Yalıtım ve dinamik bir teşvik etmek kemirgen Microglia kültürünü Morfoloji Serum-Alerjik orta Ramified

Summary

Ayrıntılı olarak mikroglial işlevini anlamak için çaba olgun vivo içinde microglia özelliklerini özetlemek mikroglial kültür modellerin eksikliği tarafından engel. Bu iletişim kuralı sağlam çok ramified olgun sıçan microglia tanımlanan-orta koşullar altında yaşama korumak için tasarlanmış bir yalıtım ve kültür yaklaşım anlatılmaktadır.

Abstract

Microglia tüm merkezi sinir sistemi (MSS) hücreleri % 5-10'u temsil ve geliştirme, homeostasis ve hastalık sırasında önem onların katkıları nedeniyle giderek çizim. Makrofajlar ayrıntılı olarak incelenmiştir rağmen yıl, özel şekil-in microglia, MSS doku yerleşik makrofajlar, kısmen olgun mikroglial özetlemek için yetenek sınırlamaları nedeniyle büyük ölçüde gizemli kalmıştır Kültür özelliklerinde. Burada, saf microglia--dan olgun kemirgen beyin hızlı yalıtım için basit bir yordam gösterilmektedir. Biz de mikroglial canlılık yüksek düzeyde zaman içinde destek serum serbest kültür koşulları tanımlamak. Bu tanımlanan-orta koşullar altında kültürlü Microglia sergi ayrıntılı ramified süreçleri ve dinamik gözetim davranış. Biz kültürlü microglia serum maruz kalma bazı etkileri göstermek ve nasıl bu serum-Alerjik kültürler hem serum maruz kültürler gibi microglia içinde vivokarşılaştırmak tartışıyorlar.

Introduction

CNS parankimi makrofajlar microglia nöronal devreler ve gliyal sinyal ağları geniş bir dizi ile etkileşim. Geliştirme ve homeostasis sinaptik budama, apoptotik hücre Gümrükleme ve nöronal işlemleri^1,2geçici etkileşimleri aracılığıyla beynin hayati rol oynarlar. Microglia nörolojik yaralanmaları, erken müdahale uzun, ince süreçlerinin lezyon siteler inflamatuar yanıt koordine etmek ve kanama^3,4sınırlamak için uzanan vardır. Mikroglial morfoloji ve işlev değişiklikleri akut ve kronik CNS yaralanmaları her yerde vardır ve Morfoloji, Yerelleştirme ve hastalık Birleşik¹çeşitli bir yelpazede inflamatuar aracılar ifade microglia sergi değişmiş. Nörodejeneratif hastalıklar için risk alter mutasyonlar kez ağırlıklı olarak veya sadece hastalık patogenezinde veya ilerleme^{5 microglia için kritik bir rol işaret olduğu gibi MSS microglia tarafından ifade edilir insan genetik çalışmalar göstermektedir} . Yaralanma ve hastalık onların önem dikkate alındığında, mikroglial Biyoloji anlayışı sürdürmek yeni tedavi yaklaşımları geliştirmek için bir yüksek önceliktir.

Mikroglial Biyoloji anlayış için birçok kritik gelişmeler teknikleri ve kültür yöntemleri, gen ifade profilleri ve işlev tanımları da dahil olmak üzere diğer makrofaj nüfus çalışmalarda keşfetti mekanizmaları extrapolating tarafından ortaya çıktığı / morfolojik Birleşik. İşlevler genellikle oynamaya CNS manzara içinde şaşırtıcı şekilde makrofaj Genelleştirilmiş, microglia olmakla birlikte, kendilerini son derece uzmanlaşmış, ramified bir morfoloji ve onları diğer doku dışında setleri benzersiz gen ifade imza sergilenmesi makrofajlar⁶. Microglia--dan en diğer doku makrofajlar ayrı bir soy var; MSS ilkel hematopoiesis bir erken embriyonik dalga sırasında kolonize ve hayatı, bağımsız olarak kesin hematopoiesis⁷katkıları boyunca kendini yenilemek. Yetişkin microglia tam olgun gen ifade imza kadar ikinci doğum sonrası hafta⁸elde değil. Çevreleyen doku çevre ipuçları MSS sınırlı maruz kalma kan - beyin bariyerini⁹tarafından verilen kan kaynaklı faktörler içeren özel doku makrofaj özellikleri⁶, dikte içinde önemli bir rol oynamaktadır.

CNS homeostazı ve hastalığı mikroglial katkıları tam olarak anlamak için bir engel olduğunu olgun microglia görülen vivo içinde arıtılmış hücreleri ile özel özelliklerini recapitulating zorluk tüp bebek. İzole etmek için pek çok yöntem geliştirilmiştir ve kültür olduğu gibi microglia ama çoğu yaklaşımlar hücre survival desteklemek için serum güveniyor. Biz doğal olarak değişken bir reaktif biyoaktif molekülleri geniş bir dizi içeren, protozlar bir Morfoloji teşvik çünkü nükleer silahların yayılmasına karşı microglia ile çalışma artış özellikle sorunlu olduğunda, serum, bu ek göstermiştir ve microglia maruz kaldığında faktörlerin kan - beyin bariyerini bozulma sonra bulaşan kan için artan fagositoz⁹ vivo içinde sık görülen. Bu ölçümler tarafından serum Günese maruz kalan hücreleri microglia yaralanma veya hastalık durumlarında benzer ama tür değişiklikler azalır ne zaman microglia kültürlü CSF-1 (veya IL-34) içeren tanımlanmış büyüme orta, TGF-β, kolesterol ve selenit.

Bu iletişim kuralı Juvenil sıçan microglia kısa bir süre önce iş⁹' a ilgili serum-Alerjik koşullar altında kültür için ayrıntıları sağlar. Bu iletişim kuralı için rats postnatal gün 21-30 (P21 - P30) gelen aerodinamik ancak verim ve genel canlılığı türler ve hayvan yaş bağlı olarak değişir ama microglia sıçanlar ve fareler her yaştan itibaren yalıtmak için adapte edilebilir. Azami verimi ve biraz çocukça microglia kullanırken en iyi canlılık elde edilir (~ P9), verimleri ve yavaş yavaş biraz daha düşük seviyeleri yetişkin hayvanlarda sivrilen canlılığı ile. Microglia de fare ayrılmış olabilir ama biz fare hücreleri anlamlı olarak daha yüksek verimleri, canlılık ve ramified türleri Morfoloji, karmaşıklığı fare hücre kültürlerinde serum-Alerjik karşılaştırıldığında gösterir ki bulduk. Hayvanlar P50 daha büyük yaş bu iletişim kuralıyla değerlendirilmemiştir. Bu immunopanning yalıtım yordamı sırasında yalıtım mikroglial transkripsiyon profilleri değişiklikleri en aza indirmek için ve hücrelerin aşağı akım canlılığı en üst düzeye çıkarmak için optimize edilmiştir. Bu teknikleri ve medya formülasyonları kullanılarak, yüksek-canlılık birincil kültürler hafta boyunca sürekli olabilir. Bu koşullar altında kültürlü Microglia son derece ramified bir Morfoloji hızlı uzantısı ve geri çekme işlemleri içeren sergi ve nispeten düşük oranları yayılması. Biz serum-pozlama bu özellikler üzerinde önemini vurgulamak ve diğer yaklaşımlar göre bu yöntemin zayıf ve güçlü tartışıyorlar.

Protocol

Kemirgenler ilgili tüm yordamlar için ulusal ve devlet yasaları ve politikaları ile uyumlu Stanford Üniversitesi yönergeleri standartlarla uyumlu. Tüm hayvan yordamları laboratuar hayvan bakım Stanford Üniversitesi'nin Yönetim Panel tarafından kabul edildi.

Not: Tüm çözüm ve tampon besteleri Tablo malzemeleritemin edilmektedir.

1. CD11b Immunopanning (gün 0) için bir petri hazırlayın

Not: her 1-2 çocuk sıçan beyin yerine 1 immunopanning yemek hazırlamak.

1. 25 mL 50 mM Tris pH 9,5 çözüm için 15 cm Petri kabına ekleyin.
2. Keçi Anti-fare IgG (H + L zincirler) yemek 6 µg/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin. Eşit dağıtmak için plaka girdap.
3. Yemek için 1-3 h 37 ° C'de kuluçkaya
4. Durulama yemekleri üç kez ile DPBS⁺⁺ (fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) Ca^{2 +} ve Mg^{2 +}ile), daha sonra 1 µg/mL OX42 antikor içeren arabellek kaydırma bir çözüm ile değiştirin. Gecede, oda sıcaklığında bulaşıkları düz bir yüzeye bırak.

2. doku koleksiyonu (1 gün)

Not: Bu protokol ~ 3-4 h almalıdır.

1. Başlamadan önce tüm çözümler steril ve soğutulmuş buz üzerinde olduğundan emin olun. Tüm aletleri buz üzerinde sakin ve etanol ile kullanmak için önceden sterilize.
2. Aşağıdaki uygun yasal prosedürleri, karbon dioksit boğulma tarafından bir çocuk laboratuvar sıçan kurban.
   Not: Alternatif olarak, ketamin/xylazine (100-200 µL 24 mg/mL ketamin bas, 2.4 mg/mL xylazine) öldürücü bir doz ile genç hayvanlar kurban. 14 günden daha az sürede hayvanlardır ketamin/xylazine kullanılmalıdır. Birden fazla hayvan kullanıyorsanız, bir hayvandan dokuya ayıklamak ve buz sonraki hayvanlar geçmeden önce önceden soğutulmuş DPBS⁺⁺ yerleştirin.
3. Bir hindpaw tutam ve devam etmeden önce hayvan tam yanıt vermeyi durdurma sorununu sağlamak.
4. Transcardially buz gibi perfüzyon arabellek arabellek açık bitene 27½-G iğne kullanarak 10-30 mL hayvanla sıvı.
   Not: Perfüzyon arabellek hacmi hayvan boyutu/yaş bağlı olarak değişir.
5. Hemen perfüzyon sonra hayvan başkanı kaldırın. Omurilik oksipital düzgün her iki tarafta diseksiyon makasla kesme gelen, beyin zarar vermemeye dikkat et. Kesmek sonra her tarafı dikkatle, Paryetal ve frontal kemik Burun kemiği doğru boyunca parça parça kesin. Forseps ile dikkatli bir şekilde geri kafatasının üst çekin, hızlı bir şekilde beyin (veya ilgi CNS yapıları) kaldırmak ve önceden soğutulmuş DPBS⁺⁺ buzda yerleştirin.
6. Tüm kalan hayvanlar için yineleyin.
   Not: Tüm devam etmeden adımları laminar akış başlıklı uygun steril koşullarda gerçekleştirilmesi gerekiyor.

3. mekanik ayrışma (1 gün)

1. Tüm beyin topladıktan sonra bir beyin bir soğuk neşter bıçakla buzda Petri kabına 1 mm³ parçalar halinde doğrayın ve bir buz gibi dounce homogenizer 5-7 mL buz gibi douncing arabellek ile aktarın. Bir beyin bir zaman ayırmak.
2. 10-20 nazik ve eksik vuruş ile gevşek-montaj dounce homogenizer kullanarak doku ayırmak. Değil doğrudan homogenizer alt doku ezmek, ama bunun yerine doku piston kenarlarına ve homogenizer arasındaki boşluğu ile itmek için dikkat ediniz.
3. Pistonlu Hava kabarcıkları giriş önlemek için dikkatli bir şekilde çıkarın. Kötü Disosiye doku parçaları homogenizer altına yerleşmek izin ve süpernatant bir yeni soğutulmuş 50 mL konik tüp için transfer.
4. Kaldırılan birimin taze douncing arabellek ile değiştirin ve 3,2 3,3 için toplam 3-4 tur veya tüm doku ayrışmış kadar aygıtlarından. Her beyin için yordamı yineleyin.

4. miyelin kaldırma (1 gün)

Not: Miyelin kaldırma microglia hayvanlardan P12 büyük yalıtım için kullanılır.

1. Hücre süspansiyon 25 mL pipet kullanarak 50 mL konik tüp hacmi ölçmek, sonra buz gibi douncing arabellek 33,5 ml toplam ses seviyesini ayarlamak için ekleyin.
2. Miyelin ayrılık arabellek (MSB) 10 mL hücre süspansiyon için iyice tüp birkaç kez ters çevirme tarafından ekleyip karıştırın. Bu da % 23 bir son konsantrasyon MSB 43,5 mL hacminde yol açar.
3. Hücreleri 500 x g yavaş frenleri 4 ° c de 15 dakika santrifüj kapasitesi.
   Not: Santrifüj yaklaşık 1,5-2 yavaşlatmak için dakika sürer. Bu miyelin ve ölü hücre artıkları, biraz bulanık süpernatant ve canlı hücreler için zenginleştirilmiş bir daha küçük Pelet üst tabakası oluşturur.
4. Miyelin/enkaz ve süpernatant bir pipet ile üst katmanı kaldırın. Daha bunun mümkün olduğunca kaldırılır olarak sağlamak için üst tabaka kaldırırken ilgilen.
5. Hücre Pelet arabellek kaydırma 12 mL içinde resuspend. Yavaşça kalmış olabilecek hücreleri herhangi bir kümeleri kadar kırmak için hücre süspansiyon triturate.

5. Immunopanning (1. gün)

1. Hücre süspansiyon büyük enkaz veya hücre kümeleri kaldırmak için 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla geçmek.
2. Üç kez DPBS⁺⁺ile OX42 kaplı kaydırma çanak durulayın. Plakasına izin vermeyen yıkar arasında tamamen kuru.
3. Son DPBS⁺⁺ yıkama dökün ve filtre uygulanmış hücre süspansiyon kaydırma yemek için geçerlidir. Yavaşça hücreleri dağıtmak için plaka girdap, sonra plaka hücreleri bağlı kalmak izin vermek 20 dakika oda sıcaklığında düz bir yüzey üzerinde kuluçkaya. 20 dk daha uzun kuluçkaya değil veya hücreleri yemek kurtarmak çok zor olacak.
4. DPBS⁺⁺ ile kaydırma çanak yapışık olmayan hücreleri kaldırmak için 10 kez yıkayın. Microglia-ecek var olmak sıkıca plaka bağlı, bu yüzden diğer yapışık olmayan hücreleri kaldırılmasını sağlamak için her durulama ile plaka girdap.
5. Son DPBS⁺⁺ yıkama dökün ve 15 mL DPBS⁺⁺ ve 200 μL tripsin (%1.25 stok çözelti) adıyla değiştirin.
6. Yemek için ≤10 min trypsinize için % 10 CO₂ 37 ° C'de kuluçkaya.
   Not: 10 dk daha uzun süre devam etmeyin veya microglia kaldırmak zor olacak.
7. Trypsinization, 10 dakika sonra microglia hala plakasına kalmış olacak. 2 x tripsin kaldırmak, buz gibi microglia büyüme orta (MGM) 12 mL ile değiştirmek için DPBS⁺⁺ ile nazikçe yıkayın ve tripsin/DPBS⁺⁺ dökün.
8. Hücre/substrat etkileşim zayıflatmak ve yemek emin olun yardım için tabak 2 min için buz üzerinde kaydırma kaydırma çanak alanlarında kurumasını önlemek için düz yerdir.
9. Şiddetle kaydırma çanak hücreleri kurtarmak için bir 10 mL pipet ve damlalıklı denetleyicisinde yüksek hız ile pipet. 16 x 16 kılavuz sıvı akışı ile denemek ve tüm hücre kaldırma pipet çizin.
10. Hücreleri tabaktan ayırdıktan emin olmak için 20 X büyütme, mikroskop altında hücreleri denetleyin. Mark noktalar nerede hücreleri hareketsiz şaşırıp kalmış yemeğin üstüne ve tekrar bu alanlarda pipetting.
11. Hücre süspansiyon ve aliquot 3-4 mL başına 15 mL konik tüp süpernatant toplamak. 500 x g yavaş frenleri 4 ° c de 15 dakika çevir.
    Not: microglia küçük bir birim aracılığıyla iplik için hücre kurtarma maksimum sağlar.
12. MGM 0.5 mL ile hücre Pelet bırakarak süpernatant, Aspire edin.
13. Her Pelet içinde kalan MGM resuspend ve tüpler hücrelerden Havuzu.
14. Hemasitometre içeren hücreleri saymak.
15. Adım 6 - 7 uygulamaya bağlı olarak açıklandığı gibi plaka hücreleri.
16. Kültür hücreleri 37 ° c % 10 CO₂.
    Not: Hücreler kültür için ilâ 3-4 hafta düzenli medya değişikliklerle veya medya değişiklik ile bir hafta olabilir.

6. spot doku kültürü plakaları/Coverslips (gün 1) kaplama

1. Kollajen IV kaplama doğrudan bir 24-şey Anyonik/Katyonik kaplamalı doku kültürü tabak merkezinde 15 µL plaka ( Malzemeler tablo Ayrıntılar için bakınız) ve % 10 CO₂37 ° C'de 15 dakika kuluçkaya.
2. Hemasitometre hücrelerle sayım sonra 2.3 x 10⁵/mL MGM hücrelere oranında seyreltin. Kollajen IV spot ve hemen plaka 15 µL hücre süspansiyon bu noktaya Aspire edin; Bu 3,5 x 10³ hücreleri/spot verecektir. 5-10 dk 37 ° c % 10 CO₂ hücreler uygun, TGF-B2/IL-34/kolesterol içeren büyüme orta (TIC) CO_2-500 µL equilibrated eklemek izin vermek için hafifçe kuyuya kuluçkaya.
3. Eğer coverslips, ilk kat steril cam coverslips ile 10 µg/mL manevra-D-lizin (PDL) H₂O RT, 1 h için kaplama 3 kez H₂ile O yıkama ve bir başlık UV ışık altında kurumaya bırakın. Coverslips üzerine spot kaplama coverslips kuru olduğunda, adım 6.2 içinde açıklandığı gibi devam edin.

7. RNA/Protein izolasyon kaplama

1. 10⁴ hücreleri/iyi CO₂ gün 1, bir 24-şey Anyonik/Katyonik tüm alan doku kültürü plaka kollajen IV kaplama ile kaplı ve için 10 dk - 1 h % 10 CO₂, 37 ° C'de kuluçkaya sonra kaldırmak ve hemen 3-5 x plakası kat equilibrated TIC medya.
2. 2 günde bir % 50 medya değişiklik her biri için de bir gün sonra hazırlık yapmak. Ölü hücreleri iyi ortasında küme, bu yüzden oradan medya almak eğilimindedir.
3. Kültürleri korumak için 2-3 günde bir % 50 medya değişiklik yapmak. Ortam değişikliğine kültürler için istenmeyen bir değişken varsa, hücreleri yaklaşık 1 hafta 3 hafta düzenli bakım ile karşı herhangi bir medya değişiklik olmadan hayatta kalamaz.

Representative Results

Bu iletişim kuralı Juvenil sıçanlarından emir kültür yüksek saflıkta ramified microglia için bir yöntemi açıklar. Benzer sonuçlar olgunlaşmamış, perinatal ve Yetişkin Hayvanlar, kullanarak aşağıda anlatıldığı gibi alınabilir. Hücre izolasyonların genellikle ince nüanslar ve hücreleri ölmek için birçok fırsat içerir beri kalite kontrol denetim noktaları çeşitli adımlar başarı belirlemenize yardımcı olması için kullanılır. Genellikle birden çok adımda yalıtım Protokolü (şekil 1A) adlı bir hemasitometre kullanarak hücre süspansiyonlar izlenir. Başarılı izolasyonların 2.5-5 x 10⁵ hücreleri/çocuk hayvan verim. 2. 5 x 10⁵ hücreleri/hayvan için verimleri daha yakın hayvanlardan P30 büyük izole hücreleri gösterir, ancak P7 - P15 hayvanlardan verimleri daha yakın 5 x 10⁵ hücreleri/hayvan, göster. Toplam hücre izleme ötesinde sayar Protokolü ' nün boyunca bu şekilde izole microglia var çünkü yuvarlak veya bipolar Morfoloji kültüründe ilk birkaç gün boyunca zor olabilir izole hücre, genel sağlık belirlemek önemlidir . Burada, biz P25 microglia görüntülerini faz kültüründe yalıtım TIC ve % 10 fetal buzağı serum (FCS) (şekil 1B) içeren TIC sonra ilk 6 gün boyunca eklemiş.

Şekil 1: hücre sağlık yalıtım protokol sırasında ve 6 gün kültür değerlendirilmesi. (A)faz kontrast görüntüler hücre izolasyon yordam belirtilen adımları gösteren kalite kontrol noktalarında. Hücresel süspansiyonlar hücresel süspansiyon 9 µL % 0,4 trypan mavi bir hemasitometre üzerine yüklemeden önce 1 µL ile karıştırılarak görüntüsü. Kaydırma çanak diğer resimleri göster ve tüm görüntüleri 20 X büyütme, tek bir alan olarak gösterilir. Ölçek çubuğu, 200 µm. MGM, microglia büyüme orta. (B) saat ders mikroglial morfolojik değişiklikler ve nükleer silahların yayılmasına karşı 6 gün kültür Serumda serum-Alerjik TIC büyüme orta veya TIC artı % 10 fetal buzağı (FCS). CD11b-immunopanned hücreleri spot kollajen kaplı Anyonik/Katyonik kaplamalı doku kültürü plaka üzerinde kaplama ( Malzemeler tablo Ayrıntılar için bakınız), ve aynı alanda faz-kontrast her 24 h ölçek bar, 100 µm. TIC, TGF-B2/IL-34 tarafından yansıma / Kolesterol içeren büyüme orta. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Rutin değerlendirme sağlık ve canlılık izole hücre tekrarlanabilirlik ve deneyler başarısı için önemlidir. İşte MGM, TIC veya 7 gün vitro (DIV) bir canlılık tahlil ile sonra % 10 FCS ile desteklenmiş TIC kültürlü bir P21 hayvan izole microglia göstermektedir. Yalıtım başarılı olursa, kültürler arasında % 80-90 canlılığı ancak bu yapay olarak her ikisi için de hızlı yayılması şişirilir 7 DIV. varlığında serum sonunda kültürlü hücreleri bu ölçü tarafından % 100 canlılığı yakınındaki tırmanmaya sonra TIC içinde göster Serum Günese maruz kalan hücreleri ve hızlı fagositoz ölü hücre içinde bu kültürler (şekil 2A). Ek olarak güçlü hayatta kalma, kültürlü TIC hücreleri de hücreleri (şekil 2B, C) bir ramified Morfoloji FCS için karşılaştırıldığında tedavi gösterir.

Şekil 2: yaşama microglia MGM, TIC veya TIC + FCS yedi gün içinde kültür. (A)hücreleri P21 sıçanlarından emir izole edildi ve kültürlü microglia büyüme orta (MGM), TGF-B2/IL-34/kolesterol içeren büyüme orta (TIC), veya TIC + % 10 fetal buzağı serum (FCS). Her zaman noktada kültür orta calcein AM (1.33 µM final) ve etidyum homodimer (2.5 µM son) canlı hücreleri ve ölü hücreleri sırasıyla etiketlemek 15 dakika ile takıma. Hücreleri otomatik bir ImageJ komut dosyası kullanarak her alanda sayıldı. (B ve C) 7 DIV, sonra herhangi bir medya değişiklik ile hücreleri yetişen TIC (B) veya % 10 FCS (C) ile desteklenmiş TIC yukarıdaki gibi canlı ve ölü hücreleri etiketlemek için lekeli. Temsilcisi görüntüleri 10 X (sol) veya 40 X (sağda) amacı istimal alındı. Ölçek çubuğu, standart hata (SEM) ortalamaya 40 µm. hata çubukları temsil eder. Bu rakam Bohlen ve ark. güncellenmiştir ⁹ ve izni ile kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Başarılı izolasyonu ve kültürü son derece saf microglia göstermek için biz microglia P21 fareler gelen izole ve TIC veya % 10 FCS ile 8 gün boyunca takıma TIC bu hücreler kültürlü. Hücreler daha sonra sabit ve mikroglial işaretleri (Iba-1 ve CD11b) ve nükleer silahların yayılmasına karşı marker (Ki67, şekil 3A) ile lekeli. Hücre işaretler için boyama ek olarak, RNA-seq taze izole hücreleri üzerinde hücrelerin RNA profil değerlendirmek için güçlü ve hassas bir araç sağlar ve kültürlerin başlangıç saflık bilgilendirmek yardımcı olabilir. CD11b immunopanning genellikle CD11b küçük bir yüzdesi sonuç⁺ CD11b ek olarak nötrofil/monosit ertelenmiş⁺ microglia (şekil 3B). Bu hücreler TIC içinde bir kaç gün sonra ölecek ama daha önceki zaman noktaları analizlerini karmaşık hale getirebilir.

Şekil 3: saflık biçilen immünhistokimya ve RNA-devamı olarak kültürlü hücrelerinin (A)Microglia PDL/kolajen kaplı cam coverslips kaplama ve TGF-B2/IL-34/kolesterol içeren büyüme ortamda (TIC) 8 gün boyunca kültürlü P21 fareler, yalıtılmış. Hücreleri % 4 paraformaldehyde (PFA) oda sıcaklığında 10 dakika ile sabit ve bağışıklık lekeli Iba-1 ile (1:500), CD11b (1:1500) ve Ki67 (1:500). Kısaca, sabit hücrelerin % 0,1 deterjan ile bloke edildi (Ayrıntılar için yöntemleri tabloya bakın) ve % 10 normal eşek serum (NGS) oda sıcaklığında 1 h için. Hücreleri sonra birincil antikor NGS gecede 4 ° C'de % 1 ile % 0,1 deterjan ile inkübe Hücreleri 5 dk her PBS için üç kez yıkanmış. Hücreleri sonra tüm %1:500 1 ile % 0,1 deterjan ikincil antikorlar ile inkübe NGS oda sıcaklığında 1 h için. Hücreleri olduğunu tekrar PBS içinde üç kez yıkanmış ve montaj orta DAPI içeren monte. Temsilcisi görüntüleri 40 X büyütme oranında alındı. Ölçek bar, 50 µm. (B) temsilcisi hücre tipi belirli transkript taze izole ve kültürlü hücreleri tarafından ifadesi. Microglia P21 sıçanlarından emir izole ve doğrudan doğruya--dan immunopanning çanak RNA izolasyonu için lysed ve en az kirlenme diğer büyük CNS hücre tiplerinin (astrocytes, nöronlar, oligodendrocytes ve endotel hücreleri) RNA-seq. işaretleyicileri göster CD11b-immunopanned hücreleri. Nötrofil işaretleri taze izole hücrelerde (siyah) tespit edilir, ancak serum-Alerjik kültürlerde (gri) kazandı. Kültürlü hücreleri ortak makrofaj işaretleri düzeyi yüksek hızlı, ama özel mikroglial imza tanımlama işaretleri, hızlı bir şekilde downregulated kültürlü hücreleri tarafından vardır. Hata çubukları standart hata ortalamaya (SEM) temsil eder. Veri Bohlen ve ark. değiştirilir ⁹ ve izni ile kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Canlılık ve hücre işaretçileri için boyama hayatta kalma belirlenmesi ve saflık hücrelerin sağlar, ancak sınırlı bilgi kültür dinamikleri üzerinde sağlar. Burada 14 DIV TIC sonra P21 sıçan microglia hızlandırılmış bir film hazırladık. İki hafta sonra serum-Alerjik kültürleri ile hızlı işlem uzantıları ve retractions yemek boyunca dinamik gözetim davranış göstermek ( film 1bakınız). Ayrıca, biz daha önce serum pozlama bunlar devlet özelliklerini microglia, dinlenme dönüşümleri kalıcı morfolojik ve fagositik değişiklikler sonucu bulduk. Biz TIC içinde microglia 5 gündür kültürlü bir film dahil sonra % 10 FCS maruz ( Film 2bakınız).

Film 1: tanımlanan-orta microglia kültürler göstermek ramified Morfoloji dinamik süreçler ile. Microglia Anyonik/Katyonik kaplamalı doku kültürü kolajen kaplı plakalar kaplama ve 14 gün boyunca TIC kültürlü P21 ispiyoncu, spot yalıtılmış. 14 DIV görüntüleri her 3 dakikada toplanmıştır. 6 kare/s film çalış ve zaman damgası sağ alt köşedeki görüntüleme süresini gösterir h:min. içinde film Bohlen ve ark. yeniden oluşturulur ⁹ ve izni ile kullanılır. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Movie 2: Serum pozlama tetikler tanımlanan-orta mikroglial kültürlerde hızlı bir morfolojik değişim. Microglia Anyonik/Katyonik kaplamalı doku kültürü kolajen kaplı plakalar kaplama ve 5 gün boyunca TIC kültürlü P21 ispiyoncu, spot yalıtılmış. 5 DIV, görüntüleri her 5 dk. hareketliliği/Morfoloji, sonra 2:55 at (2 saat, 55 dk) kaydedildi temel toplanmıştır, % 50 medya Değiştir % 10 son bir konsantrasyon FCS eklemek gerçekleştirildi. Hücre için bir ek 7 h görüntüsü. 6 kare/s film çalış ve zaman damgası sağ alt köşesinde h:min. Bu videoyu izlemek için buraya tıklayın lütfen görüntüleme süresini gösterir. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Discussion

Microglia sentinel bağışıklık hücreleri MSS gördükleri için çevresel değişiklikler oldukça tepkili olduklarını; Bu nedenle, büyük bir özenle hücrelerindeki inflamatuar yanıt onların izolasyon ve kültür⁸sırasında en aza indirmek için gereklidir. Bu hız ve sıcaklık bu protokolüyle içinde gerçekleştirilir. Böylece tüm Santrifüjü adımları 4 ° C'de gerçekleşmesi mümkün büyük ölçüde harekete geçirmek, azaltır zaman buz üzerinde veya 4 ° C'de hücreler tutmak, hayvanlar ile buz gibi perfüzyon tampon periosteum ve protokol doku arasındaki süreyi en aza indirmek için düzenlenmiştir çıkarma ve hücreleri kültür. Gen ifade desenleri taze izole hücre değerlendirmek, hücre lysates doğrudan doğruya--dan CD11b immunopanning yemek trypsinization en azından yalıtım kaynaklı değişiklikleri tutmak için önce hasat. Bu unutulmamalıdır bu bile dikkatli bir şekilde izole microglia hemen sonra muhtemelen nedeniyle tanıma özünde yalıtım yordamı ile ilişkili hasar ilişkili sinyallerin ılık sıcaklıklarda yerleştirilen bir enflamatuar yanıt yürütmek. Protokol başarıyla gerçekleştirildi, 2.5-5 x 10⁵ hücreleri/çocuk sıçan bekleniyor.

Hücre izolasyon Protokolü burada son derece belirli hücreleri CD11b + perfused CNS⁹yalıtmak için sağlanan. Her ne kadar bu hücre nüfus ağırlıklı olarak microglia oluşan, Ayrıca diğer myeloid nüfus Perivasküler makrofajlar, meninjeal makrofajlar, choroid plexus makrofajlar, monosit ve nötrofil¹⁰gibi düşük seviyelerde içerir. Koroid ilişkili Miyeloid hücreleri aslında tanıma ve doku ayrılma öncesinde choroid plexus kaldırılması ortadan kaldırılabilir. Meninkslerde de bir ölçüde kaldırılabilir, ama tüm meninjeal doku ortadan kaldırılması tam burada açıklanan hızlı yalıtım için hedeflenen zaman dilimleri içinde pratik değildir. Bu nedenle, değişkenlik meninkslerde eksik kaldırılması nedeniyle sınırlamak için biz meninkslerde kaldırmaz. Monosit/nötrofil izole malzeme içinde dolaşan sayısını en aza indirmek için aynı zamanda temiz bir perfüzyon önemlidir ve biz genellikle kötü derin doku atın. Bile mükemmel perfüzyon ile izni kan varlığı eritrositler arıtma boyunca hücre topakları içinde küçük bir miktar ile belirgin olarak mutlak değildir. Böylece, nötrofil ve monosit küçük seviyesini co saflaştırılmış ve farklı bir imza taze izole hücre transcriptomic profillerde katkıda bulunmak. Ancak, hücre dolaşan serum-Alerjik TIC medyada hızla ölecek ve onlar hayatta ve kültürleri içeren serum çoğalırlar devam edebilirsiniz, ancak kalıcı kirleticiler, temsil etmemektedir.

Sağlıklı, canlı bir kültür elde etmek için başka bir önemli nokta mekanik ayrışma adımları sırasında dikkat çekmek için olduğunu. Douncing birçok nöronlar, glia ve diğer öldürürken CNS hücreleri, microglia (microglia da bitti-douncing tarafından öldürülmüş olabilir rağmen) nispeten zarar görmeden bu ayrılma hayatta. Eğer doğru yapılırsa, bu iletişim kuralı hücre verimleri o proteolitik ayrılma kullanarak elde edilen karşılaştırılabilir sonuçları, potansiyel olarak doku inflamatuar değişkenleri semptomlarıdır ise yanıt-e doğru yüksek sıcaklıklardaki kaçınılmalıdır. Mekanik doku ayrışma birbirini izleyen eksik mermi gerçekleştirerek, tek hücre süspansiyon genel kültür üzerindeki mekanik stres miktarını en aza indirerek hasat edilebilir.

Burada açıklanan immunopanning Protokolü microglia yalıtmak için bir güvenilir ve tekrarlanabilir bir yoldur, ama diğer benzer yöntemleri kullanılabilir. Manyetik izolasyon ile manyetik aktif hücre miyelin tükenmesi ve CD11b seçimi sıralama kullanarak benzer sonuçlar elde etmiş olursunuz. En yüksek kalite Kültür tarihi için sağlamıştır, daha az özel ekipman için ve hemen önce kültür hücreleri antikor demir oksit Birleşik giriş gerektirmez çünkü burada immunopanning yöntemi üzerinde odaklanmıştır. Mikroglial yalıtım için yaygın olarak kullanılan başka bir bona fide microglia yüzeyi kullanarak diğer CD11b + Miyeloid kirletici üzerinden arınma için protokoller bulunmaktadır o güncel yaklaşımlar üzerinde büyük bir avantaj olan Akış Sitometresi yaklaşımdır TEMEM119⁸gibi imza işaretleri karşı antikor. Floresans aktif hücre sıralama sonuçlar son derece saf hücre popülasyonda rağmen aynı zamanda hücreleri için ek stresleri dayatır ve daha düşük canlılık kültürler veya düşük verimleri neden olabilir. Genel olarak, tekrarlanabilirlik ve saflık hücre nüfusunun en üst düzeye çıkarmak için etiket içermeyen yoğunluğu Santrifüjü ve shake-off hazırlıkları üzerinde antikor tabanlı yöntemleri üzerinde odaklanıyoruz.

Bu iletişim kuralı Juvenil sıçan microglia kültür için optimize edilmiş iken, microglia çeşitli çağlardan kültür için kullanılabilir; Toplam hücre verimleri maksimal mikroglial genişleme zirvesine geçtikten sonra 1 - 2-hafta-yaşlı fareler ve daha önce büyük doku hücrelerinin kurtarma çalışmasına engel yapısal düzenlemeler vardır. Microglia Ayrıca, izole ve fare ve insan dokusu ile fare veya insan epitopları için belirli bir uygun Monoklonal antikor CD11b antikor değiştirerek kültürlü. Fare ve insan microglia Bu kültür koşullarda hayatta kalmak, onlar ne zaman fare hücrelere göre morfolojik farklılıklar gösterir. Fare hücreleri ramified Morfoloji korur ancak insan hücreleri izole ve bu prosedüre göre kültürlü neredeyse tek tip bir protozlar Morfoloji varken süreçler, ayrıntılı bir şeyin yok.

İzole microglia gerekli deneyleri bağlı olarak farklı şekillerde kaplama. (Olarak canlı/ölü deneyleri ve morfolojik filmler burada gösterilen resimli) en iyi sonuçlar için 3.5 x 10³ hücreleri kollajen IV bir 10dk kaplama sonra 24-şey Anyonik/Katyonik kaplamalı doku kültürü plaka kuyusu ortasına kaplama "nokta" Yukarıdaki Protokolü nitelendirdi. Alternatif olarak, çok sayıda bir yalıtım RNA gibi hücrenin gerektiren deneyler için 3-5 x 10⁴ hücreleri 24-şey plaka kuyu 10 dakika sonra 1 h kollajen IV kaplama kaplama. Biraz daha düşük canlılık gösterdi daha yüksek yoğunlukları hücreleri kaplama ve spot hücrelere kıyasla daha az karmaşık Morfoloji, muhtemelen inflamatuar sinyalleri yanıt yalıtım olarak salgılanan etkisi nedeniyle tedavi. İmmünhistokimya veya cam coverslips gerektiren görüntüleme, hücreleri en iyi hayatta kalma sergi ve coverslips ilk ne zaman Morfoloji PDL ile kaplı sonra yukarıda açıklandığı gibi kolajen IV kaplı. Çok sayıda koşulları gerektiren deneyleri için hücre canlılığı da 96-şey veya 384-şey kolajen kaplı levha yüksektir. Her koşulda, hücreleri yuvarlak veya bipolar başlayın, gün 3-4, etrafında süreçleri elde etmek ve almak 5-10 Resim 1 ve film 1' de gösterildiği sonuna kadar ramified Morfoloji sergilemek yaşam başlar.

Dinamik gözetim davranış ve Morfoloji microglia vivo içindedinlenmek için benzer sergileyen bir kültür bu protokol sonuç varken bu hücreler microglia vivo içindeözel gen ifade imzası tam olarak korumak başarısız. Çok kültürlü hücrelerde gözlenen kalıcı gen değişiklikleri genellikle embriyonik veya kızarmış CNS⁹' da görülen değişiklikleri yansıtır. Bu nedenle, bu iletişim kuralı bir adım microglia gerektiren kültür ve serum uyarılmış değişiklikleri hayatta kalmak için koşullar anlamada gösterir, ancak ileri çalışmalar mikroglial ince ayar MSS tarafından sağlanan dışsal sinyalleri anlamak için gerekli özellikleri ve gen ifadesi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594	Invitrogen	Cat# 11055	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan sulfate	Galen Laboratory Supplies	Cat# GAG-HS01
Heparin	Sigma	Cat# M3149
Peptone from milk solids	Sigma	Cat# P6838
TGF-β2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R&D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Collagen IV	Corning	Cat# 354233
Oleic acid	Cayman Chemicals	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Calcein AM dye	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamine	Gibco	Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine	Sigma	Cat# A9165
Insulin	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
Sodium selenite	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (high glucose)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poly-D-Lysine	Sigma	Cat# A-003-E
Primaria Plates	VWR	Cat# 62406-456
Name	Company	Catalog Number	Comments
Stock reagents
Apo-transferrin			Reconstitution: 10 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
N-acetyl cysteine			Reconstitution: 5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Sodium selenite			Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:25,000 Storage: -20°C
Collagen IV			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -80°C
TGF-b2			Reconstitution: 2 mg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
IL-34			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -80°C
Ovine wool cholesterol			Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparan sulfate			Reconstitution: 1 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Oleic acid/Gondoic acid			Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparin			Reconstitution: 50 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Perfusion Buffer			Recipe: 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) Comments: Use when ice-cold
Douncing Buffer			Recipe: 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ Comments: Use when ice-cold
Panning Buffer			Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM)			Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating			Recipe: MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer			Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Comments: Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)			Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.