Summary
Desthiobiotin märkning av en syntetisk 25-nukleotid RNA oligo, som innehåller en adenin-rika element (är) motiv, tillåter specifika bindningen av cytosoliska är-bindande protein.
Abstract
I in vitro- RNA-pulldown används fortfarande i stor utsträckning i de första stegen av protokoll som syftar till att identifiera RNA-bindande proteiner som känner igen specifika RNA strukturer och motiv. I detta RNA-pulldown protokoll, kommersiellt syntetiskt RNA sonder är märkta med en modifierad form av biotin, desthiobiotin, på 3' terminus av RNA strandar, som reversibelt binder till streptividin och därmed tillåter eluering av proteiner under mer fysiologiska villkor. Den RNA-desthiobiotin är orörlig genom interaktion med streptividin på magnetiska pärlor, som används för att dra ner proteiner som specifikt interagerar med RNA av intresse. Icke-denaturerat och aktiva proteiner den cytosoliska delen av mesoteliom celler används som källa för proteiner. Den metod som beskrivs här kan användas för att upptäcka samspelet mellan kända RNA-bindande proteiner och en 25-nukleotid (nt) lång RNA sond som innehåller en sekvens av intresse. Detta är användbart att slutföra funktionell karakterisering av stabiliserande eller destabiliserande element i RNA-molekyler som uppnåtts med en reporter vector analys.
Introduction
Genuttryck och den slutliga nivån av produktens genen kan tätt regleras som påverkar mRNA-stabilitet och mRNA översättning hastighet1. Dessa post-transcriptional regleringsmekanismer utövas genom samspelet mellan icke-kodande RNA och/eller RNA-bindande proteiner (RBPs) med riktade mRNA. Det är oftast 3' oöversatta regionen av mRNA (3' UTR - som hör till den icke-kodande delen av genomet2) som innehåller specifika cis-reglerande element (CRE), som erkänns av trans-agerar faktorer såsom miRNA eller RBPs 3. de bäst studerade cis-element inom den 3' UTR, är adenin-rika element (är) motivet, som är erkänd av specifika AU-bindande proteiner (AUBP), och, i sin tur, inducerar antingen mRNA nedbrytning/deadenylation (är-medierad decay) eller mRNA stabilisering4.
Storleken av de 3' UTR av calretinin mRNA (CALB2) är 573 bp lång och innehåller en förmodad AUUUA pentamer, som förutspådde av AREsite2, en bioinformatiska verktyg5. Konsekvent med förekomsten av en förmodad är motiv, pmirGLO vector-reporter analysen visade en stabilisering roll av detta element inom CALB2 mRNA6. Slutligen den in vitro- RNA-pulldown användes för att identifiera de AUBP som stabiliserar calretinin mRNA genom är motivet.
Eftersom alla icke-kodande RNAs interagerar med proteiner7, är av in vitro- RNA-pulldown ett bra sätt och första-av-val analys för att identifiera RNA-interactmedlemmar till stöd i dechiffrera molekylära mekanismer. I denna RNA-pulldown metod användes kommersiellt syntetiskt RNA-sonder, som var märkt med en modifierad form av biotin (desthiobiotin) på 3' terminus av RNA strandar. Den RNA-desthiobiotin är orörlig genom interaktion med streptividin på magnetiska pärlor, som används för att dra ner proteiner som specifikt interagerar med bundna-RNA av intresse. Icke-denaturerat och aktiva proteiner den cytosoliska delen av mesoteliom celler används som källa för proteiner. Sådant RNA-bundna proteiner elueras från de magnetiska pärlor, kör genom en gel med 12% i SDS-PAGE, överförs till ett membran och utforskad med olika antikroppar.
I förfarandet standard streptividin-biotin affinitet rening, hårda denaturering villkor krävs för att störa den starka irreversibel biotin-streptividin obligationen för att eluera den bundna proteiner8, vilket kan leda till dissociationen av proteinkomplex. Till skillnad från biotin, desthiobiotin reversibelt binder till streptividin och förflyttas konkurrenskraftigt med en buffrad lösning av biotin, möjliggör den milda elueringen av proteiner, och undvika isolering av naturligt biotinylerade molekyler9, tyder på att tekniken är idealisk för att isolera infödda proteinkomplex under inhemska förhållanden.
In vitro bindande villkor och stringens, vilka bestäms av salt koncentration, reduktionsmedel och tvättmedel procentandel, bör vara nära de närvarande i cellulära samband för att identifiera sant i vivo interaktioner. De bindande villkor genomförts häri har tidigare påvisats lämpligt för identifiering av HuR som en AU-bindande protein10. Detta synsätt skulle kunna spara tid, eftersom optimering av ordentlig bindande villkor kan vara tidskrävande och utmanande. Dessutom, denna metod skulle kunna användas som ett start protokoll för alla RNA-pulldown experiment och gradvis kan optimeras genom att ändra koncentrationen av salter och rengöringsmedel, ändra procentandelen glycerol och lägga till andra salter. Dessutom har vi visat att även en kort 25-nukleotid RNA-probe härbärgerat en pentamer är-motiv kunde användas att demonstrera interaktion med en specifik AUBP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av cytosoliska och nukleära proteinfraktion
- Plåt 4 x 106 ACC-MESO-4 celler i en T150 cell kultur kolv odlas i RPMI - 1640 medium kompletteras med 10% FBS, 1 x penicillin/streptomycin (100 x) och 2 mM L-glutamin (200 mM). När celler når en sammanflödet av 80-90% (~5-5.5 x 106 celler), Fortsätt med protein utvinning av kärn- och cytosoliska bråkdel.
Obs: ACC-MESO-4 cell fodrar erhölls från RIKEN BioResource centrum11. - Aspirera medium, tvätta cellerna genom att lägga till 15 mL 1 x PBS, luta plattan försiktigt ett par gånger och aspirera 1 x PBS. Tillsätt 3 mL 0,25% Trypsin-EDTA och inkubera kultur kolven vid 37 ° C i 3 min.
Obs: Titta på celler i Mikroskop för avlossning; om fortfarande ansluten tryck kolven mot en handflata 3 gånger. - Lägg till 7 mL RPMI-1640 medium kompletteras med 10% FBS, 1 x penicillin/streptomycin (100 x) och 2 mM L-glutamin (200 mM), samla in cellerna i en 15 mL tub och snurra ner vid 200 x g i 5 min.
- Aspirera medium och resuspendera cellpelleten med 1,5 mL 1 x PBS och sedan överföra cellerna i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör. Snurra ner vid 500 x g och 4 ° C i 5 min. Kassera supernatanten.
Obs: Från detta steg framåt, utföra alla centrifugering steg vid 4 ° C och hålla alla reagens på is. - Återsuspendera cellpelleten med iskall 1,5 mL 1 x PBS och spinn ner cellerna vid 500 x g och 4 ° C för 3 min. avlägsna supernatanten.
Obs: De krävda mängderna av CER jag CER II och NER reagenser är 10, 0,55 och 5 volymer av uppskattade cellpelleten packade volym, respektive; följande protokoll förutsätter en volym av 20 µL. Vi rekommenderar att förbereda endast mängden reagens CER jag. - Tillsätt 200 µL av iskall cytoplasmiska utvinning reagens (CER jag) kompletteras med 2 µL av 1 x proteinas-hämmare, t.ex., späd 1 tablett av proteashämmare (EDTA-fri) i 500 µL av vatten för att få 100 x lager. Denna mängd reagens CER I är nog att lysera 20 µL av en cellpelleten packade volym.
- Att uppskatta volymen cell pellets packas, jämföra röret som innehåller cellpelleten med en 1,5 mL tub fylld med 10, 20, 50 eller 100 µL av 1 x PBS.
- Återsuspendera cellpelleten av kraftigt vortexa röret för 15 s och Inkubera röret på is för 10 min. Tillsätt 11 µL av iskall cytoplasmiska utvinning reagens II (CER II) till röret, kraftigt virvel för 5 s, och inkubera 1 min på is.
- Vortex kraftigt i 5 s och centrifugera röret på 16 000 x g och 4 ° C i 5 min. överför supernatanten till ren före kylda röret på is. Supernatanten är den cytoplasmiska fraktionen som är ytterligare används i RNA-pulldown experimentet.
- Återsuspendera återstående pelleten i 100 µL av iskall nukleära utvinning reagens (NER) kompletteras med 1 µL proteinas hämmare (100 x) och kraftfullt virvel för 15 s. Vi rekommenderar att förbereda endast mängden NER reagens kompletteras med proteashämmare.
- Inkubera provet på is för 40 min med enstaka vortexa för 15 s (varje 10 min).
- Centrifugera röret vid 16 000 x g i 10 min. Transfer supernatanten (detta är den nukleära proteinfraktion) till en ren före kylda röret.
- Genast fortsätta genom att mäta proteinkoncentration med metoden bicinchoninic (BCA) (se Tabell för material). För att styra för protein renhet av respektive fraktion, utföra immunoblotting (figur 1) mot α-tubulin (positiv upptäckt endast i cytosoliskt fraktionen) och Poly ADP-ribos polymeras - PARP (positiv upptäckt endast i kärn-fraktionen). För protein visualisering, se avsnitt 4.
- För att hålla proteinaktiviteten och deras infödda, förbereda 25 µL alikvoter av extrakt cytosoliska och kärnkraft. Snapin-frysa dessa portioner genom att placera dem i flytande kväve för 5 s och förvaras direkt vid-80 ° C.
2. märkning av RNA med Desthiobiotin
- Har RNA sonder kommersiellt syntetiseras och HPLC renat. Blandas med nuclease-fritt vatten vid 10 µM.
Obs: Sonden sekvenser visas i tabell 1. - Använd 50 pmol RNA per RNA-pulldown reaktion. Tina och hålla alla reagens på is utom för PEG 30%, brukade etikett 3' terminus av RNA oligo.
- Överföra 5 µL 10 µM RNA sonder, märkt som CALB2 3' UTR (är), CALB2 3' UTR (mtARE) och icke-närstående-RNA (IRE), i 0.5 mL tunnväggiga mikrocentrifug rör och inkubera i en PCR-maskin vid 85 ° C för 5 min. Placera rören direkt på is.
Obs: Detta steg är viktigt, eftersom det främjar avkoppling och tillgänglighet av RNA sonden för märkning. - För en enda 30 µL reaktion, lägga till RNA-innehållande röret följande 10 µL mixen: 3 µL av nuclease gratis vatten, 3 µL 10 x RNA Ligase reaktion buffert, 1 µL RNase Inhibitor (40 U/µL), 1 µL Desthiobiotinylated cytidin Bisphosphate (1 mM) , och 2 µL av T4 RNA ligase (20 U/µL).
Obs: För att förbereda huvudmixen A 3 prover i överskott (3.2), blanda 9,6 µL av nuclease gratis vatten, 9,6 µL 10 x RNA Ligase reaktion buffert, 3,2 µL av RNase Inhibitor (40 U/µL), 3,2 µL av Desthiobiotinylated cytidin Bisphosphate (1 mM) och 6,4 µL av T4 RNA ligase (20 U/µL). - Tillsätt försiktigt 15 µL av PEG 30% till reaktionen. Använda ett annat tips för att blanda reaktionen. Inkubera reaktionen över natten vid 16 ° C.
- Nästa dag, förbereda följande: 5 M NaCl (färska/nuclease-fri), kloroform: isopentanol i 24:1-förhållande (t.ex., per reaktion - 96 µL kloroform och 4 µL av isopentanol), iskall 100% etanol och iskall 70% etanol.
- Tillsätt 70 µL nuclease-fritt vatten i RNA-märkning reaktionsrören. Tillsätt 100 µL av kloroform: isoamylacetat alkohol och vortex kort. Spin-down på 13 000 x g för 3 min. Ta försiktigt bort endast övre fasen och överföring till en ny nuclease-fri 1,5 mL tub; Undvik att vidröra den lägsta fasen.
- Tillsätt 10 µL av 5 M NaCl, 1 µL av glykogen och 300 µL iskall 100% etanol. Placera röret vid-20 ° C i 2 h.
Obs: I detta steg, experimentet kan fortsätta följande dag. - Centrifugera vid 13 000 x g och 4 ° C under 15 min. noggrant kasta bort vätskefasen utan att störa pelleten. Tillsätt 300 µL av iskall 70% etanol och centrifugera igen vid 13 000 x g och 4 ° C i 5 min.
- Avlägsna supernatanten helt och lufttorka pelleten (15 min). Återsuspendera pelleten i 20 µL av nuclease-gratis vatten.
Obs: Fortsätt med RNA-pulldown samma dag. - Inkubera RNA vid 90 ° C under 2 minuter och placera på isen. Placera den märkta-RNA på isen under följande steg av förtvätt av streptividin magnetiska pärlor.
Obs: En längre inkubationstid kan skada sonden RNA.
3. RNA-Protein Pulldown
-
Förtvätt streptividin-magnetiska pärlor och inkubation med desthiobiotin-RNA
- Använd 50 µL av streptividin magnetiska pärlor per 50 pmol RNA. Detta bör dock optimeras beroende på experimentet.
- Vortex röret med streptividin-magnetiska pärlor för 15 s, och snabbt ta bort 200 µL (master mix; nog för 3 + 1 reaktioner) till en ren 1,5 mL säker-lås tube med skär pipettspetsar. Placera röret på en magnetisk stå så att pärlorna samla vid sidan av röret och vänta 1 min. ta bort resuspension vätskan.
- Att tvätta pärlorna, ta bort röret från magnetiska stativet, tillsätt 400 µL 0,1 M NaOH, 0,05 M NaCl-lösning och försiktigt Pipettera upp och ner flera gånger. Placera röret tillbaka på magnetiska stativet. Vänta 1 min och samla supernatanten. Upprepa detta steg igen.
- Tvätta pärlorna med 200 µL av 100 mM NaCl. Ta bort supernatanten.
- Tillsätt 200 µL 20 mm Tris (pH 7,5), Omsuspendera pärlor av pipettering, placera röret i magnetiska montern, vänta 1 minut och avlägsna supernatanten. Upprepa steg.
- Ta bort röret från magnetiska stativet, tillsätt 200 µL av 1 x RNA insamlingsbufferten och resuspendera streptividin magnetiska pärlor av kort vortexa. Ta bort 50 µL av streptividin magnetiska pärlor och tillsätt till varje märkt-RNA röret med en skära pipettspetsen. Inkubera rören i 30 min i rumstemperatur på en rulle.
-
Bindande protein RNA
- Placera rören i en magnetisk stå, vänta 1 minut och avlägsna supernatanten.
- Tillsätt 50 µL 20 mM Tris (pH 7,5) i pärlor och resuspendera genom pipettering. Placera rören i en magnetisk stå, vänta 1 minut och avlägsna supernatanten. Upprepa detta steg.
- Tillsätt 100 µL av 1 x Protein-RNA bindande buffert till pärlorna och resuspendera genom pipettering.
- Under tiden förbereda följande mixen: 10 µL 10 x Protein-RNA bindande buffert, 30 µL 50% glycerol, 50 µg av cytoplasmatiska proteiner, och nuclease-gratis vatten upp till 100 µL.
Obs: Förbereda master mix B 3 prover i överskott (3.3) enligt följande: 33 µL 10 x Protein-RNA bindande buffert, 99 µL 50% glycerol, 165 µg cytoplasmatiska proteiner och nuclease-fritt vatten upp till 330 µL. hålla röret av master mix B på is. - Placera rören i magnetisk stå, vänta 1 min och samla in supernatanten. Tillsätt 100 µL av master mix B, Omsuspendera genom pipettering försiktigt upp och ner och undvika att skapa bubblor. Inkubera reaktionsrören för 60 minuter vid 4 ° C på en rulle.
-
Tvätt och eluering
- Placera rören i en magnetisk stå, samla in supernatanten (som är flödet genom - FT) och överför till en ny tub.
Obs: Hålla detta FT på is för senare analys. - Pipettera 100 µL av 1 x Tvättbuffert på pärlor, Omsuspendera försiktigt, sätta tillbaka på magnetiska stativet, vänta 1 minut och avlägsna supernatanten. Upprepa detta 2 gånger.
- Tillsätt 40 µL eluering buffert i de magnetiska pärlorna, blanda genom pipettering upp och ner och inkubera vid 37 ° C på en tube skakapparat (950 rpm) i 30 min.
- Placera rören i en magnetisk stå, vänta 1 min och samla eluerade prov (som är eluatet - E). Placera på is och använda för efterföljande analys.
Obs: I detta steg, varje testade RNA-sonden består av en genomströmmande (FT) och eluatet (E) prov.
- Placera rören i en magnetisk stå, samla in supernatanten (som är flödet genom - FT) och överför till en ny tub.
4. polyakrylamid elektrofores och Western Blot analys
Obs: Se tabell 2 för recept för buffertarna i detta avsnitt. Utföra en Western blot enligt den Laemmli metod12.
- Handcast 12% SDS-PAGE geler (10-wells, 1,5 mm spacer, 66 µL). Förbereda en rinnande gel mix: 4 mL 30% akrylamid-bisacrylamide stamlösning, 2,4 mL av lägre Tris buffert, 3,2 mL dH2O, 9,6 µL av TEMED, 96 µL 10% ammonium persulfatoxidation lösning (APS). Förbereda stapling gel mix: 3.25 mL dH2O, 0,5 mL 30% akrylamid - bisacrylamide stamlösning, 1,3 mL övre Tris buffert, 10 µL TEMED, 20 µL av 10% APS.
- Tillsätt 16,6 µL av 6 x Laemmli buffert (t.ex., 14 mL Tris/HCl/SDS pH 6,8 (övre Tris buffert), 2 g av SDS, 1,86 g av DTT, 6 mL glycerol och 0,012% bromofenolblått; lagras vid-20 ° C) i FT provet och 6,6 µL av 6 x Laemmli buffert till E provet. Inkubera prover för 5 min vid 95 ° C.
- Ladda proverna (20 µL av FT och hela eluera ~ 40 µL) och köra dem under 30 minuter vid 60 V, fortsätter med 20 V över natten.
- Halvtorr electroblotting system med överföra proteiner på ett PVDF membran för 80 min 15 V.
Obs: PVDF membranet måste aktiveras innan du utför protein överföring. Inkubera membranet i 100% metanol för 1 min, följt av en 2 minuters inkubation i ultrarent vatten. - Efter protein överföringen, inkubera SDS-PAGE gel med Coomassie lösning för 3 h, följt av tre steg av tvättning med ultrarent vatten, varje 30 min.
- Vid slutet av protein överföring, låt PVDF membranet torka för 1 h. återaktivera membranet som anges i steg 4,5. Blockera membranet 1 h med 5% BSA i 1 x TTBS.
- Inkubera membranet med den första antikroppen: HuR eller mesothelin, båda utspädd 1: 1000 i 5% BSA i 1 x TTBS för 4 h i rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C.
- Tvätta membranet tre gånger för 7 min i 1 x TTBS och inkubera med kanin antimus pepparrotsperoxidas (HRP)-konjugerad sekundär antikropp utspädd 1:10,000 i 5% BSA, 1 x TTBS.
- Visualisera proteiner med hjälp av förbättrad chemiluminescence och en digital imager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta experiment användes ett 25-nt långt fragment av calretinin 3' UTR hysande är motiv (CALB2 3' UTR (är) 25-nt) för att testa om det binder specifikt till proteinet mänskliga-antigen R (HuR), en känd mRNA-stabilisator. För att testa specificiteten av elementet är, en 25-nt-RNA var sonden CALB2 3' UTR (mtARE) som innehåller en mutation som är-motiv, som tidigare visades att avskaffa stabilisering effekten av är motivet, används6. Den tredje RNA probe representerar den negativa kontrollen, vilket är en 28-nt orelaterade RNA som innehåller en väldefinierad järn-responsive element (orelaterade RNA (IRE)), känt att binda cytosoliska järn-lyhörd protein13,14. Eftersom HuR är huvudsakligen lokaliserade i nucleus men funktioner som en mRNA-stabilisator i cytosolen15, utfördes kärn/cytosoliska extraktionen för att få aktiva proteiner från cytosolen.
För att demonstrera renheten av de nukleära/cytosoliska fraktionerna, analyserades proteiner av Western blot, som visade att α-tubulin upptäcktes endast i cytosoliskt fraktionen, medan PARP protein upptäcktes endast i kärn-fraktionen, som förväntade ( Figur 1). Eluatet från CALB2 3' UTR är-probe visat bindande av HuR medan HuR var frånvarande i eluatet från mutant probe CALB 3' UTR (mtARE). HuR var också frånvarande i eluatet från orelaterade RNA sonden som binder järn-lyhörd proteinet (figur 2A). För att ytterligare demonstrera specificitet mellan CALB 3' UTR (är) och HuR, var membranet dessutom utforskad med anti-mesothelin (MSLN) antikropp, som detta protein inte interagerar med RNA. Eluat från alla tre prover visade ingen närvaro av mesothelin. Sammantaget indikerar detta att stabiliserande är motivet inom CALB2 3' UTR specifikt kan binda HuR protein.
Coomassie färgning av gelen (figur 2B) visar att lika mängder proteiner användes att Inkubera med tre olika RNA sonderna. På grund av låg mängd cytosoliska extrakt används och överföring till membranet, tillät denna färgning inte för påvisande av proteiner i eluatet (E) körfält, som upptäcktes annars genom Western blot analys.
Figur 1: Western blot analys av 5 µg cytosoliska och nukleära proteinfraktion. PARP protein är närvarande i nukleära fraktionen (N) men frånvarande från den cytosoliska (C)-fraktionen. Α-tubulin är närvarande i cytosoliskt fraktionen (C) men frånvarande i den nukleära fraktionen (N). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Western blot visar att HuR fångas av 25-nt CALB2 3' UTR (är). (A) FT: flöda genom efter inkubation med RNA sond; E: proteiner elueras vid inkubation och bindning till RNA sonder. Prober: CALB2 3' UTR (mtARE) - 25-nt fragment av calretinin 3' UTR som innehåller 3 muterade nukleotider inom är motivet; UR RNA (IRE) - 28-nt RNA sond med en väldefinierad järn-responsive element som binder järn-lyhörd proteinerna. Membranet var ytterligare probed för mesothelin (MSLN), ett protein som inte samverkar med RNA. B) Coomassie färgning av gelen efter protein överföring, visar att lika mängder proteiner inkuberades med RNA sonder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| RNA sond | Sekvens | Koncentration |
| CALB2 3' UTR (är) 25nt | UCGCUGUAUGAUUUAGGCUUCUAUG | 10 ΜM |
| CALB2 3' UTR (mtARE) 25nt | UCGCUGUAUGGUCUGGGCUUCUAUG | 10 ΜM |
| Orelaterade RNA - IRE 28nt | UCCUGCUUCAACAGUGCUUGGACGGAAC | 10 ΜM |
Tabell 1 : Sekvenser av RNA sonder
| Lägre Tris buffert för att köra gel | |
| 1,5 M | Tris Base |
| 0,40% | SDS lösning |
| addjust pH till 8,8 använder HCL (6 mol/L) | |
| Fyll upp med | dH2O |
| Övre Tris för stapling gel SDS-PAGE | |
| 500 mM | Tris base |
| 0,4% | SDS lösning |
| Justera pH till 6,8 använder HCL (6 mol/L) | |
| Fyll upp med | dH2O |
| 10 x Running buffer | |
| 250 mM | Tris base |
| 1,92 M | Glycin |
| Justera pH till 8,3 använder HCL (6 mol/L) | |
| Fyll upp med | dH2O |
| Filter eller autoklav och förvaras vid 4° C | |
| 1 X Running buffer | |
| 100 mL | 10 x Running buffer |
| 0,05% | SDS lösning |
| Fyll upp till 1 L med | dH2O |
| 10 x överföring buffert | |
| 480 mM | Tris base |
| 390 mM | Glycin |
| 0,38% | SDS lösning |
| Fyll upp med | dH2O |
| Obs: Filtrera 0.22 um och förvaras vid 4 ° C | |
| 1 X överföra buffert (för halvtorra system) | |
| 20 mL | 10 x överföring buffert |
| 40 mL | metanol |
| Fyll upp till 200 mL | dH20 |
| 10 X TBS (Tris-buffrad koksaltlösning) | |
| 250 mM | Tris base |
| 1,36 M | NaCl |
| 27 mM | KCl |
| Justera pH till 7,4 | |
| Fyll upp med | dH2O |
| Filtret | |
| 1 X TTBS (Tris-buffert koksaltlösning med 0.1 Tween-20) | |
| 1 X | 10 X TBS |
| 0,10% | Tween-20 |
| Fyll upp med | dH2O |
| RNA insamlingsbufferten (1 X) | |
| 20 mM | Tris (pH 7,5) |
| 1 M | NaCl |
| 1 mM | EDTA |
| Protein-RNA bindande buffert (10 x) | |
| 200 mM | Tris (pH 7,5) |
| 500 mM | NaCl |
| 20 mM | MgCl2 |
| 1% | Tween-20 |
| Tvätta buffert (1 x) | |
| 20 mM | Tris (pH 7,5) |
| 10 mM | NaCl |
| 0,1% | Tween-20 |
| Eluering buffert | |
| 4 mM | Biotin |
| 20 mM | Tris (pH 7,5) |
| 50 mM | NaCl |
| Coomassie lösning | |
| 0,02% | Coomassie G-250 |
| 5% | Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrat |
| 10% | EtOH |
| 2% | ortofosforsyra |
Tabell 2: Recept
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
3' utr hör till den icke-kodande genom3, och alla icke-kodande RNAs kan interagera med proteiner för att utöva sin funktion7. När däggdjur genomet befanns pervasively transkriberas och produceras en betydande del av långa icke-kodande RNAs16, visat framväxande bevis att dessa lång-kodande RNAs fungera i reglerar genuttryck som de interagerar med kromatin-remodeling komplex17. Denna kunskap fick utnyttja RNA-pulldown analysen. För att starta dechiffrera interactmedlemmar av en specifik RNA, kunde första steget således in vitro- biokemiska analyser såsom RNA-pulldown, eftersom det är enkelt att utföra.
Notera spelar inte bara sekvens motiv utan även det sekundära strukturerar av RNA en avgörande roll i RNA funktionalitet som bildar de domäner som är väsentliga för att interagera med proteiner. Det sekundära strukturerar kan variera i fysiologiska och in vitro- villkor och RNA-pulldown kan leda till identifiering av falsepositives. Till exempel RNA-pulldown identifierats EZH2, en del av polycomb repressiva complex 2 (PRC2), som en datadestination av X inaktiva specifika avskrift (Xist)18, medan en studie som använde RNA antisense rening tillsammans med massa spektrometri (RAP-MS) identifierat andra interactmedlemmar som SHARP (SMRT och HDAC tillhörande repressor protein), SAF-1 (byggnadsställning fastsättning faktor A) och LBR (lamin B receptor)19. Därför, om inga andra funktionella tester stödja samspelet mellan en RNA och ett visst protein, fynd bör ytterligare kompletteras med en kompletterande protein-centrerad strategi, såsom immunoprecipitating viss proteinet, följt av utvinning och karakterisering av bundna RNA.
Den häri protokoll som presenteras har använts för att upptäcka HuR bindning till är motivet i CALB2 3' UTR, som tidigare hade varit funktionellt kännetecknas av pmiRGLO-luciferas assay6. På grund av den lilla mängden proteiner är detta protokoll inte lämplig för efterföljande analys såsom masspektrometri där större protein mängder behövs. Protokollet kan istället användas för att verifiera de RNA-interactmedlemmar identifieras av masspektrometri, men med en betydligt lägre mängd proteiner.
Eftersom metoden omfattar arbeta med RNA, som är känsliga för nedbrytning, rekommenderar vi rengöring arbetande ytorna med en RNase-sanera lösning utöver standard god laboratoriesed. Om möjligt, utför beredning av RNA märkning och rening under laminärt flöde. Renheten av den RNA oligo kan också påverka de bindande villkor; Således var kommersiellt syntetiskt sonderna HPLC renas. Om modifierade, längre och extremt ren RNA oligos krävs, Använd sidan reningsmetod. Förbereda alikvoter av infödda proteiner genom snapin frysning, därför undvika att skada av proteiner på grund av den långsam frysning strategi och upprepad frysning och upptining.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av schweiziska National Science Foundation Sinergia bidraget CRSII3 147697, Stiftung für Angewandte Krebsforschung och Zürich Krebsliga.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NE-PER Nuclear and cytoplasmic extraction kit | Thermo Fisher Scientific | 78833 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets, EDTA-free | Thermo Fisher Scientific | A32965 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit | Thermo Fisher Scientific | 20164 | Includes magnetic beads and therefore the kit need to be stored at 4 °C |
| Pierce RNA 3’ End Desthiobiotinylation Kit | Thermo Fisher Scientific | 20163 | The kit is a part of the "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit", and needs to be stored at -20 °C unlike the pull-down kit (4 °C). |
| DynaMag-2, magnetic stand | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Anti - HuR (MOUSE) monoclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | - | The antibody is included in the Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit - 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti - α - tubulin (MOUSE) monoclonal antibody | Santa Cruz | 8035 | 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - rabbit anti-mouse secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti - PARP (RABBIT) Polyclonal antibody | Cell Signaling | 9542 | 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - goat anti-rabbit secondary antibody 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS |
| Anti - Mesothelin (MOUSE) Monoclonal Antibody | Rockland | 200-301-A87 | |
| Secondary goat anti-rabbit antibody | Cell Signaling | 7074 | |
| Secondary rabbit anti-mouse antibody | Sigma-Aldrich | A-9044 | |
| RPMI - 1640 medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| FBS - Filtrated Bovine Serum | Pan Biotech | P40-37500 | |
| Penicillin - streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| L-Glutamine solution (200 mM) | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Gibco by Life technologies | 25200-056 | |
| Mini-PROTEAN 3 Cell | Bio-Rad | 1653301 | |
| Mini Protean System Glass Plates | Bio-Rad | 1653308 | |
| Mini-PROTEAN Spacer Plates with 1.5 mm integrated spacer | Bio-Rad | 1653312 | |
| Mini-PROTEAN Comb, 10-well, 1.5 mm, 66 µL | Bio-Rad | 1653365 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules | Bio-Rad | 1658050 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Rotiphorese gel 30 - aqueous 30% acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ration of 37.5:1 | Roth | 3029 | |
| 20% SDS | PanReac AppliChem | A3942 | |
| PVDF transfer membrane | Perkin Elmer | NEF1002 | Need to be activated by incubating in pure methanol for 1 min followed by washing in water for 2 min |
| Trans-Blot SD semi-dry transfer cell | Bio-Rad | 1703940 | |
| Clarity Western ECL Substrate | Bio-Rad | 1705061 | |
| FusionFX Digital Imager | Vilber | - | |
| RNA oligo synthesis | Mycrosynth AG, Switzerland | - | the synthesis scale - 0.04 µmol - HPLC purified |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Hydrochloric Acid (HCl) 6 M | PanReac AppliChem | 182883.1211 | |
| Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5 | Thermo Fisher Scientific | 15567027 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 17904 | 50% sterile aliquots to be stored at -20°C |
| Pierce Streptavidin magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 88817 | Please note that these magnetic beads have an average diameter of 1 µm (range from 0.5 - 1.5 µm). Furthermore, Dynabeads-M280 Streptavidin, which are beads of homogenouse size 2.8 µm, are also used in RNA-pulldown but be aware that this may affect purification process. |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Coomassie G-250 | Applichem | A3480 | |
| Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrate | Sigma-Aldrich | 368458 | |
| ortho-phosphoric acid | Applichem | A0637 |
References
- Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Letters. 582 (14), 1977-1986 (2008).
- Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs. Trends in Cell Biology. 26 (3), 227-237 (2016).
- Matoulkova, E., Michalova, E., Vojtesek, B., Hrstka, R. The role of the 3' untranslated region in post-transcriptional regulation of protein expression in mammalian cells. RNA Biology. 9 (5), 563-576 (2012).
- von Roretz, C., Di Marco, S., Mazroui, R., Gallouzi, I. E. Turnover of AU-rich-containing mRNAs during stress: a matter of survival. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 2 (3), 336-347 (2011).
- Fallmann, J., Sedlyarov, V., Tanzer, A., Kovarik, P., Hofacker, I. L. AREsite2: An enhanced database for the comprehensive investigation of AU/GU/U-rich elements. Nucleic Acids Research. 44, D90-D95 (2016).
- Kresoja-Rakic, J., et al. Posttranscriptional regulation controls calretinin expression in malignant pleural mesothelioma. Frontiers in Genetics. 8 (70), (2017).
- Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (1), 29-35 (2015).
- Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology. Clinical Chemistry. 37 (5), 625-636 (1991).
- Hirsch, J. D., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: Uses for protein labeling, detection, and isolation. Analytical Biochemistry. 308 (2), 343-357 (2002).
- Thermo Scientific. Magnetic bead technology for better assay development. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/1602577-Magnetic-Bead-Technology-Brochure.pdf (2013).
- Usami, N., et al. Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients. Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Coulson, R. M., Cleveland, D. W. Ferritin synthesis is controlled by iron-dependent translational derepression and by changes in synthesis/transport of nuclear ferritin RNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (16), 7613-7617 (1993).
- Leibold, E. A., Munro, H. N. Cytoplasmic protein binds in vitro to a highly conserved sequence in the 5' untranslated region of ferritin heavy- and light-subunit mRNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (7), 2171-2175 (1988).
- Srikantan, S., Gorospe, M. HuR function in disease. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 17, 189-205 (2012).
- Morris, K. V., Mattick, J. S.
- Rinn, J. L., et al. Functional demarcation of active and silent chromatin domains in human HOX loci by noncoding RNAs. Cell. 129 (7), 1311-1323 (2007).
- Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome. Science. 322 (5902), 750-756 (2008).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
