Summary
不定芽は、植物ホルモン治療せずトコンの節間のセグメントに誘導できます。不定芽形成過程における植物ホルモンの動態を評価するには、MS LC/MS による節セグメントにおける内生オーキシンとサイトカイニンを測定しました。
Abstract
不定芽形成は経済的に重要な作物の普及のため、遺伝子組換え植物の再生に重要な手法です。植物ホルモン処理は、ほとんどの種の不定芽の誘導に必要です。オーキシンとサイトカイニン (CK) 間のバランスによって決定されます不定芽を誘発することができるかどうかのレベル。多くの努力は、最適な濃度と外植片として使用される各組織、各植物は植物ホルモンの組み合わせを決定するのに入ります。ただし、トコンは培植物ホルモン治療なしで節間のセグメントに不定芽を誘導することができます。これは評価する細胞分化のトコンの固有の可塑性をことができます。トコンの不定芽を誘導して、5 週間 0.2% ジェランガムで凝固した植物ホルモン無料 B5 培地で 14 h/10 h の光暗いサイクルで 15 µmol m− 2の− 1光の下の 24 の ° C で節間のセグメントを培養しました。不定芽形成過程における植物ホルモンの動態を調査するには、計測における内生インドール-3 - 酢酸及び CKs セグメント液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法クロマトグラフィー-タンデム質量による。このメソッドは、単純な方法で解析における内生インドール-3 - 酢酸の CKs レベルをできます。それは、他の植物の器官の中に内生オーキシンと CK のダイナミクスを調べるに適用できます。
Introduction
ゴットリーブ Haberlandt (1854-1945 年) は、「全能性」、ことができます細胞植物によって分割、区別し大株1で特定の細胞型に分化させ事前後も全植物体を再生の概念を提案しました。組織培養、植物体再生を誘起することまたはないかどうか、組み合わせと成長培地におけるジベレリンの植物ホルモンの濃度によって決まります。培とミラーは、不定根が低比2を含む培地に誘導することが一方 CKs とオーキシンの高い比率を含む培養液中でタバコ由来カルスから不定芽を誘導することが発見しました。その発見以来組織培養行われている遺伝子組換え植物3の再生、経済的に重要な作物の伝播のため。不定芽は、茎頂、葉、根、茎など以外の組織から誘導することができます。植物ホルモン処理は、ほとんどの植物種の不定芽の誘導に必要です。ただし、最適濃度との組み合わせは異なる種と組織外植片として使用中です。したがって、多くの努力は、最適な濃度と植物ホルモンの実験のための組み合わせを決定するのに入ります。
トコン(Brot。)L. アンダーソン (トコン) は、エメチンと根4を中心に、セファエリンなどのアルカロイドが含まれている薬用植物です。ルート エキス、amoebicide5嘔吐、去痰薬として使用されます。トコンは、ブラジルの熱帯雨林に自生、文化では、種子を設定するには消極的だし、寒い気候6を使って、日本の種子貯蔵中に発芽率が低下します。代わりに、組織培養からの伝播が、撮影する不定節の形成は最も効率的な方法7,8。興味深いことに、植物ホルモン治療8なしこの種の不定芽を誘起することができます。
不定芽は、基底部9ではなく親、なし節セグメントの根尖部に表皮に形成されます。この違いは、おそらく ∼ 規制下にある節セグメントで組織の極性を示します。トコン文化システムにより、不定芽形成の間に内生植物ホルモン レベルの変化を分析するユニークな機会です。ここで 1 つオーキシン (インドール-3-酢酸酢酸 (IAA)) と 4 つの CKs の内因性レベルの解析の手法を紹介 (イソペンテニル アデニン (iP)、イソペンテニル アデニン ゼアチンリボシド (iPR)、トランス-ゼアチン (tZ) とトランス-ゼアチンリボシド (最も息))LC ・ MS/MS を使用して節間のセグメント。
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Protocol
注: 内因性ホルモンの分析を容易にするため、トコン (C. トコン) はこの研究で使用されました。
1 トコンの不定芽を誘発する成長条件
- PH 5.710、調整無料の植物ホルモンの B5 培地を準備し、0.2% ジェランガムを追加します。オートクレーブに入れることによって殺菌しなさい。
- オートクレーブの中の 25 mL を滅菌シャーレ (90 × 20 mm) に注ぐ。
- 手術のメスを用いた滅菌アクリル板に刃号 22 トコン苗木の 8 mm 節セグメントを切り取り、媒体 (図 1)。
- 15 µmol m− 2の− 1 5 週間 14 h/10 h の光暗いサイクルの光の下の 24 の ° C で植物ホルモン無料 B5 培地で培養。
- 地域を識別する私 (根尖部) から IV (基底) の各セグメント (図 1B)。週に一度顕微鏡下で地域ごとに不定芽 > 0.3 mm 長さの数をカウントします。
2. 抽出と植物ホルモンの精製
- それぞれ 4 つの 2 mL のサンプル チューブの 5 mm ジルコニア ビーズを入れてください。
- セグメントを切る地域 IV (各 2 mm 長さ) 滅菌アクリル板に手術のメスを使用します。
- 別のサンプル チューブ (10-30 mg の新鮮な重量) の各地域の 8 つのセグメントを収集します。
- 量る、そして液体窒素でサンプルを凍結します。
- ビーズ ベースのホモジナイザーを用いた凍結試料を粉砕します。
- オーキシンの各内部標準の 500 pg 及び CKs (d5独立行政法人、d5tZ、d5最も息、6d iP、d6知的財産権) を含む 1 mL のアセトニ トリルに押しつぶされたサンプルを中断渦のミキサーを使用しています。
- 室温で 5 分間 3,500 × gで遠心分離後 1 h、4 ° C で保持します。
- 1% (v/v) 酢酸を含む 80% (v/v) アセトニ トリルでペレットを洗浄します。3,500 × gで再度遠心して、室温で 5 分間。(手順 2.7 および 2.8) から使い捨てのガラス管の培養上清を組み合わせます。
- 追加 600 μ L 各複合培養上清に含まれる 1% (v/v) 酢酸を水し、真空濃縮を用いたアセトニ トリルを蒸発させます。
- アセトニ トリル、メタノール、および 1% (v/v) 酢酸を含む水の各 1 mL を適用することによって、親水性・親油性-バランス (HLB) 列カートリッジを平衡します。
- 平衡の HLB カートリッジあたり 1 つのサンプル ソリューションを適用します。
- 1% (v/v) 酢酸を含む水を 1 mL でカートリッジを洗浄します。
- ガラス管に 1% (v/v) 酢酸を含む 2 mL 80% (v/v) アセトニ トリルのすべてのホルモンを溶出します。
- 取得真空濃縮を使用して 1% (v/v) 酢酸を含む水で抽出する溶出液にアセトニ トリルを蒸発させます。
注: は、これを完全に乾燥しないでください。 - 混合モードでは、強い陽イオン交換 (MCX) 列カートリッジを 0.5 mL、1 mL のメタノール 1 mL のアセトニ トリルを適用することによって平衡 0.1 M HCl と 1% (v/v) 酢酸を含む水を 1 mL。
- 平衡の MCX カートリッジあたり 1 つのサンプル ソリューションを適用します。
- 1% (v/v) 酢酸を含む水を 1 mL でカートリッジを洗浄します。
- IAA をガラス管に 1% (v/v) 酢酸を含む 2 mL 30% (v/v) アセトニ トリルで溶出します。
- 1% (v/v) 酢酸を含む 2 mL 80% (v/v) アセトニ トリルでカートリッジを洗浄します。
- 2 mL の水と 5% アンモニア水を含む水を 1 mL のカートリッジを洗ってください。
- ガラス管にアンモニア水 5% を含む 2 mL 60% (v/v) アセトニ トリル、CKs を溶出します。
- 真空濃縮を使用して各ホルモンの分画の溶剤を蒸発し、クロマトグラフィー-タンデム質量分析まで +30 ° C で保存します。
3 独立行政法人及び CKs の LC ・ MS/MS 分析
- メタノールの 600 μ L で管内各ホルモン エキスを溶解し、ソリューションをねじ首総復旧時バイアルに転送します。真空濃縮を使用して溶媒を蒸発させます。
- 20 μ L 30% (v/v) アセトニ トリル中で IAA 分数と CK 分数スクリューバイアル首総復旧時の 1% (v/v) 酢酸を含む 20 μ L の水に溶解します。
- 高速液体クロマトグラフィー システムを搭載したトリプル四重極 MS システムで肯定的なイオン モードでサンプルを分析します。
注: 我々 は、表 1に記載されている HPLC 条件を設定します。- IAA 溶出の 5%-50% 溶剤 B 7 分以上のバイナリのグラデーションを使用し、98% 溶剤 B 増し、1 分間保持巣注入による 5% 溶剤 B で 2 分間、平衡します。
- CK 溶出 2-40% 溶剤 B 5 分以上 7 分で 40-70% 溶剤 B のバイナリのグラデーションを使用し、95% 溶剤 B 増し、1 分間保持によって 2% 溶剤 B で 2 分間、平衡注入を入れ子にします。
- エレクトロ スプレー イオン化 (ESI) を設定-MSの表 2に掲げるイオン源のパラメーター。
- 複数の反応 (MRM) 遷移表3 各試料の定量化のための監視を使用します。
- 重水素標識基準にラベルの比の標準曲線に対して内因性 IAA と CK のレベルを定量化します。
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Representative Results
1st週不定芽が形成ないです。2nd週間で小さな芽が登場しました。3rdと 4th週間、数シュート頂端領域 (I および II) を中心に増加 (図 2A)。5 週目で番号シュートの地域であった約 7 で私と 5 地域 II (図 2B)。対照的に、いくつかの撮影だけは III と IV の地域で形作られました。
文化の前に IAA レベルだった地域でわずかに高い私 (4.1 pg ユニット/mg, 生体重 (FW)) より地域 II 〜 IV (〜 2.5 pg/mg FW;図 3)。1st週 IAA 含量増加地域 iv (11.4 pg/mg FW) と領域 III (1.5 2.2 pg/mg FW)、幾分低下しました。地域 IV の IAA 含量が減少 2nd週 〜 4.4 pg/mg FW、IAA 基底部に蓄積した非定常であることを示します。文化の 5 週間は、第四地域に地域から私の増加レベルで、IAA 濃度勾配が現れた。
文化の前にほとんど CKs (図 3) のトレース レベルのみがあった。1st週で最も息レベル改善 13.8 pg/mg 領域 II で FW と 18.1 pg/mg 地域 III の FW になりました。レベルには、文化の 5 週間で徐々 にその後減少しました。その一方で、tZ、iP、および知的財産権のレベルが少ししか変更されて培養中。
図 1: トコンの不定芽形成のための準備。節間のセグメント (長さ 8 mm) は、クリーン ベンチを再生トコンからカット、(A)。(B) 第 1 節間は不定芽形成に使われました。(C) セグメントが不定芽を誘発するシャーレで 25 mL 植物ホルモン無料 B5 培地で培養しました。スケール バー = 1 cm.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 不定の分布撮影節セグメント上に形成されたします。(A) 不定芽が文化の 0 〜 5 週間後に形成されました。スケール バー 5 mm. (B) = (I-iv)、4 つの地域に分割されたセグメントと各地域における不定芽の数が 5 週目で数えられました。データは、平均 ± SEM (n = 3)。10 セグメントは、各実験で使用されました。N. f. = 見つかりません。この図は、小池らから変更されています。9この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 節セグメントにおける植物ホルモン レベルの経時的検討します。セグメントは、4 つの地域 (- 4 世) に分かれていた。内生 IAA および各地域の CKs (tZ、最も息、iP、および知的財産権) は、MS LC/MS による定量化されました。IP と知的財産権のレベルが非常に低い、拡大グラフは、同じグラフ内挿入されました。データは、平均 ± SEM (n = 3)。8 つのセグメントは、各実験で使用されました。この図は、小池らから変更されています。9この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 列 | 独立行政法人: ACQUITY BEH C18 φ2.1 × 100 1.7 μ m |
| CKs: Poroshell EC C18 φ2.1 × 50 2.7 μ m | |
| 温度 | 40 ° C |
| 移動相 | A: 溶剤蒸留水 + 0.05% 酢酸 |
| 溶剤 b: アセトニ トリル + 0.05% 酢酸 | |
| 流量 | 0.35 ml/分 |
| 注入量 | 18 μ l |
IAA と CK 分析表 1: 高速液体クロマトグラフィー条件。
| カーテン ガス (a.u.)* | 10/40 * * |
| 衝突ガス (a.u.)* | 5/3 * * |
| イオン スプレー電圧 (V) | 5500 |
| 温度 (° C) | 600 |
| イオン ソース ガス 1 (a.u.)* | 30 |
| イオン ソース ガス 2 (a.u.)* | 40/80 * * |
| 解像度 | ユニット |
表 2: イオン源のパラメーターです。* 任意の単位。* * IAA の解析/CK 分析。このテーブルは、小池らから変更されています。9
| 第 1 四半期 (m/z) | 第 3 四半期 (m/z) | デクラスタ リング電位 (V) | 潜在的な入り口 (V) | 衝突エネルギー (V) | |
| 独立行政法人 | 176 | 130 | 26 | 6.5 | 21 |
| d5独立行政法人 | 181 | 134 | 36 | 4.0 | 23 |
| tZ | 220 | 136 | 36 | 5.0 | 23 |
| d5tZ | 225 | 137 | 31 | 5.0 | 21 |
| 最も息 | 352 | 220 | 41 | 5.5 | 23 |
| d5最も息 | 357 | 225 | 51 | 5.0 | 21 |
| iP | 204 | 136 | 31 | 9.0 | 19 |
| 6d iP | 210 | 137 | 31 | 5.5 | 21 |
| 知的財産権 | 336 | 204 | 31 | 5.0 | 21 |
| d6知的財産権 | 342 | 210 | 36 | 5.5 | 21 |
テーブル 3: クロマトグラフィー-タンデム質量分析の IAA および CKs の MRM 遷移。このテーブルは、小池らから変更されています。9
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Discussion
植物ホルモンの分布を識別するために器官形成に関与することが重要です植物ホルモンを誘導するための植に外に適用されるため、器官形成植物ホルモン フリー培地で観察できる植物材料を使用枝や根、細胞分化と器官形成における植物の固有の可塑性を評価するが難しく、全体外植体に影響します。カーネーション・ l ・11、エグレ marmelos (l.) Corrêa12、オトメアゼナ(l.) 事業13、など他の植物種の植物ホルモン自由な文化媒体の不定芽を誘起することツルウメモドキ paniculatusアマランサス。14、およびKalanchoë 対新。15. これらの植物種のプロトコルに適用することが可能でしょう。
独立行政法人、tZ、最も息、iP、およびアセトニ トリル中で知的財産権を抽出し、固相抽出によってそれらを精製しました。元のメソッドは、すべての植物ホルモン、ジベレリン、アブシジン酸、ジャスモン酸とサリチル酸) (を含む精製16 のためカートリッジ列 (HLB、MCX、弱陰イオン交換 (ワックス)) の 3 種類を使用します。HLB 列高分子逆相吸着剤を使用して、MCX 列は陽イオン交換グループと同じを使用して、ワックス列は弱陰イオン交換グループと同じを使用します。元のメソッドは、2 番目のステップの MCX 列にアンモニアを含む 60% アセトニ トリル (基本) CKs とし、最後のステップでイチ押しの 1% の酢酸を含む 80% アセトニ トリル (酸性) 独立行政法人をた。私たちの焦点は、オーキシンと拮抗植物成長17を規制する対話、CKs 簡易プロトコル使用 HLB と MCX 列のみが対象。IAA は最初のステップで HLB 列に 1% の酢酸を含む 30% アセトニ トリル溶離されます。クロマトグラフィー-タンデム質量分析するサンプル準備から 2 日ほどかかります。
植物ホルモン精製カートリッジ列で中を乾燥させる、アセトニ トリル溶媒はできません。場合は、再懸濁しますサンプル、植物ホルモンを防ぐをアセトニ トリル中でガラス管に固執し、サンプルから失われました。このプロトコルでは、イオン トラップ MS システムで検出限界が 〜 IAA の 10-30 mg の新鮮な組織から CKs 10 pg。少量を分析するには、多くのサンプルを収集するためにまたはより高い感度で MS を使用する必要があります。
植物ホルモンの分析は、植物の成長と開発の評価のための重要な技術です。このメソッドを使用して、我々 ができるかもしれないオーキシンと植物における不定芽形成の CK 治療のタイミングを決定する最適な培養条件はまだ不明。植物ホルモンの定量化がますます重要になると、ここで記述されている LC ・ MS/MS プロトコルは、高感度と解像度小さい試料の分析を有効になります。従来の当社の簡素化精製と分析を容易にし高い汎用性と再現性をもたらします。将来は、このメソッドは、他の植物の器官の中に内生オーキシンと CK のダイナミクスを調べるに適用できます。
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Disclosures
著者は、利害の対立があるないことを宣言します。
Acknowledgments
その技術支援の応用生物科学部、東洋大学、群馬県農業技術センターの谷口広大の村上彰氏に感謝しております。東洋大学、博士 Uma Maheswari 医教授庄作柏田へ彼らの提案に感謝しております。本研究は、生活と環境科学、東洋大学の研究センター部分で支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [2H5]indole-3-acetic acid | Olchemlm Ltd | 031 1531 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin | Olchemlm Ltd | 030 0301 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin riboside | Olchemlm Ltd | 030 0311 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenine | Olchemlm Ltd | 030 0161 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenosine | Olchemlm Ltd | 030 0171 | Internal standard for LC-MS/MS |
| indole-3-acetic acid | Wako | 098 00181 | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin | SIGMA-ALDRICH | Z0876 5MG | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin riboside | Wako | 262 01081 | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenine | SIGMA-ALDRICH | D7674 1G | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenosine | ACROS ORGANICS | 22648 1000 | standard for LC-MS/MS |
| acetonitrile hypergrade for LC-MS LiChrosolv | MERCK | 1.00029.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| Water for chromatography LiChrosolv | MERCK | 1.15333.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| HPLC | SHIMADZU | Prominence | |
| MS | Sciex | 3200QTRAP | |
| Oasis HLB 30 mg/1 cc | Waters | WAT094225 | cartridge column |
| Oasis MCX 30 mg/1 cc | Waters | 186000252 | cartridge column |
| screw neck total recovery vial | Waters | 186002805 | |
| blue, 12 x 32mm screw neck cap and PTFE/silicone septum | Waters | 186000274 | |
| Acquity UPLC BEH C18, 2.1x100 mm | Waters | 186002350 | UPLC column |
| Proshell 120 EC-C18, 2.1x50 mm | Agilent | 699775-902 | UPLC column |
| Digital microscope | Leica | DHS1000 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Surgical blade | Feather | No. 22 | |
| Scalpel handle | Feather | No. 4 | |
| Savant SpeedVac/Refregerated vapor trap | Thermo Fisher Scientific | SPD111/RVT4104 | vacuum concentrartor |
| Disposable glass tobe (13x100 mm) | IWAKI | 9832-1310 | |
| Sterile petri dish | INA OPTICA | I-90-20 |
References
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