Isolamento e cultura de roedor Microglia para promover uma dinâmica ramificada morfologia em meio livre de soro

Summary

Esforços para entender a função microglial no detalhe tem sido prejudicados pela falta de modelos de cultura microglial que recapitular as propriedades de micróglia maduro na vivo . Este protocolo descreve uma abordagem de isolamento e cultura projetada para manter a sobrevivência robusta de rato maduro altamente ramificados microglia sob condições definidas e médias.

Abstract

Microglia representam 5-10% de todas as células do sistema nervoso central (SNC) e são cada vez mais atenção devido a suas contribuições durante o desenvolvimento, homeostase e doença. Embora os macrófagos têm sido estudados em detalhe por décadas, recursos especializados de micróglia, os macrófagos de tecido-residente do SNC, mantiveram-se em grande parte misteriosa, em parte devido às limitações na habilidade de recapitular microglial maduro Propriedades em cultura. Aqui, podemos ilustrar um procedimento simples para o isolamento rápido de puro microglia no cérebro de roedor maduro. Descrevemos também condições de cultura livre de soro que suportam níveis elevados de microglial viabilidade ao longo do tempo. Microglia cultivada sob essas condições definidas e médias apresentam elaborados processos ramificados e comportamento dinâmico de vigilância. Podemos ilustrar alguns efeitos de exposição de soro na microglia culta e discutir como essas culturas isento de soro comparam com culturas expostas ao soro, bem como micróglia em vivo.

Introduction

Como os macrófagos do parênquima CNS, microglia interagir com uma vasta gama de circuitos neuronais e gliais redes de sinalização. Eles desempenham um papel vital no desenvolvimento e na homeostase do cérebro através de poda sináptica, afastamento de célula apoptótica e transitórias interações com processos neuronais^1,2. Microglia são primeiros respondentes a lesões neurológicas, estendendo seus processos longos e finos para sites de lesão para coordenar as respostas inflamatórias e limitar o sangramento^3,4. Alterações na função e morfologia microglial são onipresentes em lesões de CNS agudas e crônicas, e microglia exposição alterou a expressão de mediadores inflamatórios em uma variada gama de Estados de doença¹, localização e morfologia. Estudos de genéticos humanos indicam que mutações que alteram o risco para doenças neurodegenerativas são frequentemente predominantemente ou exclusivamente expressa pela micróglia no SNC intacta, apontando para um papel crucial para microglia na patogênese da doença ou progressão⁵ . Dada sua proeminência em ferimentos e doenças, promover a compreensão da biologia microglial é uma alta prioridade para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas.

Muitos avanços importantes para a compreensão da biologia microglial surgiram extrapolando as técnicas e mecanismos descobertos em estudos de outras populações de macrófagos, incluindo métodos de cultura, perfis de expressão de gene e definições de funcional / morfológica dos Estados. Embora generalizada macrófago funções muitas vezes jogar em formas surpreendentes dentro da paisagem do CNS, microglia são eles próprios altamente especializado, exibindo uma morfologia ramificada e uma assinatura de expressão de gene único que os distingue de outros tecidos os macrófagos⁶. Microglia tem uma linhagem que é diferente da maioria dos outros macrófagos de tecido; Eles colonizam o CNS durante uma onda de embrionária precoce da hematopoiese primitivo e auto renovam ao longo da vida, independente de contribuições de hematopoiese definitivo⁷. A assinatura de expressão de gene totalmente maduro do adulto microglia não é alcançada até a segunda semana pós-parto⁸. Dicas ambientais no tecido circundante desempenham um papel importante em ditar o macrófago tecido-específica características⁶, que no SNC inclui limitada exposição a fatores transmitidas pelo sangue, concedido pelo barreira hemato - encefálica,⁹.

Um obstáculo para compreender plenamente microglial contribuições para a homeostase do CNS e doença é a dificuldade de sintetizando as propriedades especializadas do maduro microglia visto na vivo com células purificadas in vitro. Muitos métodos têm sido desenvolvidos para isolar e cultura microglia intacta, mas a maioria das abordagens dependem de soro para apoiar a sobrevivência da pilha. Mostramos que além de soro, que é um reagente inerentemente variável que contém uma vasta gama de moléculas bioativas, é especialmente problemática quando trabalhar com microglia porque promove uma morfologia ameboide, aumentou a proliferação, e aumento da fagocitose⁹ muitas vezes visto em vivo quando microglia são expostas ao sangue a cargo de fatores após o rompimento da barreira do sangue - cérebro. Por essas métricas, células expostas ao soro se assemelham a micróglia em lesões ou doenças, mas tais alterações são reduzidas quando microglia são cultivadas em meio de crescimento definidos contendo CSF-1 (ou IL-34), TGF-β, colesterol e Selenito.

Este protocolo fornece detalhes sobre cultivo microglia juvenil rato sob condições isento de soro, relacionadas com o trabalho recentemente publicado⁹. Este protocolo foi racionalizado para ratos de pós-Natal dia 21-30 (P21 - P30), mas pode ser adaptado para isolar microglia de ratos e camundongos, de qualquer idade, embora o rendimento e a viabilidade global irão variar dependendo da espécie e idade do animal. Máximo rendimento e viabilidade ideal é alcançada quando usando um pouco imaturo microglia (~ P9), com rendimentos e viabilidade gradualmente afilado, um pouco mais baixos níveis em animais adultos. Microglia também pode ser isolado de ratos, mas achamos que pilhas do rato mostram significativamente mais elevados rendimentos, viabilidade e complexidade de morfologias ramificadas, quando comparado com as pilhas do rato em culturas isento de soro. Animais com idade superior a P50 não foram avaliadas com este protocolo. Este procedimento de isolamento de immunopanning foi otimizado para minimizar as alterações nos perfis transcriptional microglial durante o isolamento e para maximizar a jusante viabilidade das células. Usando estas técnicas e formulações de mídia, alta-viabilidade culturas primárias podem ser sustentadas por semanas. Microglia cultivada sob essas condições apresentam uma morfologia altamente ramificada envolvendo rápida extensão e retração dos processos e relativamente baixas taxas de proliferação. Podemos destacar a importância do soro-exposição sobre essas propriedades e discutir os pontos fortes e fraquezas deste método em relação a outras abordagens.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo roedores em conformidade com as diretrizes da Universidade de Stanford, que estejam em conformidade com políticas e leis estaduais e nacional. Todos os procedimentos de animais foram aprovados pelo painel administrativo da Universidade de Stanford no cuidado do Animal de laboratório.

Nota: Todas as composições de buffer e solução são fornecidas na Tabela de materiais.

1. preparar um prato de Petri para Immunopanning CD11b (dia 0)

Nota: Prepare 1 prato de immunopanning para cada cérebro de rato juvenil de 1-2.

1. Adicione 25 mL de solução de Tris pH 9,5 de 50 mM para uma placa de Petri 15 cm.
2. Adicione o anti-rato de cabra IgG (correntes de H + L) para o prato para uma concentração final de 6 µ g/mL. Redemoinho-placa para distribuir uniformemente.
3. Incubar o prato para 1-3 h a 37 ° C.
4. Pratos de lavar três vezes com DPBS +⁺ (fosfato salino (PBS) com Ca^{2 +} e Mg^{2 +}), em seguida, substituir com uma solução de tampão contendo 1 µ g/mL OX42 anticorpo de garimpar. Deixe os pratos durante a noite em temperatura ambiente sobre uma superfície plana.

2. tecido coleção (dia 1)

Nota: Este protocolo deve tomar ~ 3-4 h.

1. Antes de começar, certifique-se de todas as soluções são estéreis e refrigerados no gelo. Relaxa todos os instrumentos no gelo e esterilizar com etanol antes de usar.
2. Seguintes procedimentos regulamentares adequados, sacrificar um rato de laboratório juvenil por asfixia de dióxido de carbono.
   Nota: Como alternativa, animais mais jovens podem ser sacrificados com uma dose letal de cetamina/xilazina (100-200 µ l de 24mg/mL cetamina, xilazina 2,4 mg/mL). Xilazina/cetamina deve ser usada se os animais são menos de 14 dias de idade. Se usar vários animais, extrair o tecido de um animal e colocá-lo em pre-refrigerados DPBS +⁺ no gelo antes de prosseguir para animais subsequentes.
3. Beliscar um hindpaw e assegurar a completa apatia do animal antes de prosseguir.
4. Transcardially perfundir o animal com 10-30 mL de tampão de perfusão gelada usando uma agulha de 27½-G até o tampão funciona claro.
   Nota: O Volume da reserva de perfusão pode variar dependendo da tamanho/idade do animal.
5. Imediatamente após a perfusão remova a cabeça do animal. Vindo da medula espinhal, corte o côndilo occipital de cada lado com uma tesoura de dissecação, tenha cuidado para não danificar o cérebro. Após o corte cada lado corte cuidadosamente, por um lado, ao longo do parietal e osso frontal para o osso nasal. Com pinça puxe o topo do crânio, rapidamente Retire cuidadosamente o cérebro (ou estruturas de CNS de interesse) e coloque no pre-refrigerados DPBS +⁺ no gelo.
6. Repita para todos os restantes animais.
   Nota: Todas as etapas do processo devem ser realizadas em uma capa de fluxo laminar, sob condições estéreis.

3. mecânica dissociação (dia 1)

1. Depois que todos os cérebros foram recolhidos, cortar um cérebro em pedaços de³ de 1 mm em um prato de Petri no gelo com uma lâmina de bisturi frio e transferir para um homogenizador homogenizacao gelada com 5-7 mL de tampão de douncing gelada. Dissocia um cérebro de cada vez.
2. Dissocia o tecido através de movimentos de suaves e incompletos de 10-20 com um homogeneizador de homogenizacao folgadas. Tome cuidado para não esmagar diretamente o tecido na parte inferior do homogenizador, mas em vez disso, impel o tecido através do espaço entre os lados do pistão e do homogenizador.
3. Remova cuidadosamente o pistão para evitar a introdução de bolhas de ar. Permitir que pedaços de tecido mal dissociada a ajustar-se ao fundo o homogenizador e transferir o sobrenadante para um novo tubo cônico refrigerado 50 mL.
4. Substituir o volume removido com buffer de douncing fresco e repita as etapas de 3.2 e 3.3, para um total de 3-4 rodadas, ou até que todo o tecido tem sido dissociado. Repita o procedimento para cada cérebro.

4. a mielina remoção (dia 1)

Nota: Remoção de mielina é usada para a isolação de micróglia de animais mais velhos que P12.

1. Medir o volume da suspensão celular no tubo cónico de 50 mL com uma pipeta de 25 mL e, em seguida, adicione douncing gelada buffer para ajustar o volume total de 33,5 mL.
2. Adicione 10 mL de tampão de separação de mielina (MSB) para a suspensão de células e misture cuidadosamente o tubo várias vezes por inversão. Isso resultará em uma concentração final de 23% de MSB em um volume de 43,5 mL.
3. Centrifugar as células por 15 min a 500 x g a 4 ° C, com frenagem lenta.
   Nota: A centrífuga deve tomar aproximadamente 1.5-2 min para desacelerar. Isso irá gerar uma camada superior de mielina e restos de células mortas, um sobrenadante um pouco turva e uma menor pelota que é enriquecida por células vivas.
4. Remova a camada superior da mielina/detritos e o sobrenadante com uma pipeta. Tome cuidado ao remover a camada superior para garantir como muito do que é removido quanto possível.
5. Ressuspender as células em 12 mL de tampão de garimpar. Delicadamente, Triture a suspensão de eritrócitos para quebrar qualquer aglomerados de células que possam permanecer.

5. Immunopanning (dia 1)

1. Passe a suspensão de células através de um filtro de célula de 70 µm para remover detritos grandes ou aglomerados de células.
2. Enxague o prato panning revestido OX42 três vezes com DPBS +⁺. Não permitir que a placa completamente seco entre lavagens.
3. Deite fora a última lavagem DPBS +⁺ e aplicar a suspensão de células filtrada para o prato de panning. Suavemente agitar a placa para distribuir as células e, em seguida, incubar a placa sobre uma superfície plana em temperatura ambiente por 20 min permitir que as células a aderir. Não incubar mais do que 20 min ou células se tornará muito difícil recuperar do prato.
4. Enxague o prato panning com DPBS +⁺ 10 vezes para remover as células não-aderentes. Microglia será tão firmemente ligado à placa, agite a placa com cada enxágue para assegurar a remoção de outras células não-aderentes.
5. Deite fora a última lavagem DPBS +⁺ e substitua com 15 mL DPBS +⁺ e 200 tripsina μL (1,25% solução estoque).
6. Incube o prato para ≤ 10 min a 37 ° C, com 10% de CO₂ para trypsinize.
   Nota: Não faça mais do que 10 min ou micróglia se tornará difícil de remover.
7. Após 10 min de tripsinização, microglia ainda vai ser preso à placa. Decantar a tripsina/DPBS +⁺ e lave suavemente 2x com DPBS +⁺ para remover a tripsina, substituir com 12 mL de meio de crescimento microglia gelada (MGM).
8. Garimpando o prato no gelo por 2 min para ajudar a enfraquecer a interação célula/substrato e certifique-se o prato é plana para evitar áreas do prato panning sequem.
9. Pipetar vigorosamente com um 10 mL pipeta e pipeta controlador de alta velocidade para recuperar células do prato panning. Desenhe uma grade de 16 x 16 com o fluxo do líquido da pipeta para tentar remover todas as células.
10. Verifique as células sob um microscópio ampliação de 20 X para certificar-se de células têm separada da placa. Marca pontos em cima do prato onde as células ainda estão presos e repetição de pipetagem nessas áreas.
11. Recolha a suspensão de células e alíquota 3-4 mL do sobrenadante por tubo cônico de 15 mL. Rotação por 15 min a 500 x g a 4 ° C, com frenagem lenta.
    Nota: Microglia através de um pequeno volume de giro permite a máxima recuperação das células.
12. Aspire o sobrenadante, deixando 0,5 mL da MGM com o centrifugado.
13. Cada Ressuspender em MGM restante e as células de todos os tubos da piscina.
14. Contar as células com hemocytometer.
15. Células de placa conforme descrito nos passos 6 - 7, dependendo da aplicação.
16. Células de cultura a 37 ° C, com 10% de CO₂.
    Nota: As células podem ser cultura para até 3-4 semanas com mudanças regulares de mídia ou uma semana sem alterações de mídia.

6. lugar revestimento placas de cultura de tecidos/lamelas (dia 1)

1. Placa de 15 µ l de revestimento de colagénio IV directamente no centro de uma placa de cultura de tecido revestido 24-bem aniônicos catiônicos (consulte Tabela de materiais para obter detalhes) e incube por 15 min a 37 ° C, com 10% de CO₂.
2. Depois de contar células com hemocytometer dilua as células para 2.3 x 10⁵/mL, no MGM. Aspire o colagénio IV spot e imediatamente placa 15 µ l de suspensão de células para este ponto; Isto dará 3.5 x 10³ células/spot. Incube durante 5-10 min a 37 ° C, com 10% de CO₂ para permitir que as células aderem, adicionar 500 µ l de CO_{2 -}equilibrado meio de crescimento TGF-β2/IL-34/colesterol contendo (TIC) suavemente para o poço.
3. Se chapeamento em lamelas, primeiro casaco lamelas de vidro estéril com 10 µ g/mL estratagema-D-lisina (PDL) em H₂O por 1h no RT, lavar 3 vezes com H₂O e deixe secar em um capuz sob luz UV. Uma vez que as lamelas são secas, prossiga com chapeamento local sobre as lamelas conforme descrito no passo 6.2.

7. chapeamento para isolamento de RNA/proteína

1. No dia 1, casaco, toda a área de uma 24-bem aniônicos/catiônica revestido com placa de cultura de tecido com revestimento de colágeno IV e incubar por 10 min - 1 h a 37 ° C, com 10% de CO₂, retire e imediatamente placa 3-5 x 10⁴ células/poço em CO₂ incubado Mídia TIC.
2. No dia 2, realizar uma alteração de mídia de 50% para cada um bem no dia após o preparo. Células mortas tendem a cluster no centro do poço, então assumo o mídia.
3. Realizar uma alteração de mídia de 50% a cada 2-3 dias para manter as culturas. Se alterações mídia introduzirem uma variável indesejada para as culturas, as células podem sobreviver por cerca de 1 semana sem qualquer alteração de mídia, em oposição a mais de 3 semanas com uma manutenção regular.

Representative Results

Este protocolo descreve um método de cultura alta pureza ramificada microglia de ratos jovens. Resultados semelhantes podem ser obtidos usando animais imaturos, perinatais e adultos, como discutido abaixo. Desde que os isolamentos de célula frequentemente incluem nuances sutis e muitas oportunidades para as células a morrer, usamos pontos de verificação de controle de qualidade para ajudar a determinar o sucesso em várias etapas. Nós normalmente monitorados suspensões celulares usando um hemocytometer em várias etapas do protocolo de isolamento (figura 1A). Bem sucedidos isolamentos devem produzir 2,5-5 x 10⁵ animal de células/juvenil. Animais da P7 - P15 mostram rendimentos mais perto de 5 x 10⁵ células/animal, Considerando que as células isoladas de animais mais velhos que P30 apresentam rendimentos mais perto de 2,5 x 10⁵ células/animal. Para além da monitorização total celular contagens em todo o protocolo, é importante determinar a saúde geral de células isoladas, que pode ser difícil porque microglia isolado dessa maneira têm uma morfologia arredondada ou bipolar durante os primeiros dias na cultura . Aqui, apresentamos imagens de fase de P25 microglia na cultura durante os primeiros 6 dias após isolamento em TIC e TIC contendo 10% de soro fetal bezerro (FCS) (figura 1B).

Figura 1: avaliação da saúde da célula durante o protocolo de isolamento e de cultura, com mais de 6 dias. (A) ilustrando os pontos de verificação do controle de qualidade nas etapas a seguir designado do procedimento de isolamento de célula de imagens de contraste de fase. Suspensões celulares foram fotografadas pela mistura 9 µ l da suspensão celular com 1 µ l de 0,4% trypan azul antes de carga de um hemocytometer. Outras imagens mostram o prato panning em si, e todas as imagens são mostradas como um campo em ampliação de 20 X. Barra de escala, 200 µm. MGM, microglia meio de crescimento. (B) curso de tempo de alterações morfológicas microglial e proliferação da cultura no soro livre TIC crescimento médio ou TIC mais 10% bezerro fetal soro (FCS), com mais de 6 dias. CD11b-immunopanned células estavam local banhado na chapa revestido de colágeno aniônico/catiônica cultura de tecidos revestidos (consulte Tabela de materiais para obter detalhes), e o mesmo campo foi fotografado por contraste de fase cada 24 h. escala bar, 100 µm. TIC, TGF-β2/IL-34 / Meio de cultura contendo colesterol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Avaliação de rotina da saúde e viabilidade de células isoladas são importantes para o sucesso das experiências e reprodutibilidade. Aqui nós mostramos microglia isolado de um animal de P21 cultivado em MGM, tique ou TIC suplementado com 10% de FCS após 7 dias em vitro (DIV) com um ensaio da viabilidade. Se o isolamento foi bem sucedido, culturas mostram entre 80-90% de viabilidade em TIC após 7 DIV. células cultivadas na presença de soro eventualmente subir para perto de 100% de viabilidade por esta medida, no entanto isto é artificialmente inflado tanto pela rápida proliferação de as células expostas ao soro e rápida fagocitose de células mortas dentro dessas culturas (Figura 2A). Além de sobrevivência robusta, células cultivada de TIC também mostram uma morfologia ramificam em relação ao FCS tratados células (Figura 2B, C).

Figura 2: sobrevivência da microglia no MGM, tique ou TIC + FCS durante sete dias em cultura. (A) células foram isoladas de ratos P21 e cultivadas em meio de crescimento microglia (MGM), meio de crescimento TGF-β2/IL-34/colesterol contendo (TIC), ou TIC + soro fetal bezerro de 10% (FCS). Em cada ponto de tempo, meio de cultura foi suplementado com calceína AM (final de 1,33 µM) e ethidium homodímero (final de 2,5 µM) por 15 min rotular células vivas e células mortas, respectivamente. As células foram contadas em cada campo usando um script automatizado do ImageJ. (B e C) após 7 DIV, sem alterações de mídia, células cultivadas em TIC (B) ou TIC suplementado com 10% de FCS (C) foram corados para rotular as células vivas e mortas, como acima. Imagens representativas foram tiradas usando um 10 X (à esquerda) ou objetivo (à direita) de 40 X. Barra de escala, 40 µm. barras de erro representam o erro padrão da média (SEM). Esta figura foi modificada de Bohlen et al ⁹ e usado com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para demonstrar sucesso isolamento e cultura de micróglia altamente pura, nós isolado microglia de ratos P21 e culta essas células em TIC ou TIC suplementado com 10% de FCS para 8 dias. As células foram então fixo e coradas com marcadores microglial (Iba-1 e CD11b) e marcador de proliferação (Ki67, Figura 3A). Além de coloração para marcadores de célula, seq-RNA em células recém isoladas pode fornece uma ferramenta poderosa e sensível para avaliar o perfil de RNA das células e pode ajudar a informar a pureza inicial das culturas. CD11b immunopanning geralmente resulta em uma porcentagem pequena de CD11b⁺ reporte de neutrófilos/monócitos, além de CD11b⁺ microglia (Figura 3B). Estas células morrerão em TIC, depois de alguns dias, mas podem complicar a análise de pontos de tempo anteriores.

Figura 3: pureza de pilhas cultivadas como avaliado por imuno-histoquímica e segs. do RNA Microglia (A) foram isoladas de ratos P21, banhado em lamelas de vidro revestido de PDL/colágeno e cultivadas em meio de crescimento TGF-β2/IL-34/colesterol contendo (TIC) por 8 dias. As células foram corrigidas com paraformaldeído 4% (PFA) por 10 min à temperatura ambiente e imunológico-corados com Iba-1 (1: 500), CD11b (1:1500) e Ki67 (1: 500). Brevemente, células fixas foram bloqueadas com 0.1% de detergente (veja a tabela de métodos para obter detalhes) e 10% de soro normal burro (NGS) por 1h à temperatura ambiente. As células foram então incubadas com anticorpos primários em detergente 0,1% com 1% NGS durante a noite a 4 ° C. As células foram lavadas três vezes por 5 min em PBS. As células foram então incubadas com anticorpos secundários todos 1: 500 em detergente 0,1% com 1% NGS por 1h à temperatura ambiente. As células foram novamente lavadas três vezes em PBS e montadas com DAPI-contendo o meio de montagem. Ampliação de 40 X foram tiradas imagens representativas. Escala da barra, 50 µm. (B) expressão de transcritos específicos de representativo do tipo de célula por células recém isoladas e cultivadas. Microglia foram isoladas de ratos P21 e lysed diretamente do prato immunopanning para isolamento de RNA e RNA-Seq. marcadores de outros tipos de células grandes CNS (astrócitos, neurônios, oligodendrócitos e células endoteliais) mostram contaminação mínima de CD11b-immunopanned células. Marcadores de neutrófilos são detectados em células isoladas recentemente (preto), mas perdem-se nas culturas isento de soro (cinza). Células cultivadas expressam altos níveis de marcadores comuns do macrófago, mas marcadores definindo a assinatura microglial especializados são rapidamente ativador por células cultivadas. Barras de erro representam o erro padrão da média (SEM). Dados são modificados de Bohlen et al ⁹ e usado com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Coloração para viabilidade e marcadores de célula permite a determinação da sobrevivência e pureza das células, mas fornece informações limitadas sobre a dinâmica da cultura. Aqui nós fornecemos um filme lapso de tempo de P21 rato microglia após 14 DIV em TIC. Depois de duas semanas, livre de soro culturas mostram comportamento dinâmico de vigilância, com extensões de processo rápido e retrações em todo o prato (ver 1 filme). Além disso, anteriormente encontramos que exposição de soro transforma estas descansando Propriedades estado da micróglia, resultando em duração de alterações morfológicas e fagocíticas. Nós ter incluído um filme de micróglia cultivada por 5 dias em TIC e, em seguida, expostos a FCS de 10% (ver filme 2).

Filme 1: culturas de micróglia médio definido mostram morfologia ramificada com processos dinâmicos. Microglia foram isoladas a partir de um P21 rato, local banhado nas chapas revestido de colágeno aniônico/catiônica cultura de tecidos revestidos e cultivadas por 14 dias em TIC. A DIV 14, imagens foram colhidas cada 3 min. O filme joga com 6 frames/s, e o carimbo de hora no canto inferior direito indica a duração da imagem no h:min. filme é reproduzido de Bohlen et al ⁹ e usado com permissão. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)

Movie 2: exposição de soro provoca uma rápida mudança morfológica em culturas microglial médio definido. Microglia foram isoladas a partir de um P21 rato, local banhado nas chapas revestido de colágeno aniônico/catiônica cultura de tecidos revestidos e cultivados por 5 dias em TIC. Na DIV 5, imagens foram coletadas a cada 5 min. linha de base da motilidade/morfologia foi gravada, então às 02:55 (2 h, 55 min), realizou-se uma mudança de mídia de 50% para adicionar FCS para uma concentração final de 10%. As células foram fotografadas por um adicional 7 h. O filme joga com 6 frames/s, e o carimbo de hora no canto inferior direito indica a duração da imagem no h:min. , por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)

Discussion

Porque microglia servem como as células imunes Sentinela do SNC, eles são altamente sensíveis às mudanças ambientais; Portanto, muito cuidado é necessário para minimizar as respostas inflamatórias dentro das células durante seu isolamento e cultura⁸. Isso é feito no presente protocolo através de velocidade e temperatura. Sempre que possível reduz a ativação, para que todas as etapas de centrifugação ocorrem a 4 ° C, mantendo as células no gelo ou a 4 ° C, os animais são pintados com buffer de perfusão gelada, e o protocolo foi racionalizado para minimizar o tempo entre o tecido extração e cultivo das células. Se avaliar os padrões de expressão genética das células recém isoladas, colheita lisados celulares diretamente do prato immunopanning CD11b antes tripsinização para manter as alterações induzidas pelo isolamento no mínimo. Note-se que microglia mesmo cuidadosamente isolada executar uma resposta inflamatória imediatamente após serem colocados em temperaturas quentes, presumivelmente devido ao reconhecimento de sinais de danos associados intrinsecamente associada com o procedimento de isolamento. Se o protocolo foi realizado com êxito, espera-se 2,5-5 x 10⁵ rato de células/juvenil.

O protocolo de isolamento celular fornecido aqui é altamente específico para isolar células CD11b + o CNS perfundidos⁹. Embora essa população de células é composta predominantemente de micróglia, também contém níveis baixos de outras populações mieloides tais como macrófagos perivasculares meníngeos macrófagos, macrófagos de plexo coroide, monócitos e neutrófilos¹⁰. Células mieloides associadas a coroide podem ser eliminadas essencialmente pelo reconhecimento e remoção do plexo coroide antes da dissociação de tecido. Meninges também podem ser removidas em certa medida, mas eliminação completa de todo o tecido meníngeo não é prática dentro dos prazos destinados ao isolamento rápido descrito aqui. Portanto, para limitar a variabilidade devido à remoção incompleta das meninges, não removemos as meninges. Para minimizar o número de monócitos/neutrófilos no material isolado em circulação, também é importante ter uma perfusão limpa, e tipicamente descartar tecido que é mal perfundido. Mesmo com perfusão excelente, apuramento de sangue não é absoluto, como será evidente pela presença de uma quantidade pequena de eritrócitos em pellets de célula durante a purificação. Assim, pequenos níveis de monócitos e neutrófilos co são purificados e contribuam uma assinatura distinta em perfis de transcriptomic de células isoladas recentemente. No entanto, circulam células morrerá rapidamente em media TIC serum-free e não representam contaminantes persistentes, embora eles possam continuar a sobreviver e proliferar no soro contendo culturas.

Outro ponto importante para a realização de uma cultura saudável, viável é cuidar-se durante as etapas de dissociação mecânica. Enquanto douncing mata muitos neurônios, glia e outras células do CNS, microglia sobrevivem esta dissociação relativamente ilesa (embora microglia também pode ser morto por over-douncing). Se feito corretamente, este protocolo resulta na célula rendimentos comparáveis aos obtidos usando dissociação proteolítica, Considerando que potencialmente confundir as variáveis de tecido inflamatório respostas a temperaturas elevadas são evitadas. Realizando consecutivas rodadas incompletas de dissociação mecânica do tecido, células únicas podem ser colhidas da suspensão, minimizando a quantidade de estresse mecânico na cultura geral.

O protocolo de immunopanning descrito aqui é uma maneira confiável e reprodutível para isolar microglia, mas existem outros métodos comparáveis. Nós obtivemos resultados semelhantes utilizando isolamento magnético com classificação depleção da mielina e CD11b seleção magnética-ativado da pilha. Nós temos aqui focados no método immunopanning porque forneceu as culturas de mais alta qualidade até à data, requer equipamentos menos especializados e não exige a introdução de anticorpos conjugados de óxido de ferro para as células imediatamente antes da cultura. Outra abordagem comumente usada para a isolação microglial é citometria de fluxo, que tem uma grande vantagem sobre a abordagem atual em que os protocolos existem para purificação de bona fide microglia de outros CD11b + mieloides contaminantes usando superfície anticorpos contra marcadores de assinatura como TEMEM119⁸. Embora a classificação de fluorescência-ativado da pilha resulta em uma população celular extremamente puro, também impõe tensões adicionais para as células e pode resultar em menor viabilidade de culturas ou rendimentos reduzidos. Em geral, focamos em métodos baseados em anticorpo sobre preparações de centrifugação e agitar-se densidade livre de rótulo para maximizar a reprodutibilidade e a pureza da população celular.

Enquanto este protocolo é otimizado para a cultura do rato juvenil microglia, ele pode ser usado para cultura microglia de várias idades; rendimento total da célula é máximo de ratos de 1 - 2 semanas, após o pico de expansão microglial passou e antes de rearranjos estruturais que interferem com a recuperação das células do tecido mais velho. Microglia também pode ser isolada e cultivada de mouse e tecido humano, substituindo o anticorpo CD11b com um anticorpo monoclonal apropriado específico para mouse ou epitopos humanos. Enquanto ambos rato e microglia humano sobreviveram nestas condições de cultura, eles mostram diferenças morfológicas quando comparado com as pilhas do rato. Pilhas do rato retêm uma morfologia ramificada, mas têm menos elaborar processos, enquanto as células humanas têm uma morfologia ameboide quase uniforme quando isoladas e cultivadas de acordo com este procedimento.

Microglia isolado pode ser revestido de formas diferentes dependendo os ensaios necessários. Para obter melhores resultados (como ilustrado nos ensaios ao vivo/morto e morfológicas filmes mostrados aqui), 3.5 x 10³ células estavam "local" chapeado no centro do poço de uma placa de cultura de tecido revestido 24-bem aniônicos catiônicos, depois uma camada de 10-min de colagénio IV como descrito no protocolo acima. Como alternativa, para experimentos que exigem um grande número de células, tais como isolamento de RNA, 3-5 x 10⁴ células pode ser revestido por alvéolo de uma placa de 24 após 10 min a 1 h de revestimento de colagénio IV. Células chapeado em densidades maiores mostraram viabilidade ligeiramente menor e menos complexa morfologia quando comparado com as células que estavam local Tratado, possivelmente devido ao impacto dos sinais inflamatórios secretados em resposta ao isolamento. Por imuno-histoquímica ou imagem que exigem as lamelas de vidro, células exibem a melhor sobrevivência e morfologia quando lamelas foram primeiras revestido com PDL, em seguida, revestido em colágeno IV, conforme descrito acima. Para ensaios que exigem um grande número de condições, viabilidade celular também é alta em placas de 96 poços ou 384-poço revestido de colágeno. Em todas as condições, as células começam redondos ou bipolar, começam a adquirir processos em torno do dia 3-4 e levar 5-10 dias para expor a morfologia màxima ramificam ilustrada na Figura 1 e 1 filme.

Enquanto este protocolo resulta em uma cultura que exibe comportamento dinâmico vigilância e morfologia semelhante ao repouso microglia na vivo, estas células não reter totalmente a assinatura de expressão de gene especializado da microglia na vivo. Muitas das mudanças gene persistente observadas em culturas de células de refletem alterações normalmente vistas no CNS embrionárias ou inflamed⁹. Como tal, este protocolo representa um passo em frente na compreensão das condições microglia requerem para sobreviver em cultura e alterações de soro-evocado, mas um estudo mais aprofundado é necessário compreender os extrínsecos sinais fornecidos pelo SNC que afinar microglial expressão de gene e propriedades.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat: Sprague-Dawley	Charles River	Cat# 400
mouse anti-rat CD11b monoclonal (clone OX42)	Bio-Rad	Cat# MCA275R	Panning: 1:1,000; Staining: 1:500
Goat polycolonal anti-Iba1	Abcam	Cat# AB5076	Staining: 1:500
Rabbit polyclonal anti-Ki67	Abcam	Cat# AB15580	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-mouse 594	Invitrogen	Cat# 11055	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-goat 488	Invitrogen	Cat# A-21203	Staining: 1:500
Alexa Fluor Donkey anti-Rabbit 647	Invitrogen	Cat# A-31573	Staining: 1:500
Triton-X (detergent in ICC staining)	Thermo Fisher	Cat# 28313
Heparan sulfate	Galen Laboratory Supplies	Cat# GAG-HS01
Heparin	Sigma	Cat# M3149
Peptone from milk solids	Sigma	Cat# P6838
TGF-β2	Peprotech	Cat# 100-35B
Murine IL-34	R&D Systems	Cat# 5195-ML/CF
Ovine wool cholesterol	Avanti Polar Lipids	Cat# 700000P
Collagen IV	Corning	Cat# 354233
Oleic acid	Cayman Chemicals	Cat# 90260
11(Z)Eicosadienoic (Gondoic) Acid	Cayman Chemicals	Cat# 20606
Calcein AM dye	Invitrogen	Cat# C3100MP
Ethidium homodimer-1	Invitrogen	Cat# E1169
DNaseI	Worthington	Cat# DPRFS
Percoll PLUS	GE Healthcare	Cat# 17-5445-02
Trypsin	Sigma	Cat# T9935
DMEM/F12	Gibco	Cat# 21041-02
Penicillin/ Streptomycin	Gibco	Cat# 15140-122
Glutamine	Gibco	Cat# 25030-081
N-acetyl cysteine	Sigma	Cat# A9165
Insulin	Sigma	Cat# 16634
Apo-transferrin	Sigma	Cat# T1147
Sodium selenite	Sigma	Cat# S-5261
DMEM (high glucose)	Gibco	Cat# 11960-044
Dapi Fluoromount-G	Southern Biotech	Cat# 0100-20
Poly-D-Lysine	Sigma	Cat# A-003-E
Primaria Plates	VWR	Cat# 62406-456
Name	Company	Catalog Number	Comments
Stock reagents
Apo-transferrin			Reconstitution: 10 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
N-acetyl cysteine			Reconstitution: 5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Sodium selenite			Reconstitution: 2.5 mg/mL in H2O Concentration used: 1:25,000 Storage: -20°C
Collagen IV			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -80°C
TGF-b2			Reconstitution: 2 mg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
IL-34			Reconstitution: 200 μg/mL in PBS Concentration used: 1:1,000 Storage: -80°C
Ovine wool cholesterol			Reconstitution: 1.5 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparan sulfate			Reconstitution: 1 mg/mL in H2O Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Oleic acid/Gondoic acid			Reconstitution: Gondoic: 0.001 mg/mL; Oleic: 0.1 mg/mL in 100% ethanol Concentration used: 1:1,000 Storage: -20°C
Heparin			Reconstitution: 50 mg/mL in PBS Concentration used: 1:100 Storage: -20°C
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Perfusion Buffer			Recipe: 50 μg/mL heparin in DPBS++ (PBS with Ca++ and Mg+ +) Comments: Use when ice-cold
Douncing Buffer			Recipe: 200 μL of 0.4% DNaseI in 50 mL of DPBS++ Comments: Use when ice-cold
Panning Buffer			Recipe: 2 mg/mL of peptone from milk solids in DPBS++
Microglia Growth Medium (MGM)			Recipe: DMEM/F12 containing 100 units/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 2 mM glutamine, 5 μg/mL N-acetyl cysteine, 5 μg/mL insulin, 100 μg/mL apo-transferrin, and 100 ng/mL sodium selenite Comments: Use ice-cold MGM to pan microglia off of immnopanning dish.
Collagen IV Coating			Recipe: MGM containing 2 μg/mL collagen IV
Myelin Seperation Buffer			Recipe: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS without Ca++ and Mg++, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Comments: Mix well after the addition of  CaCl2 and MgCl2
TGF-b2/IL-34/Cholesterol containing growth media (TIC)			Recipe: MGM containing human 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murine IL-34, 1.5 μg/mL ovine wool cholesterol, 10 μg/mL heparan sulfate, 0.1 μg/ml oleic acid, and 0.001 μg/ml gondoic acid Comments: Make sure to add cholesterol to media warmed to 37 °C and do not add more than 1.5 μg/mL or it will precipitate out. Do not filter cholesterol-containing media. Equilibrate TIC media with 10% CO2 for 30 min- 1 hr before adding to cells to insure optimal pH.