Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Trædemølle: Interval Træning protokol for forsigtigt induceret øvelse i Drosophila melanogaster

Published: June 8, 2018 doi: 10.3791/57788
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Alabama

Summary

Trædemølle bruger roterende bevægelse forsigtigt fremkalde øvelse i voksen Drosophila melanogaster ved at udnytte fluer medfødte, negative geotaxis. Det giver mulighed for analyse af samspillet mellem motion og faktorer, såsom genotype, sex, og kost og deres indvirkning på fysiologiske og molekylære analyser at vurdere metabolisk sundhed.

Abstract

Forekomsten af komplekse metaboliske sygdomme er steget som følge af en udbredt overgang til livsstil øget kalorieindtag og nedsat aktivitetsniveau. Disse multifaktoriel sygdomme skyldes en kombination af genetiske, miljømæssige og adfærdsmæssige faktorer. En sådan kompleks sygdom er metabolisk syndrom (MetS), som er en klynge af metaboliske sygdomme, herunder hypertension, hyperglykæmi og abdominal fedme. Motion og kosten indgreb er de primære behandlinger anbefales af læger til at mindske fedme og dens efterfølgende metaboliske sygdomme. Motion indgreb, navnlig aerob intervaltræning, stimulerer gunstige ændringer i den fælles risikofaktorer for Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM), hjerte-kar-sygdom (CVD) og andre betingelser. Med tilstrømningen af beviser har der beskriver den terapeutiske effekt motion på metabolisk sundhed, om oprettelse af et system, der modeller øvelse i kontrollerede omgivelser giver et værdifuldt redskab til at vurdere virkningerne af motion i en eksperimentel sammenhæng. Drosophila melanogaster er et fantastisk værktøj for at undersøge de fysiologiske og molekylære ændringer, der skyldes motion intervention. Fluerne har kort levetid og lignende mekanismer af metaboliske næringsstoffer i forhold til mennesker. For at fremkalde øvelse i Drosophila, udviklede vi en maskine kaldet trædemølle, der udnytter den flue medfødte, negativ geotaxis tendens til at forsigtigt fremkalde klatring. Dette gør det muligt for forskere at udføre eksperimenter på store kohorter af genetisk forskellige fluer til bedre at forstå genotype-af-miljø interaktioner underliggende effekter af motion på metabolisk sundhed.

Introduction

Barndom og voksen fedme voksende epidemier i kulturer, der forbruge højt kalorie kost og forbliver inaktiv i længere perioder, hvilket kan føre til alvorlige langsigtede konsekvenser, herunder insulinresistens, kronisk betændelse og slidgigt 1 , 2 , 3 , 4. forekomsten af disse lidelser fortsætter med at stige på grund af den voksende ubalance i kalorieindtag og udgifter tilskrives forhøjede forbrug af fedt og sukker og en primært stillesiddende livsstil5. Tilsvarende, denne energiubalance har ført til en stigning i tilfælde af Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM) og hjerte-kar-sygdom (CVD)5. Enkeltpersoner er på et højere risiko for at udvikle begge lidelser, hvis de er blevet diagnosticeret med denne lidelse metabolisk syndrom (MetS), hvis symptomer omfatter abdominal fedme og dyslipidæmi2. MetS er formet af det komplekse samspil mellem genotype og forskellige miljømæssige faktorer, såsom kost og motion6. Derfor, for at få en fuld forståelse af de underliggende mekanismer for denne komplicerede sygdom, alle disse faktorer bør betragtes.

Når det kommer til bekæmpelse af MetS, anbefaler læger først gennemgår livsstilsændringer, der omfatter spiser en sund, velafbalanceret kost og fysisk aktivitet2,7,8. Da effektiv medicin er begrænset og gastrisk bypass-operation er dyre og kræver livslang medicinsk overvågning, anbefales farmakologiske og kirurgiske indgreb kun for alvorlige tilfælde og kun i kombination med disse ændringer i livsstil3 ,7,8. Mens livsstil interventioner, såsom motion og slankekure, kan producere og vedligeholde langsigtet vægttab mål, har brug for hvorvidt disse korrigerende foranstaltninger fuldt kan forbedre de negative virkninger forbundet med MetS yderligere undersøgelse7, 8.

Musemodeller har været brugt til at undersøge virkningerne af motion på metaboliske sygdomme i år; Men indførelsen af øvelse at flyve forskning på MetS er en forholdsvis ny bestræbelse9,10,11,12. Fluer giver den perfekte bil for at studere øvelse i kontrolleret laboratorium omgivelser, da de er lette at manipulere, har en kort levetid, er billig at vedligeholde, og energi-relaterede stofskifteveje er meget bevaret mellem Drosophila og mennesker13. D. melanogaster genomer er godt præget, og der findes et væld af genetik værktøjer til brug i Drosophila , der kan give indsigt i forskellige genotyper og genotype af miljø interaktioner, der kunne graduere den effekt af motion på kropsligt sundhed14.

Nuværende metoder for at udøve Drosophila påberåbe sig den flue medfødte, negativ geotaxis tendens, adfærdsmæssige instinkt til at kravle opad, at stimulere klatring i voksne inden for deres kabinetter11,12,15 . Power Tower, en metode til at stimulere øvelse i fluer, rejser systematisk flyve indhegninger lodret og derefter falder dem tilbage til bænken overflade, effektivt banke fluer til bunden af hætteglasset, således inducerende deres instinktive negative geotaxis 12 , 16. eksperimenter udført ved hjælp af denne maskine viste, at motion er en stærk beskyttende faktor mod mange alders-relaterede sygdomme, herunder CVD og T2DM, og fremmer sund aldring12,17,18 . Specifikt, viste de, at motion kan reducere udbrud af aldersrelaterede mobilitet tilbagegang i fluer og forbedre flere alders-relaterede symptomer, såsom hjerte ydeevne og stress respons17,18. Kontrol flyver dog aldrig placeret på tårnet viste højere klatring score end dem, der oplever den maskine, tyder på kraften af de gentagne dråber kan dræbes fluer og påvirker mobiliteten12. Dette tyder på, at en alternativ metode til inducerende øvelse, der er mindre kraftige og undgår forårsager fysiske traumer ville være en nyttig, supplerende metode til Power Tower protokol16.

For at forsigtigt fremkalde øvelse i Drosophila, udviklede vi en øvelse maskine kaldet trædemølle (figur 1). Trædemølle (herefter forkortet TW) roterende bevægelse udløser fluer medfødte, negativ geotaxis tendens af konstant omdefinere gravitationel toppen af hætteglas, som igen stimulerer klatring i fluer. I modsætning til andre metoder er den roterende bevægelse af TW i sagens natur blid, som minimerer antallet af supplerende stressfaktorer, der kan opstå og påvirke resultaterne. Således giver maskinen mulighed for at fremkalde øvelse i stort antal fluer uden inducerende stress, som vil sætte forskerne i at studere virkningerne af motion på metabolisk sundhed (figur 2), aldring, søvn og mange andre emner11.

Vores metode følger en invers pyramideformet, interval training protokol, som i vid udstrækning omfatter aspekter af aerobe intervaltræning (AIT) med nogle udholdenhed øvelse uddannelse. Den standard AIT regime er ændret i denne protokol til gradvist at øge varigheden af hvert interval over en fem-dages periode at fremme udholdenhed. AIT har været særligt nyttigt til at forhindre MetS i forhold til andre metoder, intervention og var mere effektiv til at vende metaboliske syndrom fælles risikofaktorer end løbende moderat motion19,20. En ulempe ved TW i forhold til Power Tower er imidlertid at fluer hurtigere habituate til den roterende bevægelse, således variation i medfødt tendens til habituate blandt fluer kan komplicere fortolkningen af fordelene ved motion. 11 en elegant løsning til denne begrænsning er beskrevet af Watanabe og gåde15 og deres supplerende artikel21.

Protocol

1. trædemølle opsætning og drift

Bemærk: Se supplerende figur 1 for skemaer på TW udøve maskinkonstruktion. De dele, der kræves er angivet i Tabel af materialer. Sætninger "TW", "Trædemølle", "øvelse maskine" og "maskine" i flæng overalt i protokollen.

  1. Kalibrere motor ved hjælp af afbryderen, således at en fuld roterende periode er 15 s (4 rpm). Kalibrere maskinen rotationshastighed før markedsføring flyve hætteglas til sikrede klemmer knyttet til roterende arme.
    1. Justere hastighed ved hjælp af en standard stopur og genstandsled immobile midlertidigt knyttet til maskinen, som en lille pensel tapede til den motor dække med penslen bare røre ved en af de roterende parenteser. Tid at antallet af sædskifter i et minut med den immobile objekt som et referencepunkt og justere hastigheden for at opnå en 15 s roterende periode (4 rpm).

2. Flyv samling og vedligeholdelse

Bemærk: Alle fluer er fastholdt i en 25 ° C kuvøse med 50% fugtighed og en 12-timers lys/mørke cyklus mellem benchtop manipulationer beskrevet nedenfor. Fluer er fodret en standard cornmeal-melasse lab kost, medmindre andet er angivet.

  1. Forberede hver genotype af interesse ved hjælp af æblesaft agar plader æglæggende chambers, en dråbe af gær pasta pr. plade og 6 ounce plastflasker at indsamle æg, der vil klække til larver.
    1. At forberede æblesaft agar plader, udfylde 35 mm x 10 mm petriskåle ¾-fuld med 3% agar opløses i store-købte apple juice. Gemme størknede plader i køleskab indtil brug.
    2. I et 50 mL konisk centrifugeglas, kombinere store-købte tørgær med destilleret vand ved en ratio på 2 mL vand for hver gram gær. Bland gæren med vand for at skabe en pasta med konsekvensen af ketchup ved hjælp af et glas omrøring stang. Justere gær og vand proportioner, som kræves for at opnå den ønskede konsistens.
    3. Gemme gær pasta i køleskab mellem anvendelser. Holde rør cap løs for at tillade de gasningen.
    4. Brug en skarp nål eller kniv til punch små huller i 6 oz. square-bunden flasker (polypropylen) som ventilationshuller for de æglæggende kamre.
    5. DUP en lille plet af gær pasta (~ 3 mm i diameter) på hver æblesaft agar plade.
  2. Placer voksne fluer med den ønskede genotypen til 6 ounce flaske og cap flaske med æblesaft agar plade. Fastgør pladen til flaske med elastikker. Inverter, og placere i en inkubator til at give mulighed for voksne til at lægge æg.
  3. Ændre æblesaft agar plader på et æglæggende kammer to gange om dagen (morgen og aften). Efterlad brugte plader i inkubator for en anden 12-24 h at tillade først instar larver klækkes.
  4. Indsamler første instar larver ved hjælp af en tynd pensel eller samling pick (fleksibel tynd nål knyttet til et håndtag). Sted 50 instar først larver af en bestemt genotype på en mad hætteglas af ønskede eksperimenterende mad type til at udvikle og komplet forvandling mens opstaldet i inkubator (fig. 2A).
  5. Indsamle voksne for motion behandling (fig. 2A).
    1. Ved pupation, indsamle pupper med en lille, fugtig pensel og sted i tomme hætteglas før eclosion at forhindre voksne fluer fra at blive udsat for de larver kost.
    2. Overføre voksne fluer til mad hætteglas med standard lab kost som de velsmagende. En til fem dage efter eclosion, adskille fluer på grundlag af køn.
  6. Indstillede halvdel af de indsamlede voksne hver til den eksperimentelle og kontrolgrupper. Vedligeholde fluer i hætteglas med standard lab kost i en koncentration på 50 fluer per vial.
  7. Overføre voksne til friske fødevarer hætteglas hver to dage for at forhindre dem i at sidde fast under træningen. Tilføje flere kerner af supplerende levende gær til den nye mad umiddelbart før at indføre fluer.
    Bemærk: Selv om det er muligt at opretholde fluer uden en levende gær supplement, har vi fundet at de voksne fluer udfører bedste med tilskud. Levende gær kosttilskud er en variabel, der kan ændres så de passer til forskerens eksperimentelle mål.

3. øvelse protokol

  1. På den første dag i opgave (dag 1) stik skub hætteglas til at forlade 1 cm plads i kontrol hætteglas og 6 cm afstand mellem mad og stikket i øvelse hætteglas (figur 1 c).
    Bemærk: Kontrol hætteglas vil har begrænset plads til fluer til at flytte på øvelse maskine og dermed fluer vil engagere i meget mindre bevægelse end i øvelse hætteglas.
  2. Placer hætteglas i klemmerne, og derefter give fluerne 10 min til at acclimate på maskinen (figur 1B).
    NOTE: En alternativ kontrolordning er at opretholde de uudnyttede fluer på benchtop støder op til den øvelse maskine med 6 cm plads (i hætteglas) for at flytte normalt. Lignende resultater af motion i forhold til både "1 cm på trædemølle" og "6 cm på benchtop" kontrol har fundet11.
  3. Behandle begge kontrol og motion flyver til rotation på maskinen ved konstant rumtemperatur i 5 sammenhængende dage pr. uge med skiftevis anfald af rotation og resten (fig. 1D).
    Bemærk: En konstant temperatur er nødvendig for at undgå de forstyrrende effekter af temperatur på aktivitetsniveau. Temperatur manipulation undersøgelser, placere TW inde i en inkubator for at ændre temperaturen behandlinger under motion uddannelse.
    1. Kør maskinen for fire 15 min anfald af motion i dag 1. Suppleant disse anfald med 5 min hviletid.
    2. Hver af de følgende dage, tilføje 5 min af motion til en af de allerede eksisterende motion anfald. For eksempel på dag 2, gøre den første udøve bout 20 min lange, men opretholde resten af anfald på 15 min lange.
    3. På dag 3 flyver øvelse i 20 min. under de to første anfald og 15 min til de følgende to anfald.
    4. På dag 4, brug 20 min motion anfald for alle undtagen den sidste kamp, bør der kun 15 min lange.
    5. På dag 5, holde alle motion anfald 20 min lange.
      Bemærk: Under hvileperioder, bør hætteglas indeholdende fluer er sikkert fastspændt på TW. Orientering af hætteglassene i disse perioder er ikke relevant, fordi den gravitationelle kraft opleves af alle fluer vil komme fra den samme retning.
  4. Efter endt øvelse behandling for en given dag, returnere mad hætteglas stik til deres normale positioner og returnere fluer til deres væksthuse indtil næste dag.
  5. Efter afslutningen af den fulde øvelse regime, bedøver fluer ved hjælp af standard flyve CO2 anæstesi metoder. Derefter overføre fluer til nye fødevarer hætteglas eller microcentrifuge rør til vurdering af fænotypiske egenskaber af interesse.
    Bemærk: Eksempel fænotyper omfatter klatring evne (mad vial), triglycerid opbevaring (microcentrifuge rør) eller genekspression (microcentrifuge rør). Protokollen kan være midlertidigt her med prøver opbevares korrekt afhængigt af vurderingerne, der skal udføres. Assays involverer levende fluer skal udføres straks i overensstemmelse med de specifikke mål for fænotypisk analysen.

4. klatring vurdering

  1. Efter en dag med resten efter afslutningen af øvelsen protokol, teste generelle fly klatring ydeevne ved hjælp af en hurtig iterativ negative geotaxis (RING)-som negative geotaxis klatring assay22.
    1. Placer grupper af 10 fluer i tomme hætteglas ved hjælp af CO2 anæstesi (eller trykke direkte fra mad hætteglas, hvis allerede sorteret) og forsegle med paraffin film at forhindre fluerne fra at flygte. Give fluer mindst 10 min. til at acclimate til den nye hætteglas. For at forhindre hætteglas vælter, tape en ~ 5 cm diameter karton cirkel til bunden af hætteglasset at give ekstra areal.
      Bemærk: Hætteglas stik bør ikke anvendes, fordi de hindrer del af hætteglasset anvendes til at bestemme højden klatrede.
    2. Placer hætteglas 20 cm foran en 1 cm x 1 cm gitter i fuld visning af en monteret, stationære kamera med en indbygget timer (en smart telefon med en timer kamera ansøgning fungerer godt).
    3. Tryk på hætteglas forsigtigt på tæller tre gange for at banke alle fluer ned til bunden af hætteglasset. Efter trykke hætteglas ned tredje gang, begynde straks 4 s kamera timeren for at fange et billede for at bestemme højden besteget af hvert fly.
      Bemærk: Aflytning bør ske på en konsekvent intensitet og af den samme forsker i hver øvelse-kontrol kontrast til at minimere variationen i fluer svar på grund af aflytning.
    4. Gentag trin 4.1.3 to gange, med mindst 1 min. hvile mellem forsøg, til at producere en i alt tre forsøg pr. hætteglas.
  2. For at bevare fluer til andre analyser, umiddelbart efter klatring analysen er afsluttet, flash fryse fluer ved nedsænkning i flydende kvælstof.
    1. Brug et lavvandet, åben-toppede dewar kolbe fyldt til en dybde af ~ 5 cm med flydende kvælstof.
    2. Overføre fluer til små microcentrifuge rør ved hjælp af CO2 anæstesi og derefter placere rør i dewar kolbe fyldt med flydende kvælstof. Alternativt, hvis fremtidige analyser kræver undgåelse af CO2, snap fryse flyver direkte i deres klatring hætteglas ved forsigtigt at trykke fluer til bunden af deres hætteglas, mens bunden er neddykket i flydende kvælstof, og derefter overføre de frosne flyver til microcentrifuge rør med pincet.
      Bemærk: Flydende nitrogen er kryogene og bør kun anvendes med ordentlig beskyttende udstyr og rum ventilation.
  3. Proces billeder med ImageJ23 multi-point markeringsværktøj.
    1. Åbne et billede for forarbejdning inden for ImageJ.
    2. Sæt en 1 cm skala baseret på grid baggrundspapir til at beregne afstanden besteget af hver enkelte fly. Bruge "Linje-værktøj" fra værktøjslinjen til at spore den ene side af en 1 cm2 pladsen fra gitter baggrundspapir. Klik på fanen "Analyze" og vælg "Sæt skala". Sæt "Kendt afstand" som "1,00" og "Enhed af længde" som "cm", Sørg for "Globale" er markeret, og klik på "OK".
    3. Vælg "Valg af multi-punkt"-ikonet fra værktøjslinjen og zoome ind på bunden af hætteglasset i billedet. Angiv det første punkt som selve bunden af hætteglasset ved at klikke på den laveste del af hætteglasset.
    4. Klik på midten af hver flue i hætteglas til at markere det som et datapunkt. Holde kommentar at der er i alt 11 point pr. hætteglas, der markerer bunden af hætteglasset og én for hver flue.
    5. Klik på fanen "Analyze" og vælg "Foranstaltning" til at generere en tabel over målte værdier. Gem tabellen i som en CSV-fil.
    6. Åbn CSV-filen i et regnearksprogram og beregne den nøjagtige afstand besteget af hver flue ved at fratrække y-værdierne af point 2-11 fra punkt 1 i tabellen målte værdier.
    7. Gentag trin 4.3.1 gennem 4.3.6 for hvert billede.

5. triglycerid opbevaring Assay

Bemærk: Prøver, standarder, glycerol standardopløsning og triglycerol brugsopløsning bruges i hele analysen skal holdes på is for varigheden af protokollen og bør opbevares i køleskabet når den ikke er i brug.

  1. Udarbejde standarder ved hjælp af Glycerol standardopløsning.
    1. Gør Blank (B) ved at tilføje 1.000 µL af homogenisering buffer til et microcentrifuge rør mærket B.
    2. Gøre Standard 1 (S1), 2,5 mg/mL pr. brønd, ved at tilføje 1.000 µL af standardopløsningen glycerol til et microcentrifuge rør mærket S1.
    3. Gøre Standard 2 (S2), 1,25 mg/mL pr. brønd, ved at tilføje 500 µL af standardopløsningen glycerol til 500 µL af diH2O i et microcentrifuge rør mærket S2.
    4. Gøre Standard 3 (S3), 0,625 mg/mL pr. brønd, ved at tilføje 250 µL af standardopløsningen glycerol til 750 µL af diH2O i et microcentrifuge rør mærket S3.
    5. Gøre Standard 4 (S4), 0.3125 mg/mL pr. brønd, ved at tilføje 125 µL af standardopløsningen glycerol til 875 µL af diH20 i et microcentrifuge rør mærket S4.
  2. Forberede triglycerol brugsopløsning fra Serum triglycerid bestemmelse Kit.
    1. Tilsættes 40 mL diH2O til gratis glycerol reagens fra kit og blandes ved at vende flasken.
    2. Der tilsættes 10 mL af diH2O til triglycerid-løsning fra kit og blandes ved at vende flasken.
    3. Kombinere glycerol reagens og triglycerid løsning og blandes ved at vende for at forberede triglycerol brugsopløsning.
      Bemærk: Brugsopløsning triglycerol er godt for 60 dage og kan fuldføre fire 96-brønd plade assays pr. pakke ved hjælp af protokollen nedenfor. De mængder, der anvendes er proportionalt skaleret ned fra den officielle Serum triglycerid bestemmelse kit til brug i formatet 96-brønd plade.
  3. Kontrollere Blank og normer omhyggeligt når der afpipetteres 5 µL af hver standard i en 96-godt flad bund, klar mikrotiterplade i tre eksemplarer (eller fire eksemplarer for tomt).
    1. Tilføje præcis 125 µL af Triglycerol arbejder løsning til hver godt indeholder en standard. Give løsninger til at reagere i 30 min.
    2. Placer en 96-brønd pladen i et spektrofotometer og læse absorbans ved 540 nm. Bruge absorbans mål til at skabe en standardkurve og kontrollere nøjagtigheden af standarder ved at evaluere værdien R2 . Hvis R2 for standarderne, der er mindre end 0,98, re forberede standarderne mere omhyggeligt.
  4. Begynde dagen 1 af analysen for triglycerid opbevaring14 ved hjælp af microcentrifuge rør indeholdende 10 frosne flyver hver.
    Bemærk: En gentagelse eller multi-kanal pipette bør aldrig bruges i dette trin for mængder af hver reagens, der anvendes i analysen skal være meget nøjagtig og konsekvent at få reproducerbare resultater. Vores erfaring har Gentag og multi-kanal pipetter ikke denne grad af nøjagtighed og konsistens. Hver delprøve fra en enkelt kanal pipette visuelt kan bekræftes ved eksperimentatoren for kvalitetskontrol og en enkelt kanal pipette-specifikke afvigelser vil opleves af alle prøver i samme grad.
    1. Forberede en 200 mL bestand af homogenisering Buffer ved at kombinere 0.272 g KH2PO4, 400 µL af 0,5 M EDTA og 199.6 mL diH2O i en glasflaske.
    2. Tilføje præcis 100 µL af homogenisering buffer til hver af de 40 microcentrifuge-rør indeholdende 10 voksne frosne efter klatring analysen. Derefter centrifugeres prøver til 30 s på 18.000 g.
    3. Grind flyver, ved hjælp af en motoriseret kværn og pistil (eller en anden form for væv homogenisering) for at forberede en mælkeagtig løsning. Sørg for en frisk pistil bruges til hver prøve. Derefter centrifugeres prøver for 2 min på 18.000 g.
    4. Der afpipetteres kun top 75 µL af supernatanten væske fra hver tube i nye microcentrifuge rør. Sikre, at ingen flyve bits fra bundfaldet overføres. Lægge nye rør i køleskabet natten over.
  5. Begynde dagen 2 af triglycerid-protokollen ved at fjerne dag 1 prøver fra køleskabet.
    Bemærk: Trin 5.5 kan udføres samme dag som 5.4, men vi har fundet signal for triglycerid koncentration til at være mere robuste efter en nat i køleskabet. Tiden mellem trin 5.4 og 5.5 bør dog ikke overstige 36 h.
    1. (Valgfrit) Vortex første røret med supernatanten væske for 10 s og afpipetteres 5 µL ind i en ren microcentrifuge rør. Tilføje 95 µL af 0,15 M NaCl ind i nye microcentrifuge røret. Gemme disse delprøver i-20 ° C fryser for en senere analyse af protein, hvis det ønskes.
      Bemærk: Disse prøver af supernatanten med tilsat NaCl løsningen kan bruges til at bestemme proteinindhold ved hjælp af forskerens foretrukne assay. Vi bruger Bradford metode24. Proteinindholdet er én måde at standardisere foranstaltning af triglycerid indhold, men forskeren skal også være forsigtig med at fortolke disse nøgletal siden motion og kost kan også påvirke protein opbevaring.
    2. For de oprindelige supernatanten hætteglas replikater vortex første røret med supernatanten væske for 10 s, derefter afpipetteres 5 µL ind i to separate brønde i en 96-brønd mikrotiterplade at fremstille tekniske. Vær sikker på at Bemærk som brønde anvendes til hver prøve. Gentag dette trin for de 39 andre rør.
    3. Afpipetteres nøjagtigt 5 µL af Tom i fire brønde af mikrotiterplade, og for de resterende brønde afpipetteres nøjagtigt 5 µL af hver standard i tre eksemplarer.
    4. Tilføje præcis 125 µL triglycerol brugsopløsning til hver brønd, og tillade løsning til at reagere i 30 min.
    5. 96-brønd pladen anbringes i et spektrofotometer og læse absorbans ved 540 nm.
    6. Konvertere absorbans værdier i koncentration (mg/mL) ved hjælp af standardkurven beregnes ud fra standarderne.

Representative Results

Vi er især interesseret i at identificere de faktorer, der bidrager til den samlede metaboliske helbredsoplysninger om enkeltpersoner. Tidligere blev det konstateret, at genotype af kost interaktioner bidrage væsentligt til befolkningen niveau variation i metaboliske træk14. Det betyder, at hver genotype reagerer på miljømæssige forskelle i en unik og kompleks måde. For at udvide vores arbejde på genotype af miljøet virkninger til også at omfatte fysisk aktivitet, udviklet vi trædemølle, som er i stand til at udsætte store antal genotyper til aerob intervaltræning (AIT) på en måde, høj overførselshastighed.

For at fastslå, om motion på TW påvirket metaboliske træk, vi målte triglycerid opbevaring Oregon-R (ører) og y1w1 flyver, fælles vildtype fluer (figur 2B-C), og normaliserede disse værdier mod fluer proteinkoncentration, som oprindeligt rapporteret i Mendez et al. 11. vi analyseret data af multivariat analyse af varians (MANOVIE) tegner sig for genotype, sex, udøve behandling (og deres interaktioner), og eksperimenterende blok effekter såsom tid replikater og mad hætteglasset og fandt, at der var en betydelig genotype af motion interaktion (p = 0.0017) påvirker triglycerid opbevaring. Der var en betydelig seksuel dimorfe effekt mellem hanner og hunner, med hanner lagring mere triglycerider end kvinder (p < 0,0001). Vi så, at i kvinder, udøvet fluer havde betydeligt lavere triglyceridniveauer end deres udestående modparter (figur 2B, Pedersen < 0,0001). Hos mænd, mens faldet i triglycerid opbevaring observeret i Oregon-Rasmussen udøvede fluer (sammenlignet med kontrol) var ikke statistisk signifikant, en betydelig forskel i triglycerid opbevaring blev observeret mellem de to separate linjer (figur 2Christensen, Pedersen < 0,0001). Bemærk, at mens standardisere triglycerid koncentration mod proteinkoncentration giver indsigt på samlet flyve krop sammensætning nøgletal, sammenligning af direkte triglycerid eller protein koncentration blandt forskellige grupper af fluer kan også giver specifikke oplysninger om effekten af motion på disse fænotyper individuelt.

Da variabler som voksen motion, sex, og genotype er vist sig at påvirke triglycerid opbevaring, var det forventet, at disse faktorer også indflydelse på andre fænotyper og interagere med kost. Vi rejste larver fra en repræsentativ vildtype Drosophila genetiske Reference Panel line (DGRP 153)25 på enten en højt fedtindhold eller normal kost og induceret motion i voksne fluer for en uge (fig. 2A). Efterfølgende, udførte vi en RING-lignende negative geotaxis assay for at måle bjergrytter evner. Klatring analysen anvendes adskilte sig fra en standard RING assay; i stedet for en RING apparater, hætteglas med paraffin film åbningerne benyttedes til hus fluer under analysen. Andre aspekter af den oprindelige RING assay, såsom tid mellem trykke fluer til bunden af hætteglasset og tager billedet, blev tilbageholdt22.

Alle behandlinger blev gentaget tre særskilte gange med et minimum af 59 individuelle fluer per tid replikat og behandling. Data blev analyseret af MANOVIE regnskab for kost, genotype, sex, motion behandling (og deres interaktioner), samt eksperimentelle blok virkningerne af tid replikeres, assay hætteglas og hætteglas assay replikeres. Vi fandt, at udøvet hunnerne klatrede betydeligt højere (p < 0.005) når opdrættes på høj fedt diæt end nogen af de andre kvindelige behandlinger (figur 2D). For mænd, blev det set, at motion kun forbedret klatring når mænd blev rejst på den normale kost, og dem, der rejste på høj fedt diæt viste ingen væsentlige ændringer (figur 2E). Vi fandt også betydelige seksuelt dimorfe virkninger (p < 0,0001) i klatring med mænd klatre højere end hunnerne. Det overraskende resultat af et fald i klatring ydeevne efter motion for kvinder fra DGRP 153 linje (figur 2D) for kvinder indtager en normal kost (p < 0,0001) er et eksempel på hvordan denne form for motion kan ikke være en ensartet positiv intervention for alle genotyper og kunne gøres betinget af andre miljømæssige faktorer. I Mendez et al. 11, hunner fra fire andre genetiske linjer testet for deres klatring præstation efter at have været rejst på en normal kost alle viste øget bjergrytter evner med motion uddannelse. Dette tyder på, at det svar, der er observeret i DGRP 153 er genotype-specifikke og ikke en almen ejendom TW motion behandling. Variation i respons på tværs af køn, kost og motion behandlingsgrupper angiver, at der er betydelige sex-af-kost-af-motion interaktioner, der påvirker klatring evne til linjen (p < 0,0001).

Tilsammen viser resultaterne, at virkningen af motion på en voksen flue metabolisk sundhed kan være en funktion af sit køn, genotype og larver kost. Fænotypisk variation observeret i svar til genotype, miljøvariabler (f.eks., kost og motion), og sex er også blevet observeret i andre undersøgelser11,12,14,15. Således er kan TW og Drosophila være en stærk strategi at belyse de genetiske og miljømæssige faktorer forme metabolisk sundhed.

Figure 1
Figur 1 : The trædemølle øvelse maskine. (A) maskinen holder 48 hætteglas og har en justerbar hastighed funktion. Her blev eksperimenter udført ved 4 rpm. (B) enkelte fødevarer hætteglas indeholdende de eksperimentelle fluer var knækket i parenteser vedlagt en roterende aksel. (C) afstanden mellem hætteglas plug og fødevarer var 6 cm for motion hætteglas og 1 cm for kontrol hætteglas. Hætteglassene blev derefter placeret på maskinen til motion. (D) 5 dages omvendte pyramide øvelse regime blev brugt til at udøve voksne fluer. Hver dag, en yderligere fem minutter blev tilføjet til en af motion anfald at ramp up træningsintensiteten trinvist, som modellerer udholdenhed, intervaltræning. Dette tal er blevet ændret fra Mendez et al. 11. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Visuel metoder og repræsentative resultater. (A) metoder til testning larve kost og voksen Trænings interaktion virkninger. Larverne var rejst på høj fedt eller normal laboratorium kost og skiftede til normal mad på eclosion. Voksne fluer var adskilt af sex, placeret i eksperimentelle grupper og udøves i fem på hinanden følgende dage. Bagefter, en RING-lignende negative geotaxis klatring analyse blev udført, og fluer var frosset til triglycerid målinger. Repræsentative triglycerid data vises for to genetiske linjer, Oregon R og y1w1 (B) hunner og (C) mænd. Alle fluer blev opdrættet på en normal kost og udøver i voksenalderen. Niveauer med forskellige bogstaver er signifikant forskellige (p < 0,05) ved hjælp af en post hoc Student's t-test. Dette tal indeholder et undersæt af data, der indberettes i Mendez et al. 11. repræsentative klatring data vises for linje DGRP 153 for (D) hunner og (E) hanner. Hvert punkt repræsenterer den gennemsnit klatring ydeevne af 232 eller flere individer på tværs af tre uafhængige tidspunkter. Fejllinjer angive en standard fejl. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplemental Figure 1
Supplerende figur 1: et detaljeret diagram af trædemølle. (A) Diagram over den dobbelte hætteglas klemme struktur anvendes til at fastgøre hætteglas til maskinen. (B) indvendige visning af maskinens roterende drivsystem. (C) parallelle projektion af maskinens forsiden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende kodefil: TreadWheel.skp Venligst klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Motion protokollen detaljeret her har vist sig at kunne stimulere blid motion i Drosophila og kan bruges til at simulere udholdenhedstræning i en kontrolleret laboratorium indstilling11. Det skal bemærkes, at når i første omgang at udvikle begrebet trædemølle, betragtes vi som kommercielle produkter, der kan redigeres for at udføre tilsvarende (f.eks., et laboratorium rotisserie). Men vi i sidste ende afvist denne tilgang, at vælge en specialbygget design, fordi den kommercielle udstyr ikke har en tilstrækkelig lav rotationshastighed (4 rpm) og manglede tilstrækkelig hætteglas kapacitet for høj overførselshastighed prøve generation.

Selve TW-protokollen kan justeres til at omfatte en bred vifte af forskningsemner. For eksempel kan justering hyppighed og varighed af fluer Motion regimer ændre intensiteten af arbejde-outs de modtager. Ved at udvide den protokol, der er længere end en uge eller til andre aldersgrupper, vil det være muligt at studere virkningerne af motion på ældning og forskellige alders-relaterede sygdomme. Vi anbefaler, hvis en udvidet øvelse tilgang er gennemført, derefter mindst en hviledag pr. uge bør føjes til recovery. Ydeevne og forbedring viste sig at være større i regimer, der omfattede et opsving end de regimer, der benyttes fortløbende daglige øvelse12. Også, ville vi advare mod udvidelse udøve bout længder sidste 30 min da tilvænning til den roterende bevægelse kan forekomme efter lange perioder med kontinuerlig udøve11. Vi har også observeret genetiske variationer i fluer motivation til at opretholde deres aktivitetsniveau på TW11. Således, hvis længere anfald er ønsket, overveje at overvåge fluer aktivitetsniveau, som blev forelagt af Watanabe og gåde15,21 beskriver deres ændring af begrebet TW. Andre faktorer, der kan varieres omfatter temperatur og søvn-vågner mønstre, der er vist også påvirke flyve bevægelser26,27.

Der er et væld af tilgængelige analyser under og efter protokollen afslutning at afhjælpe virkningerne af motion på den fysiologiske, adfærdsmæssige og molekylært niveau, såvel som potentialet til at optrævle epigenetiske effekter af motion. Yderligere metaboliske assays (f.eks. glukose, glykogen og protein), cardiac ydeevne og inflammatoriske respons foranstaltninger kan bruges til at udforske effekt motion har på flyve fysiologi og kroppens sammensætning12,14 ,24,28. Forskellige adfærdsmæssige ændringer forbundet med motion induktion, såsom ændringer i fodring adfærd, bevægeapparatet aktivitet og søvn, kan også måles ved hjælp af værktøjer som CAFE assay29 eller aktivitet overvågning enheder12,15 ,30. Ændringer i genekspression og cellulær respiration tilskrives motion kan også kvantificeres ved hjælp af metoder som qRT-PCR11 og respirometri31. Endelig har Drosophila værdifulde genetiske ressourcer til rådighed, såsom Drosophila genetik Reference Panel 2 og Drosophila syntetiske befolkning ressource, der giver forskere platform til at udføre kvantitative genetiske studier25,32. Disse værktøjer aktiverer kortlægning eksperimenter, såsom Genome-Wide Association studier og kvantitative træk Loci mapping til at identificere kandidat loci forbundet med motion og kost.

Undersøgelser udført ved hjælp af trædemølle viste, at gennemsnitligt motion nedsætter kropsvægt, samlede triglycerid opbevaring og glykogen, mens stigende proteinindhold og klatring ydeevne11. Derudover var der variabel svar til motion på tværs af køn og genotyper for kropsvægt, samt triglycerider, protein, glykogen, glukose og aktivitet niveauer11,15. Mens variabiliteten af svar til motion og kost på tværs af genotyper og sex kan være udfordrende at fortolke og til tider ulogisk, det afspejler kilderne til reelle biologiske variation observeret i naturlige populationer. Som vi bestræber os på at forstå mangfoldigheden af underliggende faktorer, der bidrager til de høje priser for MetS, vil værktøjer, der letter udrede den relative rolle af forskellige faktorer ved at teste disse faktorer i modelorganismer være afgørende for vores evne at udvikle personlige forebyggelse og behandling indgreb. For at fuldt ud for at vurdere effektiviteten af øvelsen, skal hver af disse faktorer og hvordan de interagerer anses for Hvornår gennemføre eksperimenter og udarbejdelsen af konklusioner.

TW, ligesom de fleste andre flyve træningsmaskiner, er begrænset i sin evne til at kvantificere flyve bevægelse. For nylig, Watanabe og gåde udviklet den roterende motion kvantificering systemet (HENV), en TW rygrad modificeret med en aktivitet overvågning enhed (LAM25H) fra Drosophila Monitoring System serie15,21. Ligesom TW, dette system bruger roterende bevægelse forsigtigt fremkalde motion samtidigt med at benytter LAM25H arm til at holde styr på og kvantificere flyve aktivitet, men det holder et mindre antal hætteglas (32 hætteglas) end TW15. For høj overførselshastighed motion undersøgelser, hvis aktivitet kvantificering ikke er nødvendige eller ønskede, tillader TW for en større prøvenummer. TW design kan også ændres fra sin nuværende form til at rumme et større antal hætteglas. Dette system, sammen med andre eksisterende motion metoder, bidraget til at fastslå at motion er ikke kun kan opnås i Drosophila men kan også undersøges for at fastslå effekten af fysisk aktivitet på en lang række fysiologiske og molekylær svar 11,12,15. Således, TW, som en gennemprøvet metode til inducerende blid motion i fluer, kan bruges til at sonde en lang række biologiske spørgsmål.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Julie Jarnigan, Meredith Owens, Rachel Hill, Brandon Moye, Laura Mafla, Olivia Fish og resten af Reed Lab for deres hjælp med flyve dyrehold og billedbehandling. Sean Mendez bygget den oprindelige trædemølle med bistand fra UAB Maskinværksted. Finansiering af denne undersøgelse blev leveret af NIH-R01 GM 098856 til LKR og bachelor kreativitet og forskning Academy på University of Alabama KEL og BJW.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials for TreadWheel Construction:
Heavy Duty Vibration-Damping leveling Mount McMaster-Carr 60855K71 Quantity: 4
Stainless Steel Ball Bearing McMaster-Carr 57155K306 Quantity: 8
Plug-in Voltage Transformer (500MA, 120VAC input, 24 VAC output) McMaster-Carr 70235K16 Quantity: 1
Compact Square-Face DC Gear motor McMaster-Carr 6409K23 Quantity: 1
Tool Holder (clamps) McMaster-Carr 1723A22 Quantity: 5 (10x)
12L14 Carbon Steel Tight-Tolerance Rod McMaster-Carr 5227T24 Quantity: 1
Set Screw Shaft Collar McMaster-Carr 6432K13 Quantity: 8
Round-Belt Pulley McMaster-Carr 6284K51 Quantity: 5
Dart Controls – 25 Max RPM, Electric AC DC Motor McMaster-Carr 13DV 1A Quantity: 1
Materials for Fly Maintenace and Husbandry
6 oz Square Bottom Bottles (polypropylene) Genesee Scientific 32-130 Quantity: 1
35x10mm Petri Dishes VWR 82050-536 Quantity: 1
Narrow Drosophila vials Genesee Scientific 32-116 Quantity: 1
Flystuff Flypad Genesee Scientific 59-114 Quantity: 1
Blowgun, Mini Genesee Scientific 54-104 Quantity: 1
Materials for RING-like Assay:
ImageJ software NIH https://imagej.nih.gov/ij/ Quantity: 1
1 cM graph paper or drawn grid (at least 20 cM by 30 cM) various Quantity: 1
digital camera with timer or smart phone with camera timer app various Quantity: 1
Materials for Triglyceride Assay:
Dewar Flask VWR 14200-960 Quantity: 1
Serum Triglyceride Determination Kit Sigma Aldrich TRO100 Quantity: 1
Cordless Pestle Motor VWR 47747-370 Quantity: 1
Pestles VWR 47747-358 Quantity: 1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yanovski, J. A. Pediatric obesity. An introduction. Appetite. 93, 3-12 (2015).
  2. Alberti, K. G. M. M., Zimmet, P., Shaw, J. Metabolic syndrome-a new world-wide definition. A Consensus Statement from the International Diabetes Federation. Diabetic Medicine. 23, 469-480 (2006).
  3. American Diabetes Association. 6. Obesity Management for the Treatment of Type 2 Diabetes. Diabetes Care. 39, Suppl 1 47-51 (2016).
  4. Bliddal, H., Leeds, A. R., Christensen, R. Osteoarthritis, obesity and weight loss: evidence, hypotheses and horizons - a scoping review. Obesity Reviews. 15, 578-586 (2014).
  5. Bray, G. A. The epidemic of obesity and changes in food intake: the Fluoride Hypothesis. Physiol. Behav. 82, 115-121 (2004).
  6. O'Rahilly, S., Farooqi, I. S. Genetics of obesity. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 361, 1095-1105 (2006).
  7. Kenkre, J., Tan, T., Bloom, S. Treating the obese diabetic. Expert Rev Clin Pharmacol. 6, 171-183 (2013).
  8. Fiuza-Luces, C., Garatachea, N., Berger, N. A., Lucia, A. Exercise is the Real Polypill. Physiology. 28, 330-358 (2013).
  9. Matos, A., et al. Acute exercise reverses TRB3 expression in the skeletal muscle and ameliorates whole body insulin sensitivity in diabetic mice. Acta Physiologica. 198, 61-69 (2010).
  10. Mercken, E. M., Carboneau, B. A., Krzysik-Walker, S. M., de Cabo, R. Of mice and men: The benefits of caloric restriction, exercise, and mimetics. Ageing Research Reviews. 11, 390-398 (2012).
  11. Mendez, S., et al. The TreadWheel: A Novel Apparatus to Measure Genetic Variation in Response to Gently Induced Exercise for Drosophila. PLoS ONE. 11, 0164706 (2016).
  12. Piazza, N., Gosangi, B., Devilla, S., Arking, R., Wessells, R. Exercise-Training in Young Drosophila melanogaster Reduces Age-Related Decline in Mobility and Cardiac Performance. PLoS ONE. 4, 5886-5911 (2009).
  13. Graham, P., Pick, L. Drosophila as a Model for Diabetes and Diseases of Insulin Resistance. Fly Models of Human Diseases. 121, 397-419 (2017).
  14. Reed, L. K., et al. Genotype-by-Diet Interactions Drive Metabolic Phenotype Variation in Drosophila melanogaster. Genetics. 185, 1009-1019 (2010).
  15. Watanabe, L. P., Riddle, N. C. Characterization of the Rotating Exercise Quantification System (REQS), a novel Drosophila exercise quantification apparatus. PLoS ONE. 12, 0185090 (2017).
  16. Tinkerhess, M. J., Ginzberg, S., Piazza, N., Wessells, R. J. Endurance training protocol and longitudinal performance assays for Drosophila melanogaster. J Vis Exp. , (2012).
  17. Tinkerhess, M. J., et al. The Drosophila PGC-1α Homolog spargel Modulates the Physiological Effects of Endurance Exercise. PLoS ONE. 7, 31633 (2012).
  18. Sujkowski, A., Bazzell, B., Carpenter, K., Arking, R., Wessells, R. J. Endurance exercise and selective breeding for longevity extend Drosophila healthspan by overlapping mechanisms. Aging. 7, 535-552 (2015).
  19. Tjønna, A. E., et al. Aerobic Interval Training Versus Continuous Moderate Exercise as a Treatment for the Metabolic Syndrome: A Pilot Study. Circulation. 118, 346-354 (2008).
  20. Ciolac, E. G., et al. Effects of high-intensity aerobic interval training vs. moderate exercise on hemodynamic, metabolic and neuro-humoral abnormalities of young normotensive women at high familial risk for hypertension. Hypertension Research 2010 33:8. 33, 836-843 (2010).
  21. Watanabe, L. P., Riddle, N. C. Measuring exercise levels in Drosophila melanogaster using the Rotating Exercise Quantification System (REQS). J Vis Exp. , (2018).
  22. Gargano, J., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental Gerontology. 40, 386-395 (2005).
  23. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods 2012 9:7. 9, 671-675 (2012).
  24. Hammond, J. B. W., Kruger, N. J. New Protein Techniques. 3, 25-32 (1988).
  25. Mackay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482, 173-178 (2012).
  26. Miquel, J., Lundgren, P. R., Bensch, K. G., Atlan, H. Effects of temperature on the life span, vitality and fine structure of Drosophila melanogaster. Mechanisms of Ageing and Development. 5, 347-370 (1975).
  27. Berlandi, J., et al. Swing Boat: Inducing and Recording Locomotor Activity in a Drosophila melanogaster Model of Alzheimer's Disease. Front Behav Neurosci. 11, 159 (2017).
  28. Leng, S. X., et al. ELISA and Multiplex Technologies for Cytokine Measurement in Inflammation and Aging Research. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 63, 879-884 (2008).
  29. Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 8253-8256 (2007).
  30. Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. Assaying locomotor activity to study circadian rhythms and sleep parameters in Drosophila. J Vis Exp. , (2010).
  31. MÖlich, A. B., FÖrster, T. D., Lighton, J. R. B. Hyperthermic Overdrive: Oxygen Delivery does Not Limit Thermal Tolerance in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Science. 12, 1-7 (2012).
  32. Long, A. D., Macdonald, S. J., King, E. G. Dissecting complex traits using the Drosophila Synthetic Population Resource. Trends in Genetics. 30, 488-495 (2014).

Tags

Genetik sag 136 motion Drosophila aerob intervaltræning (AIT) metabolisk syndrom fedme triglycerid opbevaring negativ geotaxis genotype-af-miljø interaktion
Trædemølle: Interval Træning protokol for forsigtigt induceret øvelse i <em>Drosophila melanogaster</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lowman, K. E., Wyatt, B. J.,… More

Lowman, K. E., Wyatt, B. J., Cunneely, O. P., Reed, L. K. The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (136), e57788, doi:10.3791/57788 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter