mg/1 cc | Waters | WAT094225 | cartridge column |
| Oasis MCX 30 mg/1 cc | Waters | 186000252 | cartridge column |
| screw neck total recovery vial | Waters | 186002805 | |
| blue, 12 x 32mm screw neck cap and PTFE/silicone septum | Waters | 186000274 | |
| Acquity UPLC BEH C18, 2.1x100 mm | Waters | 186002350 | UPLC column |
| Proshell 120 EC-C18, 2.1x50 mm | Agilent | 699775-902 | UPLC column |
| Digital microscope | Leica | DHS1000 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Surgical blade | Feather | No. 22 | |
| Scalpel handle | Feather | No. 4 | |
| Savant SpeedVac/Refregerated vapor trap | Thermo Fisher Scientific | SPD111/RVT4104 | vacuum concentrartor |
| Disposable glass tobe (13x100 mm) | IWAKI | 9832-1310 | |
| Sterile petri dish | INA OPTICA | I-90-20 |
References
- Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).
- Skoog, F., Miller, C. O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).
- Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N. Transgenic plants and crops. Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. , CRC Press. Ch. 4 69-84 (2002).
- Teshima, D., Ikeda, K., Satake, M., Aoyama, T., Shimomura, K. Production of emetic alkaloid by in vitro culture of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 278-280 (1988).
- Chatterjee, S. K., Nandi, R. P., Ghosh, N. C. Cultivation and utilixzation of medicinal plants. Regional Research Laboratory, Council of Scientific and Industrial Research. Atal, C. K., Kapur, B. M. , Jammu-Tawi, India. 295-301 (1982).
- Bajaj, Y. P. S. Biotechnology in Agriculture and Forestry 21, Medicinal and Aromatic Plants IV. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 87-103 (1993).
- Ideda, K., Teshima, D., Aoyama, T., Satake, M., Shimomura, K. Clonal propagation of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 288-291 (1988).
- Yoshimatsu, K., Shimomura, K. Efficient shoot formation on internodal segments and alkaloid formation in the regenerates of Cephaelis ipecacuanha A. Richard. Plant Cell Rep. 9 (10), 567-570 (1991).
- Koike, I., Taniguchi, K., Shimomura, K., Umehara, M. Dynamics of endogenous indole-3-acetic acid and cytokinins during adventitious shoot formation in ipecac. J. Plant Growth Regul. , (2017).
- Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50 (1), 151-158 (1968).
- Watad, A. A., et al. Adventitious shoot formation from carnation stem segments: a comparison of different culture procedures. Scientia Hortic. 65 (4), 313-320 (1996).
- Ajithkumar, D., Seeni, S. Rapid clonal multiplication through in vitro axillary shoot proliferation of Aegle marmelos (L.) Corr., a medicinal tree. Plant Cell Rep. 17 (5), 422-426 (1998).
- Tiwari, V., Tiwari, K. N., Singh, B. D. Comparative studies of cytokinins on in vitro propagation of Bacopa monniera. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 66 (1), 9-16 (2001).
- Rao, M. S., Purohit, S. D. In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd. Biol. Plant. 50 (4), 501-506 (2006).
- Sanikhani, M., Frello, S., Serek, M. TDZ induces shoot regeneration in various Kalanchoë blossfeldiana Poelln cultivars in the absence of auxin. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 85 (1), 75-82 (2006).
- Yoshimoto, K., et al. Autophagy negatively regulates cell death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis. Plant Cell. 21 (9), 2914-2927 (2009).
- Schaller, G. E., Bishopp, A., Kieber, J. J. The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development. Plant Cell. 27 (1), 44-63 (2015).
