Summary
Des pousses adventives peuvent être induites sur les segments internodales d’ipéca sans traitement phytohormone. Pour évaluer la dynamique phytohormone au cours de la formation de pousses adventives, nous avons mesuré endogène auxine et cytokinine dans des segments internodales par LC-MS/MS.
Abstract
La formation de pousses adventives est une technique importante pour la propagation des cultures d’importance économique et à la régénération de plantes transgéniques. Phytohormone traitement est nécessaire à l’induction des pousses adventives dans la plupart des espèces. Si des pousses adventives peuvent être induites sont déterminée par l’équilibre entre auxine et cytokinine (CK) niveaux. Beaucoup d’efforts va dans la détermination des concentrations optimales et des combinaisons de phytohormones dans chaque tissu utilisé comme explants et dans chacune des espèces végétales. Dans ipecac, toutefois, des pousses adventives peuvent être induites sur internodales segments dans le milieu de culture sans traitement phytohormone. Cela permet la plasticité inhérente d’ipéca pour la différenciation des cellules doit être évaluée. Pour induire des pousses adventives en ipecac, nous cultivées internodales segments à 24 ° C sous 15 µmol m−2 s−1 de lumière dans un cycle de sombre lumière/10 h de 14 h sur un milieu B5 sans phytohormone solidifié avec gomme Gellane 0,2 % pendant 5 semaines. Pour étudier la dynamique phytohormone au cours de la formation de pousses adventives, nous avons mesuré l’acide indole 3-acétique endogène et CKs dans les segments par spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide LC-MS/MS. Cette méthode permet l’analyse de l’acide indole 3-acétique endogène et CKs niveaux de manière simple. Il peut être appliqué afin d’étudier la dynamique de l’auxine endogène et CK pendant l’organogenèse chez d’autres espèces végétales.
Introduction
Gottlieb Haberlandt (1854-1945) a proposé le concept de « totipotence », par quelles plantes cellules peuvent diviser, différencier et régénérer des plantes entières même après leur différenciation préalable en types spécifiques de cellules de plantes matures1. En culture de tissus, si la régénération des plantes peut être induite ou non dépend de la combinaison et la concentration des phytohormones exogènes appliquées dans le milieu de croissance. Skoog et Miller ont constaté que des pousses adventives peuvent être induites de tabac cals sur milieu de culture contenant un taux élevé de CKs d’auxines, tandis que des racines adventives pouvaient être induites sur un milieu contenant un faible ratio2. Depuis cette conclusion, culture de tissus a été largement utilisée pour la propagation des cultures d’importance économique et pour la régénération des plantes transgéniques3. Des pousses adventives peuvent être induites de tissus autres que le méristème apical, tels que des feuilles, des racines et des entre-noeuds. Phytohormone traitement est nécessaire à l’induction des pousses adventives dans la plupart des espèces végétales. Toutefois, les combinaisons et les concentrations optimales diffèrent par espèce et entre les tissus utilisés comme explants. Ainsi, beaucoup d’efforts va en déterminer les concentrations optimales et les combinaisons de phytohormones pour des expériences.
Carapichea ipecacuanha (Brot.) L. Andersson (ipéca) est une plante médicinale qui contient des alcaloïdes tels qu’émétine et Céphéline, surtout dans les racines4. Extraits de racines sont utilisées comme expectorant, émétique et un amoebicide5. Bien que l’ipéca pousse naturellement dans les forêts tropicales du Brésil, il est réticent à mettre les graines dans la culture, et le taux de germination diminue pendant le stockage de semences au Japon, avec son de climat plus froid6. Au lieu de cela, il est propagé par culture de tissus, dans laquelle adventives tirer formation sur entre-noeuds est la plus efficace méthode de7,,8. Fait intéressant, les pousses adventives peuvent être induites chez cette espèce sans phytohormone traitement8.
Des pousses adventives sont forment sur l’épiderme dans la région apicale des segments internodales sans obtention, mais pas dans la région basale9. Cette différence indique les polarités de tissus dans les segments internodales, qui est probablement en vertu du règlement phytohormonal. Le système de culture d’ipéca permet une occasion unique d’analyser les changements dans les niveaux endogènes phytohormone au cours de la formation de pousses adventives. Ici, nous présentons notre méthode pour l’analyse des niveaux endogènes d’une auxine (acide indole 3-acétique (AIA)) et quatre CKs (isopentényl adénine (iP), isopentényl adénine riboside (iPR), trans-zéatine (tZ) et trans-zéatine riboside (tZR)) dans les segments internodales grâce à l’utilisation de CL-SM/SM.
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Protocol
Remarque : Ipéca (c. ipécacuanha) a été utilisée dans cette étude, car elle facilite l’analyse des phytohormones endogènes.
1. croissance Conditions d’induire des pousses adventives d’ipéca
- Préparer un milieu B5 sans phytohormone ajusté à pH 5,710et ajoutez la gomme Gellane 0,2 %. Stériliser à l’autoclave.
- Verser 25 mL de milieu stérilisé dans une boîte de Petri stérile (90 × 20 mm).
- Couper des segments internodales 8 mm de plantules d’ipéca utilisant un scalpel chirurgical avec une lame n ° 22 sur une plaque acrylique stérile et placer sur le support (Figure 1).
- Culture sur un milieu B5 sans phytohormone à 24 ° C sous 15 µmol m−2 s−1 de la lumière dans un cycle de sombre lumière/10 h de 14 h pendant 5 semaines.
- Identifier les régions j’ai (apical) à IV (basal) dans chaque segment (Figure 1B). Compter le nombre de tiges adventives > 0,3 mm de longueur dans chaque région sous un microscope, une fois par semaine.
2. extraction et Purification de Phytohormones
- Mettre un boudin de 5 mm zircone dans chacun des quatre tubes échantillon de 2 mL.
- Couper les segments en régions I à IV (chaque 2 mm de longueur) à l’aide d’un bistouri sur une plaque acrylique stérile.
- Collecter les huit segments de chaque région dans les tubes d’échantillons distincts (10-30 mg de poids frais).
- Peser et puis congeler les échantillons dans l’azote liquide.
- Écraser les échantillons congelés en utilisant un homogénéisateur axée sur le talon.
- Suspendre les échantillons écrasées dans 1 mL d’acétonitrile contenant 500 pg de chaque étalon interne de l’auxine et CKs (d5-IAA, d5- tZ, d5- tZR, d6- iP, d6- droits de propriété intellectuelle) à l’aide d’un agitateur Vortex.
- Maintenez à 4 ° C pendant 1 h, puis centrifuger à 3 500 × g pendant 5 min à température ambiante.
- Laver le culot dans l’acétonitrile de 80 % (v/v) contenant 1 % (v/v) d’acide acétique. Centrifuger à nouveau à 3 500 × g pendant 5 min à température ambiante. Combiner les surnageants (à partir de mesures 2.7 et 2.8) dans un tube de verre jetable.
- Ajouter 600 µL d’eau contenant l’acide acétique 1 % (v/v) pour chaque surnageant combinée et évaporer l’acétonitrile utilisant une pompe à vide.
- Equilibrer les cartouches de colonne (HLB) hydrophile-lipophile-équilibré en appliquant 1 mL d’acétonitrile, méthanol et de l’eau contenant 1 % (v/v) d’acide acétique.
- Appliquer une solution de l’échantillon par cartouche HLB équilibré.
- Laver les cartouches avec 1 mL d’eau contenant 1 % (v/v) d’acide acétique.
- Éluer les hormones avec 2 mL d’acétonitrile 80 % (v/v) contenant 1 % (v/v) d’acide acétique dans un tube de verre.
- Évaporer l’acétonitrile dans l’éluat pour obtenir l’extrait dans l’eau contenant 1 % (v/v) d’acide acétique à l’aide d’une pompe à vide.
Remarque : Ne pas sécher cela complètement. - Equilibrer les cartouches colonne échangeuse de cations en mode mixte, forte (MCX) en appliquant 1 mL d’acétonitrile, 1 mL de méthanol, 0,5 mL HCl 0,1 de M et 1 mL d’eau contenant 1 % (v/v) d’acide acétique.
- Appliquer une solution de l’échantillon par cartouche MCX équilibré.
- Laver les cartouches avec 1 mL d’eau contenant 1 % (v/v) d’acide acétique.
- Éluer IAA avec 2 mL d’acétonitrile 30 % (v/v) contenant 1 % (v/v) d’acide acétique dans un tube de verre.
- Laver les cartouches avec 2 mL d’acétonitrile 80 % (v/v) contenant 1 % (v/v) d’acide acétique.
- Laver les cartouches avec 2 mL d’eau et 1 mL d’eau contenant de l’ammoniaque aqueuse de 5 %.
- Éluer les CKs avec 2 mL d’acétonitrile 60 % (v/v) contenant de l’ammoniaque aqueuse 5 % dans un tube de verre.
- Laisser évaporer le solvant de chaque fraction de l’hormone à l’aide d’une pompe à vide et conserver à −30 ° C jusqu'à l’analyse de LC-MS/MS.
3. LC-MS/MS analyse des IAA et CKs
- Dissoudre chaque extrait d’hormone dans un tube contenant 600 µL de méthanol et transvaser la solution dans un flacon de récupération totale de cou de vis. Laisser évaporer le solvant à l’aide d’une pompe à vide.
- Dissoudre la fraction IAA dans 20 µL 30 % (v/v) d’acétonitrile et les fractions CK dans 20 µL eau contenant 1 % (v/v) d’acide acétique à vis récupération totale flacons.
- Analyse des échantillons en mode ion positif sur un système de MS triple-quadrupôle équipé d’un système HPLC.
NOTE : Nous avons mis les conditions CLHP comme indiqué au tableau 1.- Pour l’élution de l’IAA, utiliser un gradient binaire de 5 à 50 % de solvant B plus de 7 minutes, puis augmenter de 98 % de solvant B pendant 1 min et ensuite équilibrer pendant 2 min à 5 % de solvant B par injection de nid.
- Pour l’élution de la CK, utiliser un gradient binaire de 2 % - 40 % solvant B pendant 5 min, 40-70 % de solvant B à 7 min, puis augmenter de 95 % de solvant B maintenez pendant 1 min et ensuite équilibrer pendant 2 min à 2 % de solvant B par injection de nidification.
- Définir l’ionisation par électrospray (ESI)-MS des paramètres de la source d’ions énumérés au tableau 2.
- Utiliser la réaction multiples surveillance passage (MRM) pour la quantification de chaque analyte énuméré au tableau 3.
- Quantifier les taux endogènes de IAA et CK contre une courbe d’étalonnage du ratio de sans étiquette aux normes marqués au deutérium.
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Representative Results
À la 1st semaine, aucun des pousses adventives n’avaient formé. À la 2ème semaine, petites pousses sont apparus. À la 3rd et 4ème semaines, le nombre de pousses accru pour la plupart dans les régions apicales (I et II) (Figure 2A). À la 5e semaine, le nombre de pousses était approximativement 7 en région I et 5 dans la région II (Figure 2B). En revanche, seulement quelques pousses ont été formés dans les régions III et IV.
Avant la culture, le niveau de l’IAA était légèrement plus élevé dans la région I (4,1 pg/mg, poids frais (FW)) que dans les régions II-IV (~ 2,5 pg/mg FW ; La figure 3). Lors de la 1 semaine dest , le niveau de IAA a augmenté considérablement dans la région IV (11,4 pg/mg FW) et légèrement diminué dans les régions I à III (1,5-2,2 pg/mg FW). Lors de la 2ème semaine, le niveau de l’IAA en région IV a diminué à ~ 4,4 pg/mg FW, indiquant que l’accumulation des IAA dans la région basale est transitoire. 5 semaines de culture, un gradient de concentration des IAA a émergé, avec niveaux passant région I à IV de la région.
Avant la culture, il y avait seulement des traces de plupart CKs (Figure 3). Lors de la 1 semaine dest , le niveau de tZR passé à 13,8 pg/mg FW en région II et à 18,1 pg/mg FW dans la région III. Ensuite, les niveaux ont diminué graduellement plus de 5 semaines de culture. En revanche, les niveaux de tZ, propriété intellectuelle et droits de propriété intellectuelle seulement légèrement changé au cours de la culture.
Figure 1 : Préparation d’ipéca pour la formation de pousses adventives. (A) un segment internodale (8 mm de long) est extrait d’ipéca régénérée sur un banc propre. (B) le premier entre-nœud a été utilisé pour la formation de pousses adventives. (C) Segments sont cultivés sur un milieu B5 de la phytohormone sans 25 mL en boîtes de Pétri pour induire des pousses adventives. Echelle = 1 cm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Distribution des adventices pousses formée sur un segment internodale. (A) des pousses adventives formés après 0 à 5 semaines de culture. Echelle = 5 mm. (B) Segments ont été répartis dans quatre régions (I-IV), et le nombre de pousses adventives dans chacune des régions a été compté à la semaine 5. Les données sont des moyens ± SEM (n = 3). Dix segments ont été utilisés pour chaque expérience. N.F. ne = pas trouvΘ. Ce chiffre a été modifié par Koike et al. 9 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Analyse temporelle des niveaux phytohormone dans les segments internodales. Segments ont été séparés en quatre régions (I à IV). AIA endogène et CKs (tZ, tZR, propriété intellectuelle et droits de propriété intellectuelle) dans chaque région ont été quantifiés par LC-MS/MS. Parce que les niveaux de propriété intellectuelle et droits de propriété intellectuelle étaient très faibles, un graphique avec zoom a été inséré à l’intérieur du même graphique. Les données sont des moyens ± SEM (n = 3). Huit segments ont été utilisés pour chaque expérience. Ce chiffre a été modifié par Koike et al. 9 S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Colonne | IAA : ACQUITY BEH C18 φ2.1 × 100 1,7 µm |
| CKs : Poroshell EC-C18 φ2.1 × 50 2,7 µm | |
| Température | 40 ° C |
| Phase mobile | Solvant A: distillée eau + 0,05 % d’acide acétique |
| Solvant B: acétonitrile + 0,05 % d’acide acétique | |
| Vitesse d’écoulement | 0,35 ml/min |
| Volume d’injection | 18 µl |
Tableau 1 : Condition HPLC analyse IAA et CK.
| Gaz de Rideau (a.u.)* | 10 / 40 ** |
| Gaz de collision (a.u.)* | 5 / 3 ** |
| Tension de pulvérisation ionique (V) | 5500 |
| Température (° c) | 600 |
| Gaz de source ion 1 (a.u.)* | 30 |
| Gaz de source ion 2 (a.u.)* | 40 / 80 ** |
| Résolution | Unité |
Tableau 2 : paramètres de la source d’ions. * les unités arbitraires. ** Analyse d’analyse/CK IAA. Ce tableau a été modifié par Koike et al. 9
| Q1 (m/z) | T3 (m/z) | Potentiel declustering (V) | Entrée potentielle (V) | Énergie de collision (V) | |
| IAA | 176 | 130 | 26 | 6.5 | 21 |
| d5-IAA | 181 | 134 | 36 | 4.0 | 23 |
| tZ | 220 | 136 | 36 | 5.0 | 23 |
| d5- tZ | 225 | 137 | 31 | 5.0 | 21 |
| tZR | 352 | 220 | 41 | 5.5 | 23 |
| d5- tZR | 357 | 225 | 51 | 5.0 | 21 |
| propriété intellectuelle | 204 | 136 | 31 | 9.0 | 19 |
| d6- iP | 210 | 137 | 31 | 5.5 | 21 |
| droits de propriété intellectuelle | 336 | 204 | 31 | 5.0 | 21 |
| d6- droits de propriété intellectuelle | 342 | 210 | 36 | 5.5 | 21 |
Tableau 3 : transitions MRM d’IAA et CKs analyse LC-MS/MS. Ce tableau a été modifié par Koike et al. 9
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Discussion
Pour identifier la distribution des phytohormones impliqués dans l’organogenèse, c’est important d’utiliser des matières végétales dans lesquelles organogenèse peut être observé sur un milieu sans phytohormone, parce que quand les phytohormones sont appliqués exogène d’explants pour induire tiges ou racines, ils affectent l’explant entier, rendant difficile d’évaluer la plasticité inhérente des plantes dans la différenciation cellulaire et l’organogénèse. Des pousses adventives peuvent être induites sur milieux de culture sans phytohormone chez d’autres espèces végétales telles que Corrêa Aegle marmelos (L.)12, Dianthus caryophyllus L.11, , Pennell Bacopa monnieri (L.)13 Celastrus paniculatus Willd. 14et Kalanchoë blossfeldiana Poelln. 15. il serait possible d’appliquer le protocole de ces espèces de plantes.
Nous avons extrait IAA, tZ, tZR, propriété intellectuelle et droits de propriété intellectuelle dans l’acétonitrile et eux purifié par extraction en phase solide. La méthode originale utilise trois types de colonnes de la cartouche (HLB, MCX et échange d’anions faibles (cire)) car tous les phytohormones sont purifiées (y compris les gibbérellines, acide abscissique, acide salicylique et l’acide jasmonique)16. La colonne HLB utilise polymériques une phase inverse sorbant, la colonne MCX utilise le même avec des groupes d’échange cationique et la colonne de cire utilise le même avec des groupes d’échange d’anions faibles. La méthode originale élué CKs (base) avec 60 % d’acétonitrile contenant de l’ammoniaque aqueuse sur une colonne MCX dans la deuxième étape, puis IAA (acide) avec 80 % d’acétonitrile contenant 1 % d’acide acétique sur une colonne de cire dans la dernière étape. Comme notre objectif est l’auxine et CKs, qui interagissent antagoniste de réglementer la plante croissance17, le protocole simplifié utilise uniquement les colonnes HLB et MCX ; IAA est élué avec 30 % d’acétonitrile contenant 1 % d’acide acétique sur la colonne HLB dans la première étape. Il faut deux jours de préparation des échantillons pour analyse LC-MS/MS.
Le solvant de l’acétonitrile ne puissent pas se dessécher durant la purification phytohormone dans les colonnes de la cartouche. Dans l’affirmative, remettre en suspension l’échantillon dans l’acétonitrile pour empêcher les phytohormones de devenir collée sur le tube en verre et perdu de l’échantillon. Dans ce protocole, la limite de détection avec le système de SM-piège à ions est ~ 10 pg pour les IAA et CKs de tissus frais de 10 à 30 mg. Pour analyser des quantités plus faibles, il serait nécessaire de recueillir des échantillons beaucoup plus ou MS avec une sensibilité plus élevée.
Analyse de phytohormone est une technique importante pour l’évaluation de la croissance des plantes et le développement. En utilisant cette méthode, nous pourrions être en mesure de déterminer le moment de l’auxine et traitement CK pour la formation de pousses adventives en espèces végétales où les conditions de culture optimales sont encore inconnue. Comme quantification phytohormone devient de plus en plus importante, le LC-MS/MS le protocole décrit ici permettra l’analyse de petits échantillons avec résolution et haute sensibilité. Notre simplification d’une méthode précédente facilitera la purification et l’analyse et apportent la reproductibilité et la grande polyvalence. À l’avenir, cette méthode peut être appliquée afin d’étudier la dynamique de l’auxine endogène et CK pendant l’organogenèse chez d’autres espèces végétales.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêt.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants à M. Akira Murakami, du département de Biosciences appliquées, Université de Toyo et M. Koudai Taniguchi de l’Agricultural Technology Center de Gunma pour leur assistance technique. Nous sommes également reconnaissants au professeur Shosaku Kashiwada et Dr Uma Maheswari Rajagopalan, Université Toyo pour leurs suggestions. Cette étude a été financée en partie par le centre de recherche pour la vie et Sciences de l’environnement, l’Université Toyo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [2H5]indole-3-acetic acid | Olchemlm Ltd | 031 1531 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin | Olchemlm Ltd | 030 0301 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin riboside | Olchemlm Ltd | 030 0311 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenine | Olchemlm Ltd | 030 0161 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenosine | Olchemlm Ltd | 030 0171 | Internal standard for LC-MS/MS |
| indole-3-acetic acid | Wako | 098 00181 | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin | SIGMA-ALDRICH | Z0876 5MG | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin riboside | Wako | 262 01081 | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenine | SIGMA-ALDRICH | D7674 1G | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenosine | ACROS ORGANICS | 22648 1000 | standard for LC-MS/MS |
| acetonitrile hypergrade for LC-MS LiChrosolv | MERCK | 1.00029.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| Water for chromatography LiChrosolv | MERCK | 1.15333.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| HPLC | SHIMADZU | Prominence | |
| MS | Sciex | 3200QTRAP | |
| Oasis HLB 30 mg/1 cc | Waters | WAT094225 | cartridge column |
| Oasis MCX 30 mg/1 cc | Waters | 186000252 | cartridge column |
| screw neck total recovery vial | Waters | 186002805 | |
| blue, 12 x 32mm screw neck cap and PTFE/silicone septum | Waters | 186000274 | |
| Acquity UPLC BEH C18, 2.1x100 mm | Waters | 186002350 | UPLC column |
| Proshell 120 EC-C18, 2.1x50 mm | Agilent | 699775-902 | UPLC column |
| Digital microscope | Leica | DHS1000 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Surgical blade | Feather | No. 22 | |
| Scalpel handle | Feather | No. 4 | |
| Savant SpeedVac/Refregerated vapor trap | Thermo Fisher Scientific | SPD111/RVT4104 | vacuum concentrartor |
| Disposable glass tobe (13x100 mm) | IWAKI | 9832-1310 | |
| Sterile petri dish | INA OPTICA | I-90-20 |
References
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