Summary
قد أعيقت الجهود المبذولة لفهم الدالة ميكروجليال بالتفصيل بعدم وجود نماذج الثقافة ميكروجليال أن الخص خصائص ناضجة في فيفو microglia. ويصف هذا البروتوكول نهج العزلة والثقافة تهدف إلى المحافظة على بقاء قوية من microglia الفئران الناضجة متشعب جداً في ظل الظروف المحددة والمتوسطة.
Abstract
Microglia تمثل 5-10% من جميع خلايا الجهاز العصبي المركزي (CNS) وهي تزداد لفت الانتباه نظراً لمساهماتها خلال التنمية، والتوازن، والمرض. على الرغم من أن قد درست بالتفصيل الضامة لعقود، وميزات متخصصة من microglia، الضامة المقيم في الأنسجة من الجهاز العصبي المركزي، فقد ظلت غامضة إلى حد كبير، جزئيا بسبب أوجه القصور في القدرة على تلخيص microglial ناضجة خصائص في الثقافة. نحن هنا، لتوضيح إجراءات واضحة لعزل السريع microglia نقية من الدماغ القوارض ناضجة. كما يصف لنا ثقافة خالية من المصل الظروف التي تدعم مستويات عالية من السلامة ميكروجليال على مر الزمن. معرض Microglia المزروعة تحت هذه الشروط المعرفة المتوسطة وضع العمليات متشعب ومراقبة ديناميكية السلوك. علينا توضيح بعض آثار التعرض للمصل على microglia مثقف ومناقشة كيف يمكن مقارنة هذه الثقافات خالية من المصل لكل الثقافات المعرضة للمصل، فضلا عن microglia فيفو.
Introduction
الضامة حمة الجهاز العصبي المركزي، microglia التفاعل مع مجموعة واسعة من الدوائر العصبية والشبكات مما يشير إلى الدبقية. أنها تلعب دوراً حيويا في التنمية والتوازن في الدماغ من خلال تشذيب متشابك وإزالة الخلايا أبوبتوتيك وتفاعلات عابرة مع العمليات العصبية1،2. Microglia هم أوائل المستجيبين للإصابات العصبية، توسيع نطاق عملياتها طويلة ورقيقة إلى مواقع الآفة لتنسيق الاستجابات التحريضية وتحد من النزيف3،4. التغييرات في مورفولوجيا microglial ووظيفتها في كل مكان في إصابات الجهاز العصبي المركزي الحادة والمزمنة، ومعرض microglia تتغير مورفولوجيا، والترجمة، والتعبير عن وسطاء التهابات في مجموعة متنوعة من الأمراض الدول1. وتشير الدراسات الجينية البشرية إلى أن الطفرات التي تغير من خطر الإصابة بأمراض الأعصاب وكثيراً ما يغلب أو حصرا يعرب عنها ميكروجليا في الجهاز العصبي المركزي سليمة، مشيراً إلى دور حاسم ل microglia في إمراضية المرض أو التقدم5 . ونظرا لشهرتهم في الإصابة والمرض، الفهم للبيولوجيا ميكروجليال أولوية عالية لتطوير النهج العلاجية الجديدة.
نشأت العديد من التطورات الهامة لفهم علم الأحياء ميكروجليال باستقراء التقنيات والآليات التي اكتشفت في الدراسات المتعلقة بالسكان بلعم الأخرى بما في ذلك تعريفات وظيفية وملامح التعبير الجيني وأساليب الثقافة /المورفولوجية الدول. على الرغم من أن تعميم بلعم وظائف غالباً ما تلعب بها بطرق مفاجئة داخل المشهد الجهاز العصبي المركزي، ميكروجليا هم أنفسهم درجة عالية من التخصص، نستعرض مورفولوجيا متشعب وتوقيع تعبير جينات فريدة أن مجموعات منهم إلى جانب غيرها من النسيج الضامة6. وقد Microglia نسب التي تختلف عن معظم الأنسجة الضامة؛ أنها استعمار في الجهاز العصبي المركزي خلال موجه جنينية مبكرة من هيماتوبويسيس البدائية وتجديد ذاتيا في جميع مراحل الحياة، مستقلة عن مساهمات نهائية هيماتوبويسيس7. توقيع التعبير الجيني ناضجة تماما من microglia الكبار لا يتحقق حتى بعد الولادة في الأسبوع الثاني8. منبهات البيئية من الأنسجة المحيطة دوراً رئيسيا في إملاء بلعم الأنسجة الخاصة ميزات6، التي تشمل التعرض المحدود لعوامل المنقولة بالدم الممنوحة من حاجز الدم في الدماغ9في الجهاز العصبي المركزي.
وهي عقبة واحدة لفهم كامل الاشتراكات ميكروجليال للتوازن في الجهاز العصبي المركزي والمرض صعوبة لخص الخصائص المتخصصة من microglia ناضجة ينظر في فيفو مع الخلايا المنقي في المختبر. تم تطوير العديد من الأساليب لعزل والثقافة microglia سليمة، ولكن معظم النهج المتبعة تعتمد على مصل لدعم بقاء الخلية. وقد أظهرنا أن إضافة مصل الدم، الذي هو طبيعته متغير كاشف التي تحتوي على مجموعة واسعة من الجزيئات النشطة بيولوجيا، وهي إشكالية بصفة خاصة عند العمل مع ميكروجليا لأنه يشجع مورفولوجيا أميبية، زاد انتشار، و غالباً ما ينظر البلعمه زيادة9 في فيفو عندما يتعرض microglia الدم تتحمل العوامل بعد تعطل حاجز الدم في الدماغ. بهذه المقاييس، تشبه الخلايا المعرضة للمصل microglia في الإصابة أو المرض الدول، ولكن خفضت هذه التعديلات عندما تستزرع microglia في المتوسطة النمو المحددة التي تحتوي على السائل الدماغي النخاعي-1 (أو إيل-34)، TGF-β، ونسبة الكولسترول في الدم، وسيلينيت.
يوفر هذا البروتوكول التفاصيل لاستزراع microglia الفئران الأحداث تحت ظروف خالية من المصل، المتصلة بالأعمال المنشورة مؤخرا9. هذا البروتوكول قد تم تبسيطها للفئران من يوم الولادة 21-30 (P21-P30)، ولكن يمكن تكييفها لعزل ميكروجليا من الفئران والجرذان في أي عمر، على الرغم من أن العائد والجدوى الشاملة سوف تختلف باختلاف الأنواع وسن الحيوان. الأعلى غلة وبقاء الأمثل يتحقق عند استخدام microglia قليلاً غير ناضجة (~ P9)، والغلات وجدوى مستدق تدريجيا إلى حد ما انخفاض مستويات في الحيوانات الكبار. ميكروجليا يمكن أيضا أن تكون معزولة من الفئران، ولكن وجدنا أن خلايا الفئران إظهار أعلى بكثير الغلات والجدوى، وتعقيد مورفولوجيس متشعب، عند مقارنتها بالماوس الخلايا في ثقافات خالية من المصل. الحيوانات أعمارهم أكبر من P50 لم يتم تقييمها مع هذا البروتوكول. وقد تم تحسين هذا الإجراء العزلة إيمونوبانينج لتقليل التغيرات في microglial النسخي التشكيلات الجانبية أثناء العزلة وإلى أقصى حد ممكن بقاء المتلقين للمعلومات من الخلايا. باستخدام هذه التقنيات والصياغات وسائل الإعلام، يمكن أن يستمر الثقافات العالية الجدوى الأولية لمدة أسابيع. يحمل مورفولوجيا متشعب جداً التي تنطوي على التوسع السريع وتراجع عمليات Microglia مثقف في ظل هذه الظروف ومعدلات انتشار منخفضة نسبيا. نحن تسليط الضوء على أهمية المصل-التعرض على هذه الخصائص، ومناقشة مواطن القوة والضعف لهذه الطريقة بالنسبة للطرق الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الإجراءات التي تنطوي على القوارض تتفق مع المبادئ التوجيهية لجامعة ستانفورد، التي تمتثل للسياسات الوطنية وقوانين الدولة و. وافق جميع الإجراءات الحيوان "الفريق الإداري" في جامعة ستانفورد في "مختبر رعاية الحيوان".
ملاحظة: ترد جميع التراكيب الحل والمخزن المؤقت في الجدول للمواد.
1-إعداد طبق بيتري ل CD11b إيمونوبانينج (يوم 0)
ملاحظة: إعداد طبق إيمونوبانينج 1 لكل أدمغة الفئران الأحداث 1-2.
- إضافة 25 مل من 50 مم تريس pH 9.5 الحل إلى طبق بتري 15 سم.
- إضافة الماعز الماوس المضادة IgG (سلاسل H + L) إلى الطبق لتركيز نهائي من 6 ميكروغرام/مل. دوامة لوحة توزيع بالتساوي.
- احتضان الطبق ح 1-3 في 37 درجة مئوية.
- ثم استبدال شطف الأطباق ثلاث مرات مع دببس++ (فوسفات مخزنة المالحة (PBS) مع Ca2 + و Mg2 +)، مع حل للغسل مخزن يحتوي على 1 ميكروغرام/مل جسم OX42. ترك الأطباق بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة على سطح مستو.
2-الأنسجة جمع (1 يوم)
ملاحظة: يجب أن تأخذ هذا البروتوكول ح ~ 3-4.
- قبل البدء، ضمان جميع الحلول عقيمة ومبردة على الثلج. تشيل جميع الصكوك المتعلقة بالجليد وتعقيم مع الإيثانول قبل استخدامها.
- في أعقاب الإجراءات التنظيمية المناسبة، التضحية الفئران مختبرية الأحداث بالخنق بغاز ثاني أكسيد الكربون.
ملاحظة: بدلاً من ذلك، الحيوانات الأصغر سنا يجوز التضحية بجرعة قاتلة من الكيتامين/إكسيلازيني (100-200 ميليلتر من الكيتامين 24 ملغ/مل، 2.4 ملغ/مل xylazine). يجب استخدام الكيتامين/إكسيلازيني إذا كانت الحيوانات أقل من 14 يوما عمر. في حالة استخدام الحيوانات متعددة، انتزاع الأنسجة من الحيوانات واحد ووضعه في مبردة مسبقاً دببس++ على الجليد قبل الانتقال إلى الحيوانات اللاحقة. - قرصه هيندباو وضمان مشكلة عدم استجابة كاملة من الحيوان قبل المتابعة.
- ترانسكارديالي نتخلل الحيوان مع 10-30 مل من نضح المثلج المخزن المؤقت باستخدام إبرة 27-ز حتى يتم تشغيل المخزن المؤقت واضحة.
ملاحظة: حجم المخزن المؤقت نضح تتنوع تبعاً للحجم/عمر الحيوان. - فورا بعد نضح إزالة رأس الحيوان. تأتي من النخاع الشوكي قطع اللقمة والقفويه على كل جانب مع مقص التشريح، ينبغي الحرص على عدم الأضرار الدماغ. بعد قطع تقطيع كل جانب بعناية، إلى جانب واحد على طول الجداري وعظم جبهي نحو عظم الآنف. مع الملقط بعناية سحب الجزء العلوي من الجمجمة بسرعة إزالة الدماغ (أو هياكل الجهاز العصبي المركزي للفائدة) ووضع في مبردة مسبقاً دببس++ على الجليد.
- كرر لكل الحيوانات المتبقية.
ملاحظة: ينبغي إجراء جميع خطوات المتابعة في غطاء الاندفاق الصفحي تحت ظروف معقمة مناسبة.
3-ميكانيكية الانفصال (1 يوم)
- بعد أن تم جمع جميع العقول، ختم الدماغ واحد إلى 1 ملم3 قطع في طبق بتري على الجليد بشفرة المبضع بارد، ونقل إلى الخالطون دونس المثلج مع 5-7 مل دونسينج المثلج المخزن المؤقت. تنأى الدماغ واحد في وقت واحد.
- ننأى بالانسجة باستخدام 10-20 السكتات الدماغية لطيف وغير مكتملة مع الخالطون دونس فضفاضة لتركيب. الحرص على عدم سحق الأنسجة في الجزء السفلي من الخالطون صورة مباشرة، ولكن بدلاً من ذلك تدفع الأنسجة من خلال الفضاء بين الجانبين للمكبس والخالطون.
- بعناية إزالة المكبس منع إدخال فقاعات الهواء. السماح لقطع الأنسجة ضعيفة منفصلان لتسوية لأسفل الخالطون، ونقل المادة طافية إلى أنبوب مخروطي 50 مل مثلجة جديدة.
- استبدال وحدة إزالة المخزن المؤقت دونسينج الطازجة، وكرر الخطوات من 3، 2 و 3-3 لمدة 3-4 جولات، أو حتى قد تم فصل جميع الأنسجة. كرر هذا الإجراء لكل الدماغ.
4-المايلين إزالة (1 يوم)
ملاحظة: يتم استخدام إزالة المايلين لعزل ميكروجليا من الحيوانات أقدم P12.
- قياس حجم تعليق خلية في أنبوب 50 مل المخروطية باستخدام ماصة 25 مل، ثم إضافة المخزن المؤقت دونسينج المثلج لضبط الحجم الإجمالي لمل 33.5.
- إضافة 10 مل من المايلين العازلة الفاصلة (MSB) إلى تعليق خلية ومزيج دقيق بعكس الأنبوبة عدة مرات. وهذا سيؤدي إلى 23% تركيز MSB نهائي في وحدة تخزين 43.5 مل.
- الطرد المركزي خلايا لمدة 15 دقيقة في 500 غرام x عند 4 درجة مئوية مع الكبح بطيئة.
ملاحظة: ينبغي أن أجهزة الطرد المركزي حوالي 1.5-2 دقيقة يتباطأ. سيؤدي هذا إلى إنشاء طبقة علوية من المايلين والحطام خلية ميتة، ومن المادة طافية غامضة إلى حد ما وبيليه أصغر الذي هو إثراء للخلايا الحية. - قم بإزالة الطبقة العليا من المايلين/الحطام والمادة طافية مع ماصة. العناية عند إزالة الطبقة العليا لضمان كما أن الكثير من ذلك هو إزالة قدر الإمكان.
- ريسوسبيند بيليه الخلية في 12 مل من الغسل المخزن المؤقت. تريتوراتي برفق بتعليق خلية لتفريق أي كتل من الخلايا التي قد تبقى.
5-إيمونوبانينج (1 يوم)
- يمر بتعليق خلية مصفاة خلية 70 ميكرون لإزالة الحطام كبير أو كتل الخلية.
- شطف الطبق الغسل المغلفة OX42 ثلاث مرات مع دببس++. لا تسمح اللوحة ليجف تماما بين يغسل.
- من أجل إيقاف الغسيل دببس++ الماضي وتطبيق تعليق الخلية التي تم تصفيتها للطبق الغسل. بلطف دوامة لوحة توزيع الخلايا، ثم احتضان لوحة على سطح مستو في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة للسماح للخلايا الالتزام. عدم احتضان أطول من 20 دقيقة أو الخلايا ستصبح صعبة جداً للتعافي من الطبق.
- شطف الطبق الغسل مع دببس++ 10 مرات لإزالة الخلايا غير ملتصقة. سوف يكون ميكروجليا بشدة تعلق على اللوحة، حتى دوامة اللوحة مع كل شطف التأكد من إزالة الخلايا غير ملتصقة الأخرى.
- من أجل إيقاف الغسيل دببس++ الماضي واستبدال مع 15 مل دببس++ و 200 ميكروليتر التربسين (1.25% حل الأسهم).
- احتضان الطبق لمدة دقيقة دي وان زيرو على 37 درجة مئوية مع 10% CO2 تريبسينيزي.
ملاحظة: لا تستمر فترة أطول من 10 دقائق أو microglia سوف يصبح من الصعب إزالته. - بعد 10 دقائق من تريبسينيزيشن، سوف لا يزال عالقاً microglia للوحة. من أجل إيقاف التربسين/دببس++ وتغسل بلطف x 2 مع دببس++ لإزالة التربسين، استبدال مع 12 مل من microglia المثلج النمو المتوسطة (أم جي أم).
- مكان الغسل طبق على الجليد لمدة 2 دقيقة لمساعدة يضعف التفاعل خلية/الركازة، وتأكد من أن الطبق مسطح لمنع جفاف المناطق طبق الغسل.
- "الماصة؛" بقوة مع 10 مل ماصة وبيبيت تحكم بسرعة عالية لاستعادة الخلايا من طبق الغسل. رسم شبكة 16 × 16 مع تيار السائل من الماصة في محاولة لإزالة كافة الخلايا.
- فحص الخلايا تحت مجهر في 20 X التكبير للتأكد من فصل خلايا من اللوحة. البقع علامة على رأس طبق فيها خلايا تزال عالقة، وتكرار بيبيتينج في تلك المناطق.
- جمع تعليق خلية والكوة 3-4 مل من المادة طافية كل 15 مل الأنبوبة المخروطية. تدور لمدة 15 دقيقة في 500 غرام x عند 4 درجة مئوية مع الكبح بطيئة.
ملاحظة: الغزل microglia من خلال وحدة تخزين صغيرة يسمح لاسترداد الحد الأقصى من الخلايا. - نضح المادة طافية، تاركاً 0.5 مل من أم جي أم مع بيليه الخلية.
- ريسوسبيند كل بيليه في MGM المتبقية، وتجمع الخلايا من جميع الأنابيب.
- حساب عدد الخلايا مع هيموسيتوميتير.
- لوحة الخلايا كما هو موضح في الخطوات 6-7 استناداً إلى التطبيق.
- ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية مع شركة 10%2.
ملاحظة: يمكن خلايا الثقافة لتصل إلى 3-4 أسابيع مع التغييرات الوسائط العادية أو أسبوع واحد مع أية تغييرات في وسائل الإعلام.
6-بقعة طلاء زراعة الأنسجة لوحات/كوفيرسليبس (1 يوم)
- لوحة 15 ميليلتر لطلاء الكولاجين الرابع مباشرة في وسط لوحة 24-جيدا أنيونى/الموجبة زراعة الأنسجة المغلفة (انظر الجدول للمواد لمزيد من التفاصيل)، واحتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 10% CO2.
- بعد عد الخلايا مع الخلايا هيموسيتوميتير مخفف إلى 2.3 × 105/mL في MGM. نضح بقعة الكولاجين الرابع وعلى الفور لوحة 15 ميليلتر من تعليق خلية لهذا المكان؛ وهذا سيعطي 3.5 × 103 خلايا/البقعة. احتضان لمدة 5-10 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع 10% CO2 السماح بالالتزام، وإضافة 500 ميليلتر من أول أكسيد الكربون2-اكويليبراتيد TGF-β2/إيل-34/الكوليسترول تتضمن النمو المتوسطة (عرة) الخلايا بلطف إلى البئر.
- إذا كان الطلاء في كوفيرسليبس، كوفيرسليبس زجاج معقمة معطف الأولى مع 10 ميكروغرام/مل حيلة-د-يسين (PDL) في ح2س لح 1 في الرايت، يغسل 3 مرات مع ح2س، واسمحوا جافة في غطاء تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. وبمجرد كوفيرسليبس الجافة، المضي قدما في بقعة الطلاء على كوفيرسليبس كما هو موضح في "الخطوة 6-2".
7-طلاء لعزل الحمض النووي الريبي/البروتين
- في يوم 1، معطف المنطقة بأكملها من 24-جيدا أنيونى/الموجبة المغلفة صفيحة زراعة الأنسجة مع الكولاجين الرابع طلاء واحتضانها لدقيقة 10-1 ح في 37 درجة مئوية مع 10% CO2، ثم إزالة وفورا لوحة 3-5 x 104 خلايا/بئر في CO2 اكويليبراتيد عرة وسائط الإعلام.
- في اليوم 2، إجراء تغيير وسائط 50% لكل جيدا اليوم بعد إعداد. الخلايا الميتة تميل إلى المجموعة في وسط البئر، حتى تأخذ وسائل الإعلام من هناك.
- إجراء تغيير وسائط 50% كل 2-3 أيام للحفاظ على الثقافات. في حالة إدخال تغييرات الوسائط متغير غير المرغوب فيها للثقافات، خلايا يمكن البقاء على قيد الحياة لمدة أسبوع واحد تقريبا دون أي تغييرات وسائل الإعلام، مقابل أكثر من 3 أسابيع مع أعمال الصيانة العادية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويصف هذا البروتوكول أسلوب إلى ثقافة عالية النقاء تتفرع microglia من الفئران الأحداث. نتائج مماثلة يمكن الحصول عليها باستخدام الحيوانات غير ناضجة، والفترة المحيطة بالولادة، والكبار، كما هو مبين أدناه. إذ غالباً ما تتضمن الخلية العزلة المفروضة الفروق الدقيقة والعديد من الفرص للخلايا للموت، استخدمنا نقاط التفتيش لمراقبة الجودة للمساعدة في تحديد النجاح في الخطوات المختلفة. ونحن عادة رصد تعليق خلية باستخدام هيموسيتوميتير في خطوات متعددة في البروتوكول العزلة (الشكل 1A). ينبغي أن تسفر عن نجاح العزلة 2.5-5 ×5 10 خلايا/الأحداث الحيوان. إظهار الحيوانات من P7-P15 غلة أقرب إلى 5 × 105 خلايا/الحيوانية، بينما تظهر الخلايا المعزولة من الحيوانات أقدم من P30 غلة أقرب إلى 2.5 × 105 خلايا/الحيوان. بعد رصد خلية الإجمالي التهم الموجهة إليه في البروتوكول، من المهم تحديد الصحة العامة للخلايا المعزولة، والتي يمكن أن يكون صعباً بسبب microglia معزولة بهذه الطريقة يكون مورفولوجيا مدورة أو القطبين خلال الأيام القليلة الأولى في الثقافة . هنا، ولقد شملت المرحلة صور P25 microglia في الثقافة خلال أول 6 أيام بعد عزلة في التشنج والتشنج التي تحتوي على 10% مصل العجل الجنين (FCS) (الشكل 1B).
رقم 1: تقييم صحة الخلية خلال بروتوكول العزلة وعلى مدى 6 أيام للثقافة- (أ) المرحلة-التباين الصور توضح نقاط التفتيش مراقبة الجودة في الخطوات المعينة لإجراءات عزل الخلية. تم تصويرها المعلقات الخلوية بخلط ميليلتر 9 تعليق الخلوية مع 1 ميليلتر من 0.4% تريبان الأزرق قبل تحميلها على هيموسيتوميتير. صور أخرى تبين الطبق الغسل نفسها، وتظهر جميع الصور كحقل واحد في 20 X التكبير. مقياس بار، 200 ميكرومتر. أم جي أم، microglia المتوسطة النمو. (ب) دورة الوقت التغييرات الشكلية microglial وانتشارها على مدى 6 أيام للثقافة في المصل خالية عرة النمو المتوسطة أو عرة زائد 10% العجل الجنين المصل (FCS). الخلايا CD11b-إيمونوبانيد كانت بقعة مطلية على لوحة المغلفة بالكولاجين زراعة الأنسجة المغلفة أنيونى/الأيوني (انظر الجدول للمواد لمزيد من التفاصيل)، وتم تصويرها بنفس الحقل المرحلة-على النقيض من كل حاء 24 مقياس بار، 100 ميكرومتر. عرة، TGF-β2/إيل-34/ المتوسطة النمو تحتوي على نسبة الكولسترول في الدم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
المهم التقييم الروتيني للصحة والسلامة للخلايا المعزولة لإمكانية تكرار نتائج ونجاح التجارب. هنا نعرض microglia معزولة عن حيوانا P21 المستزرعة في MGM أو عرة عرة تكملها FCS 10% بعد 7 أيام في المختبر (DIV) مع مقايسة بقاء. إذا العزل كان ناجحاً، تظهر الثقافات بين 80-90% البقاء في التشنج بعد تسلق 7 "خلايا شعبة" مثقف حضور المصل في نهاية المطاف هذا التدبير، بالقرب من صلاحية 100% لكن هذا هو تضخم مصطنع كلا من الانتشار السريع الخلايا المعرضة للمصل والبلعمه السريع للخلايا الميتة داخل هذه الثقافات (الشكل 2A). بالإضافة إلى بقاء قوية، إظهار الخلايا عرة مثقف أيضا مورفولوجيا متشعب عند سفح المنحدر القاري بالمقارنة مع تعامل الخلايا (الشكل 2، ج).
رقم 2: البقاء على قيد الحياة microglia في MGM، عرة أو عرة + سفح المنحدر القاري على مدى سبعة أيام في الثقافة- (أ) الخلايا كانت معزولة من الفئران P21 ومثقف في microglia النمو المتوسطة (أم جي أم)، TGF-β2/إيل-34/الكوليسترول تتضمن النمو المتوسطة (عرة)، أو تيك + مصل العجل الجنين 10% (FCS). واستكملت المتوسطة الثقافة عند كل نقطة من الزمن، مع كالسين صباحا (1.33 ميكرومتر النهائي) وهوموديمير اثيديوم (النهائي 2.5 ميكرومتر) لمدة 15 دقيقة لتسمية الخلايا الحية والخلايا الميتة على التوالي. تم عد الخلايا في كل حقل باستخدام برنامج نصي إيماجيج الآلي. (ب وج) بعد الدرجة 7، مع أية تغييرات في وسائل الإعلام، خلايا تزرع في عرة (ب) أو كانت ملطخة عرة تستكمل مع 10 ٪ السفح (ج) تسمية الخلايا الحية والميتة المذكورة أعلاه. صور الممثل قد اتخذت باستخدام 10 X (إلى اليسار) أو 40 س (يمين) الهدف. مقياس بار، تمثل 40 ميكرومتر. أشرطة الخطأ الخطأ المعياري للوسط (SEM). تم تعديل هذا الرقم من بولن et al. 9 وتستخدم مع إذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
من أجل إثبات نجاح العزلة وثقافة microglia نقية جداً، معزولة microglia من الفئران P21، ومثقف هذه الخلايا في عرة أو عرة تكملها FCS 10% لمدة 8 أيام. ثم الخلايا الثابتة وملطخة بعلامات ميكروجليال (رابطة المحامين الدولية-1 و CD11b) وعلامة انتشار (Ki67، الشكل 3 ألف). بالإضافة إلى تلطيخ لعلامات خلية، تسلسل الحمض النووي الريبي في الخلايا المعزولة حديثا يمكن أن يوفر أداة قوية وحساسة لتقييم الشخصية الحمض النووي الريبي للخلايا، ويمكن أن تساعد في إبلاغ نقاء بدءاً من الثقافات. إيمونوبانينج CD11b يؤدي عادة إلى نسبة مئوية صغيرة من CD11b+ ترحيل العَدلات/الوحيدات بالإضافة إلى CD11b+ ميكروجليا (الشكل 3B). هذه الخلايا سوف يموت في التشنج بعد بضعة أيام، ولكن يمكن أن يؤدي إلى تعقيد تحليلات للنقاط الزمنية السابقة.
الشكل 3: نقاء خلايا المستزرعة المقررة إيمونوهيستوتشيميستري وما يليها الجيش الملكي النيبالي (A) Microglia كانت معزولة من الفئران P21، مطلي على PDL/الكولاجين مغلفة الزجاج كوفيرسليبس ومثقف في TGF-β2/إيل-34/الكوليسترول تتضمن النمو المتوسطة (عرة) لمدة 8 أيام. الخلايا الثابتة مع بارافورمالدهيد 4% (PFA) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة والمناعية الملطخة مع رابطة المحامين الدولية-1 (1: 500)، CD11b (1:1500)، و Ki67 (1: 500). بإيجاز، سدت الخلايا الثابتة مع المنظفات 0.1% (انظر الجدول أساليب للحصول على التفاصيل) والحمار العادي 10% مصل (خ ع) ح 1 في درجة حرارة الغرفة. ثم كانت المحتضنة الخلايا مع الأجسام الأولية في المنظفات 0.1% % 1 خ ع بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. خلايا تم غسلها ثلاث مرات لمدة كل 5 دقائق في برنامج تلفزيوني. الخلايا كان المحتضنة مع الأجسام المضادة الثانوية ثم جميع 1: 500 في المنظفات 0.1% % 1 خ ع عن ح 1 في درجة حرارة الغرفة. مرة أخرى كانت الخلايا غسلها ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني وشنت مع تصاعد المتوسطة المحتوية على DAPI. تم أخذ صور الممثل في 40 X التكبير. مقياس بار، 50 ميكرومتر. (ب) التعبير عن النصوص محددة الممثل من نوع الخلية من الخلايا المعزولة طازجة ومثقف. كانت معزولة من الفئران P21 Microglia وتفكيك مباشرة من الطبق إيمونوبانينج لعزل الحمض النووي الريبي وإظهار علامات الجيش الملكي النيبالي-ما يليها من سائر أنواع الخلايا الجهاز العصبي المركزي الرئيسية (astrocytes والخلايا العصبية، oligodendrocytes، وخلايا بطانية) التلوث الحد الأدنى من CD11b-إيمونوبانيد الخلايا. علامات العَدلات يتم الكشف عنها في الخلايا المعزولة حديثا (أسود)، ولكن يتم فقدان في ثقافات خالية من المصل (رمادي). الخلايا المستزرعة التعبير عن مستويات عالية من علامات بلعم المشتركة، ولكن علامات تعريف التوقيع microglial المتخصصة بسرعة دوونريجولاتيد بالخلايا المزروعة. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للوسط (SEM). يتم تعديل البيانات من بولن et al. 9 وتستخدم مع إذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
تلطيخ للبقاء وعلامات خلية يسمح لتحديد بقاء ونقاء من الخلايا، ولكن توفر معلومات محدودة عن ديناميات الثقافة. هنا قدمنا فيلم الوقت الفاصل بين من P21 microglia الفئران بعد DIV 14 في عرة. وبعد أسبوعين، إظهار ثقافات خالية من المصل السلوك المراقبة الحيوية، مع ملحقات العملية السريعة والتراجع في جميع أنحاء الطبق (انظر 1 الفيلم). بالإضافة إلى ذلك، سبق وجدنا أن التعرض المصل يحول هذه يستريح خصائص الدولة من microglia، نتج عنه دائم التغييرات المورفولوجية ومتجولة. ونحن قد شملت فيلما microglia مثقف لمدة 5 أيام في عرة، ثم معرضة السفح 10% (انظر 2 الفيلم).
الفيلم 1: تعريف المتوسطة microglia الثقافات إظهار مورفولوجيا متشعب مع العمليات الحيوية. Microglia كانت معزولة من P21 الفئران، بقعة مطلية على لوحات المغلفة بالكولاجين زراعة الأنسجة المغلفة أنيونى/الأيوني، ومثقف لمدة 14 يوما في عرة. وجمعت الصور في DIV 14، كل 3 دقائق. يلعب الفيلم على 6 إطارات/ثانية، والطابع الزمني الموجود في الزاوية اليمنى السفلي يدل على مدة التصوير في h:min. يرد الفيلم من بولن et al. 9 وتستخدم مع إذن. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
الفيلم 2: التعرض المصل يؤدي تغيير الخصائص مورفولوجية سريع في الثقافات microglial المعرفة والمتوسطة. Microglia كانت معزولة من P21 الفئران، بقعة مطلية على لوحات المغلفة بالكولاجين زراعة الأنسجة المغلفة أنيونى/الأيوني، ومثقف لمدة 5 أيام في عرة. في الدرجة 5، صور جمعت كل دقيقة 5 الأساس سجلت حركية/مورفولوجيا، ثم في 02:55 (2 ساعة, 55 دقيقة)، وأجرى تغيير وسائط 50% لإضافة FCS بتركيز نهائي 10%. خلايا تم تصويرها ح 7 إضافية. يلعب الفيلم على 6 إطارات/ثانية، ومدة التصوير في h:min. الرجاء النقر هنا لعرض هذا الفيديو يدل على الطابع الزمني الموجود في الزاوية اليمنى السفلي. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لأنه بمثابة microglia الخلايا المناعية الحارس من الجهاز العصبي المركزي، فتستجيب للغاية للتغييرات البيئية؛ ولذلك، مطلوب قدر كبير من العناية لتقليل الاستجابات التحريضية داخل الخلايا أثناء عزلتها والثقافة8. ويتم ذلك في هذا البروتوكول من خلال السرعة ودرجة الحرارة. حفظ الخلايا على الجليد أو عند 4 درجة مئوية كلما أمكن يقلل كثيرا من التنشيط، حيث تجري جميع خطوات استخدام الطرد المركزي في 4 درجات مئوية، يتم perfused الحيوانات مع المخزن المؤقت لنضح المثلج، وتم تبسيط البروتوكول لتقليل الوقت بين الأنسجة استخراج واستزراع الخلايا. إذا كان تقييم أنماط التعبير الجيني الخلايا المعزولة طازجة، حصاد ليساتيس الخلية مباشرة من الطبق إيمونوبانينج CD11b قبل تريبسينيزيشن للاحتفاظ بالتغييرات الناجمة عن العزلة كحد أدنى. من الجدير أن microglia حتى المعزولة بعناية تنفيذ استجابة التهابات فور وضعها في درجات حرارة دافئة، يفترض أنه بسبب الاعتراف بالإشارات المرتبطة بالأضرار المرتبطة ارتباطاً وثيقا بإجراءات العزل. إذا كان تنفيذ البروتوكول بنجاح، يتوقع 2.5-5 ×5 10 خلايا/الأحداث الفئران.
البروتوكول عزل الخلية المقدمة هنا هي محددة للغاية لعزل CD11b + الخلايا من الجهاز العصبي المركزي بيرفوسيد9. على الرغم من أن هذه الفئة من السكان خلية تتكون أساسا من microglia، فإنه يحتوي أيضا على مستويات منخفضة من السكان الآخرين النقوي مثل الضامة ارتشاح والضامة سحائي والضامة الضفيرة شرويد، وحيدات والعدلات10. يمكن القضاء الخلايا النقوي المشيمية المرتبطة أساسا بالاعتراف وإزالة الضفيرة شرويد قبل تفكك النسيج. يمكن أيضا إزالة السحايا إلى حد ما، ولكن القضاء التام على جميع الأنسجة سحائي ليس عمليا ضمن الأطر الزمنية المستهدفة لعزل السريع هو موضح هنا. ولذلك، للحد من تقلب نتيجة إجراء عملية إزالة غير كاملة للسحايا، نحن لا تقم بإزالة السحايا. للتقليل من العدد من تعميم وحيدات/العَدلات في المواد المعزولة، كما أنها المهم نضح نظيفة، ونحن عادة تجاهل الأنسجة التي هي سيئة perfused. حتى مع نضح ممتازة، تخليص دم ليس مطلقا، كما سيتضح من وجود كمية صغيرة من الكريات الحمراء في الكريات الخلية في جميع أنحاء التنقية. وهكذا، صغيرة مستويات وحيدات والعدلات هي تنقية المشترك ويسهم توقيع متميزة في الملامح ترانسكريبتوميك الخلايا المعزولة حديثا. ومع ذلك، تعميم خلايا سيموت بسرعة في وسائل الإعلام عرة خالية من المصل ولا تمثل الملوثات الثابتة، على الرغم من أنها يمكن الاستمرار في البقاء على قيد الحياة وتتكاثر في المصل الذي يحتوي على الثقافات.
نقطة أخرى هامة لتحقيق ثقافة صحية وسليمة أن تأخذ الرعاية من خلال خطوات الانفصال الميكانيكية. بينما دونسينج يقتل العديد من الخلايا العصبية وإطلاق، وسائر خلايا الجهاز العصبي المركزي، microglia البقاء على قيد الحياة هذا الانفصال سالما نسبيا (على الرغم من أن يمكن أيضا قتل ميكروجليا بأكثر من دونسينج). إذا فعلت بشكل صحيح، هذا البروتوكول النتائج في غلة خلية مماثلة للحصول عليها باستخدام proteolytic الانفصال، بينما يحتمل الخلط المتغيرات من الأنسجة الملتهبة هي تجنب الردود في درجات حرارة مرتفعة. عن طريق إجراء جولات متتالية غير مكتملة من تفكك النسيج الميكانيكية، يمكن أن تحصد الخلايا المفردة من التعليق مع التقليل من مقدار الضغط الميكانيكي على الثقافة عموما.
بروتوكول إيمونوبانينج الموصوفة هنا طريقة موثوقة واستنساخه لعزل microglia، ولكن تتوفر طرق أخرى قابلة للمقارنة. نحصل على نتائج مماثلة باستخدام العزل المغناطيسي مع المغناطيسية تنشيط الخلية الفرز نضوب المايلين واختيار CD11b. هنا أننا ركزنا على طريقة إيمونوبانينج لأنه وفر ثقافات أعلى جودة حتى الآن، يتطلب معدات متخصصة أقل، ولا تتطلب إدخال الأجسام المضادة مترافق أكسيد الحديد إلى الخلايا مباشرة قبل الثقافة. نهج آخر استخداماً لعزل microglial وهو التدفق الخلوي، التي لها ميزة كبيرة على النهج الحالي في وجود بروتوكولات لتنقية microglia حسن النية من CD11b + النقوي الملوثات الأخرى باستخدام السطح الأجسام المضادة ضد علامات التوقيع مثل TEMEM1198. على الرغم من الأسفار تنشيط الخلية فرز النتائج في نسبة سكان خلية نقية جداً، كما تفرض الضغوط الإضافية للخلايا وقد يؤدي إلى انخفاض بقاء الثقافات أو انخفاض غلة. عموما، نحن نركز على الأساليب المستندة إلى جسم إزاء الاستعدادات الطرد المركزي ويهز قبالة الكثافة خالية من التسمية لتعظيم إمكانية تكرار نتائج والنقاء من سكان الخلية.
في حين أن هذا البروتوكول هو الأمثل لثقافة microglia الفئران الأحداث، يمكن استخدامه للثقافة ميكروجليا من مختلف الإعمار؛ غلة خلية الإجمالي القصوى من 1-2 عاماً الأسبوع الفئران، بعد انقضاء ذروة التوسع microglial وقبل ترتيبات هيكلية جديدة تتداخل مع استعادة الخلايا من الأنسجة القديمة. يمكن أيضا عزل Microglia ومثقف من الماوس والأنسجة البشرية بالاستعاضة عن جسم CD11b بجسم [مونوكلونل] مناسبة محددة للماوس أو البشرية [ابيتوبس]. بينما الماوس و microglia البشري البقاء على قيد الحياة في ظل هذه الظروف الثقافة، أنها تظهر الاختلافات المورفولوجية بالمقارنة مع خلايا الفئران. خلايا الفأر الإبقاء مورفولوجيا متشعب ولكن أقل إعداد العمليات، في حين تحتوي الخلايا البشرية مورفولوجيا أميبية موحدة تقريبا عندما عزل ومثقف ووفقا لهذا الإجراء.
يمكن مطلي microglia معزولة بطرق مختلفة تبعاً للاختبارات المطلوبة. للحصول على النتائج المثلى (كما يتضح في فحوصات يعيش الموتى ومورفولوجية الأفلام المعروضة هنا)، كانت 3.5 × 103 خلايا "بقعة" مطلي في وسط بئر صفيحة 24-جيدا أنيونى/الموجبة زراعة الأنسجة المغلفة بعد طلاء 10-مين الكولاجين الرابع الموصوفة في هذا البروتوكول. وبدلاً من ذلك، للتجارب التي تتطلب أعدادا كبيرة من الخلايا، مثل الحمض النووي الريبي العزلة، يمكن مطلي 3-5 × 104 خلايا كل من صفيحة 24-جيدا جيدا بعد 10 دقيقة إلى ح 1 طلاء الكولاجين الرابع. خلايا مطلي بكثافة أعلى وأظهرت جدوى أقل بشكل طفيف وتعامل مورفولوجيا أقل تعقيداً بالمقارنة مع الخلايا التي كانت بقعة، ربما بسبب تأثير إشارات تحريضية ويفرز استجابة للعزلة. إيمونوهيستوتشيميستري أو التصوير التي تتطلب كوفيرسليبس الزجاج، يحمل الخلايا البقاء على قيد الحياة أفضل ومورفولوجيا عندما كانت كوفيرسليبس الأولى المغلفة مع PDL ثم المغلفة في الكولاجين الرابع كما هو موضح أعلاه. لفحوصات تتطلب عدد كبير من الظروف، بقاء الخلية مرتفع أيضا في لوحات 96-بئر أو آبار 384 المغلفة بالكولاجين. في جميع الأحوال، الخلايا تبدأ جولة أو بين القطبين، وتبدأ في اكتساب العمليات حول يوم 3-4، وتأخذ 5-10 أيام معرض مورفولوجية متشعب الحد الأقصى المبين في الشكل 1 و 1 الفيلم.
بينما يؤدي هذا البروتوكول في ثقافة الذي يسلك سلوك المراقبة الديناميكية ومورفولوجيا مشابهة ليستريح microglia في فيفو، تفشل هذه الخلايا تماما الاحتفاظ بتوقيع تعبير الجينات المتخصصة من microglia في فيفو. العديد من التغييرات المستمرة الجينات في الخلايا المستزرعة تعكس التعديلات التي ينظر إليها عادة في الجهاز العصبي المركزي الجنينية أو ملتهبة9. على هذا النحو، هذا البروتوكول يمثل خطوة إلى الأمام في فهم الشروط التي تتطلب microglia البقاء على قيد الحياة في الثقافة والتغييرات أثارت المصل، ولكن يلزم إجراء مزيد من الدراسة لفهم الإشارات الخارجية المقدمة من الجهاز العصبي المركزي التي صقل microglial تعبير الجينات والخصائص.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن أنه أجرى البحث في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن أن يفسر تضارب المصالح محتملة.
Acknowledgments
هذا العمل كان يدعمها كريستوفر ودانا ريف مؤسسة الدولية اتحاد البحوث المتعلقة بإصابات النخاع الشوكي، ميريام الدكتور وشيلدون زاي اديلسون مؤسسة البحوث الطبية، مؤسسة جبب، معهد البحوث الأساسية نوفارتيس، الحصول على مساهمات سخية من فنسنت وكوتس ستيلا، ومؤسسة أبحاث السرطان رونيون ديمون (DRG-2125-12).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat: Sprague-Dawley | Charles River | Cat# 400 | |
| mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42) | Bio-Rad | Cat# MCA275R | Panning: 1:1,000; Staining: 1:500 |
| Goat polycolonal anti-Iba1 | Abcam | Cat# AB5076 | Staining: 1:500 |
| Rabbit polyclonal anti-Ki67 | Abcam | Cat# AB15580 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594 | Invitrogen | Cat# 11055 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-goat 488 | Invitrogen | Cat# A-21203 | Staining: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647 | Invitrogen | Cat# A-31573 | Staining: 1:500 |
| Triton-X (detergent in ICC staining) | Thermo Fisher | Cat# 28313 | |
| Heparan sulfate | Galen Laboratory Supplies | Cat# GAG-HS01 | |
| Heparin | Sigma | Cat# M3149 | |
| Peptone from milk solids | Sigma | Cat# P6838 | |
| TGF-β2 | Peprotech | Cat# 100-35B | |
| Murine IL-34 | R&D Systems | Cat# 5195-ML/CF | |
| Ovine wool cholesterol | Avanti Polar Lipids | Cat# 700000P | |
| Collagen IV | Corning | Cat# 354233 | |
| Oleic acid | Cayman Chemicals | Cat# 90260 | |
| 11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid | Cayman Chemicals | Cat# 20606 | |
| Calcein AM dye | Invitrogen | Cat# C3100MP | |
| Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | Cat# E1169 | |
| DNaseI | Worthington | Cat# DPRFS | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | Cat# 17-5445-02 | |
| Trypsin | Sigma | Cat# T9935 | |
| DMEM/F12 | Gibco | Cat# 21041-02 | |
| Penicillin/ Streptomycin | Gibco | Cat# 15140-122 | |
| Glutamine | Gibco | Cat# 25030-081 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma | Cat# A9165 | |
| Insulin | Sigma | Cat# 16634 | |
| Apo-transferrin | Sigma | Cat# T1147 | |
| Sodium selenite | Sigma | Cat# S-5261 | |
| DMEM (high glucose) | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dapi Fluoromount-G | Southern Biotech | Cat# 0100-20 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma | Cat# A-003-E | |
| Primaria Plates | VWR | Cat# 62406-456 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stock reagents | |||
| Apo-transferrin | Reconstitution: 10 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C |
||
| N-acetyl cysteine | Reconstitution: 5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
||
| Sodium selenite | Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:25,000 Storage: -20°C |
||
| Collagen IV | Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -80°C |
||
| TGF-b2 | Reconstitution: 2 mg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
||
| IL-34 | Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -80°C |
||
| Ovine wool cholesterol | Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
||
| Heparan sulfate | Reconstitution: 1 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
||
| Oleic acid/Gondoic acid | Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C |
||
| Heparin | Reconstitution: 50 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C |
||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Perfusion Buffer | Recipe: 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) Comments: Use when ice-cold |
||
| Douncing Buffer | Recipe: 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ Comments: Use when ice-cold |
||
| Panning Buffer | Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++ | ||
| Microglia Growth Medium (MGM) | Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish. |
||
| Collagen IV Coating | Recipe: MGM containing 2 μg/mL collagen IV | ||
| Myelin Seperation Buffer | Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Comments: Mix well after the addition of CaCl2 and MgCl2 |
||
| TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC) | Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH. |
References
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).
- Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development and Plasticity. Trends Immunol. 36 (10), 605-613 (2015).
- Lou, N., et al. Purinergic receptor P2RY12-dependent microglial closure of the injured blood-brain barrier. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (4), 1074-1079 (2016).
- Haynes, S. E., et al. The P2Y12 receptor regulates microglial activation by extracellular nucleotides. Nat Neurosci. 9 (12), 1512-1519 (2006).
- Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
- Lavin, Y., et al. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).
- Hoeffel, G., Ginhoux, F.
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).
- Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
- Herz, J., Filiano, A. J., Smith, A., Yogev, N., Kipnis, J. Myeloid Cells in the Central Nervous System. Immunity. 46 (6), 943-956 (2017).
