Summary
されては、そっとハエの生得的な負の走を利用して大人のショウジョウバエの運動を誘導するために回転運動を使用します。代謝状態を評価する練習および遺伝子型、セックス、ダイエット、生理・分子アッセイへの影響などの要因間の相互作用の解析が可能です。
Abstract
複雑な代謝性疾患の発生率が増加カロリー摂取量低下の活動レベルのライフ スタイルに向けて広範な転移の結果として増加しています。これらの多因子性の疾患は、遺伝・環境・行動の要因の組み合わせから生じる。1 つそのような複雑な病気、メタボリック シンドローム (メッツ)、代謝性疾患、高血圧、高血糖、腹部肥満などのクラスターであります。運動と食餌療法の介入は、肥満とその後続の代謝性疾患を軽減するために医師によって推奨されて主要な治療です。特に好気性のインターバル トレーニング、運動介入は、タイプ 2 糖尿病 (2 型糖尿病)、心血管疾患 (CVD)、およびその他の条件の共通のリスク要因に良好な変化を刺激します。証拠の流入とモデル運動制御の設定でシステム実験における運動の効果を評価するための貴重なツールを提供しています確立する代謝の健康は治療効果の運動を記述します。キイロショウジョウバエは、運動介入に起因する生理・分子の変化を調査するための素晴らしいツールです。ハエ短い寿命および人間と比較した場合の栄養素の代謝の同様のメカニズムがあります。ショウジョウバエの運動を誘導して、登山を優しく誘導するはえの生得的な負の走傾向を生かしたされてと呼ばれるマシンを開発しました。これにより、代謝健康に及ぼす運動の基礎となる遺伝子型-環境の相互作用を理解する遺伝的多様なハエの大規模コホートで実験を行う研究者。
Introduction
幼年期および大人の肥満は、高カロリーの食事を消費し、インスリン抵抗性、慢性炎症、変形性関節症など、深刻な長期的な結果につながることができる時間の長時間のアイドル文化の流行を成長しています。1,2,3,4. これらの疾患の有病率は、カロリー摂取量、脂肪、糖、および主に坐った生活様式5の高消費に起因する支出の成長の不均衡が原因上昇し続けています。同様に、このエネルギーの不均衡は、タイプ 2 糖尿病 (2 型糖尿病) と心血管疾患 (CVD)5の場合の増加につながっています。個人は、彼らは、メタボリック シンドローム (MetS) 症状が、腹部の肥満と高脂血症の2疾患と診断されている場合の両方の疾患の発症リスクが高い。メッツが遺伝子とダイエットなど様々 な環境要因の複雑な相互作用によって形作られて練習6.したがって、この複雑な病気の基になるメカニズムの完全な理解を得るためにこれらすべての要因見なす必要があります。
メッツとの闘いになると、医師はまず食べて健康的なバランスのとれた食事と身体活動2,7、8を含むライフ スタイルの変化をお勧め。薬理学的、外科的介入、重症および3 これらのライフ スタイルの変化との組み合わせでのみ推奨のみ有効な薬物が限られている胃のバイパス手術は高価な生涯医療監視が必要ですので ,7,8。ような運動やダイエット、生活習慣介入することができます生成し、長期的な減量の目標を維持、これらの是正措置し、メッツに関連付けられている負の影響を完全に改善するかどうか必要がありますさらに勉強を7、 8。
マウス モデルは年の運動の代謝性疾患に及ぼす影響を調べるに使用されています。しかし、メッツの研究を飛ぶ運動の導入は比較的最近の努力9,10、11,12です。ハエ管理されたラボ設定で運動を勉強する最適な手段を提供するので、簡単に操作することが、寿命が短い、安価を維持するため、エネルギー関連の代謝経路は高度にショウジョウバエの間保存と人間13。キイロショウジョウバエのゲノムがよく特徴付けられる、および様々 な遺伝子と調節することができる遺伝子型-環境の相互作用に洞察力を提供できるショウジョウバエで使用可能な豊富な遺伝学のツールがある、個体の健康14に対する運動の効果。
ショウジョウバエの行使の現在のメソッドを呼び出すはえの生得的な負の走傾向、行動の本能に登っていく、そのエンクロージャ11,12,15 内大人で登山を刺激するには.力タワー、ハエ、運動を刺激する 1 つの方法体系的に垂直方向に飛ぶエンクロージャを発生させ、それらバック ベンチ表面に効果的にバイアルの底にハエをたたくこうして彼らの本能的な負の走を誘導12,16. このマシンを使用しての実験, 運動は cvd 法と、2 型糖尿病などを含む多くの年齢関連の病気に対する強力な防御因子と健康加齢12,17,18 を促進します。.具体的には、彼らは運動することができますハエの移動性の加齢に伴う低下の発症を減らすと心機能などの複数の加齢に伴う症状を改善し、ストレス応答17,18ことを示した。ただし、コントロールよりこれらの体験マシン、反復的な滴の力は、ハエを傷つける可能性があります示唆とモビリティ12に影響を与える登山得点は高かった塔に決して飛ぶ。より少なく説得力がある、物理的な外傷の原因を回避する運動を誘導する方法が力タワー プロトコル16に役に立つ、相補的な方法であることが示唆されました。
ショウジョウバエでは、運動を優しく誘導する我々 はされて. (図 1) と呼ばれる運動マシンを開発しました。(今後 TW と略すの) されて回転運動は常に順番に、ハエで登山を刺激する、バイアルの重力のトップの再定義によってハエの生得的な負の走傾向をトリガーします。他のメソッドとは異なり、TW の回転運動は本質的に穏やかな発生して、結果に影響を与える可能性があります追加のストレスを最小限に。したがって、マシンはメタボリック健康 (図 2)、加齢、睡眠、および他の多くのトピック11の運動の効果を研究する研究者を可能にするストレスを誘発することがなく大量のハエの運動を誘導するための手段を提供します。
私たちのメソッド、次の逆ピラミッド型、インターバル トレーニングのプロトコル、いくつかの持久力訓練 (AIT) 好気性の間隔の側面を大きく取り入れたトレーニングします。標準の AIT 政権は、このプロトコルの持久力を促進するために 5 日間にわたって各間隔の時間を徐々 に増やすことで変更されます。AIT では、メッツの他の介入方法を基準にして予防に特に有用されている、連続運動19,20よりメタボリック シンドロームの共通のリスク要因を逆転させることでより効果的であった。ただし、発電塔の相対的な TW の不利な点はハエより迅速に回転運動に慣らす、ハエの中で慣らす先天的な傾向の変化、運動の利点の解釈が複雑に従って。11渡辺と謎の15との相補的な記事21はこの制限をエレガントなソリューションについて説明します。
Protocol
1. されてセットアップと操作
注: は、機械構造を行使 TW の回路図の補足図 1を参照してください。必要な部品は、材料表に表示されます。"TW"、「されて」、「エクササイズ マシン」、「機械」、プロトコルを通して同じ意味で使われるフレーズ。
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調整モーターの電源スイッチを使用して、完全な回転期間が 15 s (4 回転)。セキュリティで保護されたクランプ回転アームに取り付けに飛ぶバイアルを配置する前に、機械の回転数を調整します。
- 標準ストップウォッチと不動だけで回転角かっこのいずれかに触れるブラシ モーター カバーにテープで小さなペイント ブラシなど、コンピューターに一時的に接続されているオブジェクトを使用して、速度を調整します。参照点として不動のオブジェクトを使用して 1 分で回転数を時間し、15 s 回転期間 (4 回転) を達成するために速度を調整します。
2. フライ ・ コレクションとメンテナンス
注: すべてのハエは、湿度 50% とベンチトップ操作下記の 12 h 明暗サイクル 25 ° C の定温器に保持されます。ハエは、特に断らない限り、標準コーンミール糖蜜ラボ ダイエットを供給されています。
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幼虫に孵化卵を収集するためにリンゴ ジュース寒天プレート、プレートあたり酵母ペーストおよび 6 オンスのプラスチック ボトルのドロップを使用して興味の各遺伝子型の産卵室を準備します。
- リンゴ ジュースに寒天を準備、3% 寒天培地をシャーレ 35 x 10 mm ¾ フルを埋めるに市販のリンゴ ジュースに溶解。使用するまで冷蔵庫で固化したプレートを格納します。
- 50 mL の円錐形遠心チューブで酵母の各グラムの水 2 mL の割合で蒸留水と市販のアクティブな乾燥酵母を組み合わせてください。ガラス攪拌棒を使用してケチャップの一貫性のあるペーストを作成する水とミックス酵母。目的の整合性を達成するために必要な酵母と水の比率を調整します。
- 使用間冷蔵庫で酵母ペーストを保存します。脱ガスを許可する緩いチューブ キャップをしてください。
- 鋭い針を使用して、またはナイフ 6 オンスに小さな穴を開けて産卵室の通気孔として正方形下部ボトル (ポリプロピレン)。
- 各りんごジュース寒天プレート上に酵母ペースト (直径 ~ 3 mm) の小さなスポットを軽くたたきます。
- 6 オンスのボトルとリンゴ ジュース寒天プレート キャップ ボトルに必要な遺伝子型の成虫を配置します。ゴムバンドでボトルにプレートを固定します。反転し、産卵するために大人を許可するインキュベーターで配置します。
- 日 2 回 (朝と夕方) リンゴ ジュース寒天産卵室を変更します。最初を許可する別の 12-24 時間のためのインキュベーター内使用のまま板令幼虫孵化します。
- 収集 1 齢幼虫細い絵筆やコレクション ピック (柔軟な細い針のハンドル) を使用してください。場所 50 1 齢を開発する目的の実験的食品の種類と完全な変貌インキュベーター (図 2A) で収容中の食品バイアルに特定の遺伝子型の幼虫。
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大人のための運動治療 (図 2A) を収集します。
- 蛹化時に小さな、湿らせた絵筆で蛹を収集し、成虫幼虫の食事にさらされることを防ぐために羽化する前に空の小瓶に置きます。
- 成虫の彼らとして標準ラボ ダイエット食品瓶 eclose に転送します。、羽化後 1 〜 5 日は分離性に基づくハエです。
- 収集した大人の各実験を指定の半分とコントロール グループ。バイアルあたり 50 ハエの濃度の標準ラボ ダイエットのバイアルにハエを維持します。
- 運動中に引っ掛かってからそれらを防ぐために 2 日に生鮮食品バイアルに大人を転送します。新しい食べ物にハエを導入する前にすぐに補足の生酵母のいくつかの穀物を追加します。
メモ: ライブ酵母サプリメントなしハエを維持することが可能ですが、私たちは、大人のハエが補充で最高を実行を発見しました。生酵母サプリメントは研究者の実験目標に合わせて変更することが変数です。
3. 運動プロトコル
- 実習 (1 日) の 1 日目、プッシュ バイアルは、食べ物と運動バイアル (図 1) にプラグの間コントロール バイアル 1 cm と 6 cm を残してプラグします。
メモ: コントロールのバイアルは、ハエの運動マシンの中を移動するためのスペースを制限され、こうしてハエが運動バイアルよりも動きに従事します。 - クランプでバイアルを置き、ハエを与える (図 1B) に順応する 10 分。
注: 代替コントロールは、正常に動く (バイアル) における空間の 6 cm 運動マシンに隣接するベンチトップ未行使のハエを維持することです。11にされてに「1 cm」と「卓上型に 6 cm」コントロールの両方を基準にして運動が同様の結果が見つかっています。 -
コントロールの両方を扱い、運動は回転と残りの部分 (図 1D) の発作を交互に週に 5 日間連続の一定の室温でマシン上の回転を飛ぶ。
注: 一定した温度は、活動レベルの温度の交絡の影響を避けるために必要です。温度操作研究、トレーニング中に温度処理を変更するインキュベーター内部 TW を配置します。- 1 日目に運動の 4 つの 15 分の発作、マシンを実行します。5 分休憩とこれらの発作を代替します。
- 次の日のそれぞれは既存の運動発作の 1 つに運動の 5 分を追加します。たとえば、2 日目、最初の練習試合 20 分を作るが、15 分の長い試合の残りの部分を維持します。
- 3 日目運動は次の 2 つのバウツの最初の 2 試合の間に、15 分に 20 分間飛ぶ。
- 4 日目に 15 分長いだけであるべき最終の試合を除くすべての 20 分運動発作を使用します。
- 5 日目ですべての練習試合 20 分を保ちます。
注: 残りの期間中にそのハエを含むバイアルが TW にしっかりとクランプでなければなりません。すべてのハエによって経験される重力の力は、同じ方向からくるために、これらの期間中にバイアルの方向は関連ありません。
- 特定の日の運動治療を完了すると、食品バイアル プラグを通常位置に戻すし、次の日まで彼らインキュベーターにハエを返します。
- 完全運動体制の終了後、標準フライ CO2麻酔方法を使用してハエを麻酔します。新しい食品容器または関心の表現型特性の評価のためのマイクロ遠心チューブ用のハエを転送します。
注: 例の表現型を含む能力 (食品バイアル)、トリグリセリドのストレージ (微量遠心チューブ)、または遺伝子発現 (遠心チューブ) を登山します。プロトコルは実行される評価に応じて適切に格納されているサンプルをここで一時停止できます。生きているハエを含む試金は、表現型のアッセイの具体的な目標に従って速やかに行われる必要があります。
4. 登山の評価
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運動プロトコルの完了に続く残りの 1 日後テスト登坂能力急速な反復負走 (リング) を使用して一般的な飛行-22負走登山試金のような。
- 空の小瓶 10 ハエのグループを配置 CO2麻酔を使用して (または既に並べ替えられている場合、食品容器から直接タップ) とハエが脱出することを防ぐためにパラフィン フィルムでシールします。新しい瓶に順応するハエ、少なくとも 10 分を与えます。バイアルの転倒を防ぐために余分な表面積を提供するバイアルの底に 〜 5 cm 直径厚紙の円をテープします。
注: バイアル プラグ使用しないでくださいの高さを決定するために使用バイアルの一部を阻害するために登った。 - 内蔵のタイマー (タイマー カメラ アプリケーション作品よく持つスマート フォン) マウント、固定カメラの完全なビューでバイアル 20 cm 1 cm × 1 cm グリッドを配置します。
- バイアルの下まですべてのハエをノックするカウンター 3 回でバイアルを軽くタップします。後 3 回バイアルをタップすると、各フライに登った高さを決定するイメージをキャプチャする 4 s カメラ タイマーをすぐに開始します。
注: 一貫した強度で、タップによるハエの反応の変化を最小限に抑えるために各運動制御コントラストで同じ研究者によっては、タッピングを行う必要があります。 - 4.1.3 のステップをバイアルあたりの 3 つの試験の合計を生成するための試験の間に、少なくとも 1 分残り 2 回、繰り返します。
- 空の小瓶 10 ハエのグループを配置 CO2麻酔を使用して (または既に並べ替えられている場合、食品容器から直接タップ) とハエが脱出することを防ぐためにパラフィン フィルムでシールします。新しい瓶に順応するハエ、少なくとも 10 分を与えます。バイアルの転倒を防ぐために余分な表面積を提供するバイアルの底に 〜 5 cm 直径厚紙の円をテープします。
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登山の分析が完了した後すぐに、その他の解析のためハエを保存するには、は、フラッシュは、浸漬によるハエを液体窒素で凍結します。
- 液体窒素で ~ 5 cm の深さに満ちて浅い、オープン トップのデュワー フラスコを使用します。
- CO2麻酔を用いた小型遠心管にハエを転送し、満ちている液体窒素デュワー フラスコ チューブ。また、将来の分析では、CO2の回避を必要とする場合スナップを固定、登山のバイアルに直接飛ぶ下部液体窒素に浸漬しに冷凍のハエを転送中に、バイアルの底にハエをやさしくタッピングマイクロ遠心チューブ用鉗子を使用します。
注: 液体窒素は低温は、適切な防護装置および部屋の換気でのみ使用する必要があります。
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ImageJ23多点選択ツールを使用してプロセスのイメージ。
- ImageJ 内処理のイメージを開きます。
- それぞれの個々 のフライで登った距離を計算する背景のグリッド用紙に基づいて 1 cm スケールを設定します。ツールを使用して「線」ツール ・ バーからトレース 1 cm2の正方形の 1 つ側面背景のグリッド用紙から。「分析」タブをクリックし、「設定スケール」を選択します。'1.00' と 'cm' として「長さの単位」は、"グローバル"はチェック、確認として「知られている距離」を設定し、「OK」をクリックして。
- ツール ・ バーから「多点選択」アイコンを選択し画像のバイアルの底にズームイン。バイアルの一番下として最初のポイントを設定するには、バイアルの最も低い部分をクリックします。
- データ ポイントとしてマークするバイアルの各場の中心をクリックします。バイアルあたり 11 点、1 バイアルの底をマーキングと各場の合計があること注意してください。
- 「分析」タブをクリックし、測定値のテーブルを生成する「測定」を選択します。テーブルを csv ファイルとして保存します。
- スプレッドシート プログラムで csv ファイルを開くし、各フライ ポイント 2-11 から測定値の表 1 をポイントの y 値を差し引くことによって上昇の正確な距離を計算します。
- 各イメージの 4.3.1 4.3.6 を介しての手順を繰り返します。
5. 中性脂肪ストレージ分析
注: サンプル、規格・ グリセロール標準液 triglycerol 作業ソリューションの試金で使用されるプロトコルの間氷の上保管する必要があります、使用しない時は冷蔵庫で保存する必要があります。
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グリセロール標準ソリューションを使用して基準を準備します。
- B という微量遠心チューブに均質化バッファーの 1,000 μ L を追加することによって空白の (B) を作る
- S1 のラベル微量遠心チューブにグリセロール標準液 1,000 μ L を追加することで標準 1 (S1) 好評につき、2.5 mg/mL を作る。
- 式行先方向2S2 をラベル付け遠心チューブ O を 500 μ l 添加するグリセロール標準液 500 μ L を追加することで標準的な 2 (S2) 好評につき、1.25 mg/mL を作る。
- 標準 3 (S3) 好評につき、0.625 mg/mL に追加されるようにグリセロール標準溶液の 250 μ L 750 μ L 式行先方向2S3 をラベル付け遠心チューブ O の。
- S4 というラベルの付いた微量遠心チューブに diH20 の 875 μ L にグリセロール標準溶液の 125 μ L を追加することで標準的な 4 (S4)、好評につき、0.3125 mg/mL を作る。
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血清トリグリセリドの定量キットから triglycerol 作業ソリューションを準備します。
- キットから遊離グリセリン試薬に式行先方向2O の 40 mL を加え、ボトルを反転して混ぜます。
- キットからトリグリセリド ソリューションに式行先方向2O の 10 mL を加え、ボトルを反転して混ぜます。
- Triglycerol 作業ソリューションを準備する反転によるミックス グリセリン試薬およびトリグリセリドのソリューションを組み合わせます。
注: triglycerol の作業ソリューションは 60 日間、以下のプロトコルを使用してキットあたり 4 つの 96 ウェル プレート アッセイを完了できます。使用されるボリュームは 96-well 版のフォーマットで使用するための公式の血清中性脂肪測定キットから比例してスケール ダウン。
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慎重に 96 ウェル フラット底を打ち、3 通 (または空白の 4 連) で明確なマイクロ プレートに各規格の 5 μ L を分注して空白と規格を確認します。
- まあ標準を含む各に Triglycerol 作業ソリューションの正確 125 μ L を追加します。30 分間反応するソリューションを許可します。
- 分光光度計の 96 ウェル プレートを置き、540 で吸光度を読み nm。吸光測定を使用して、標準曲線を作成し R2値を評価することによって標準の精度を確認します。規格の R2 0.98 より小さい場合より慎重に再度基準を準備します。
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中性脂肪ストレージ14冷凍 10 を含む遠心管を使用して試金の開始日 1 にそれぞれ飛ぶ。
注: 繰り返しまたはマルチ チャンネル ピペットは、試金で使用される各試薬の量が非常に正確で一貫性のある再現可能な結果を得るためにする必要がありますので、このステップで使用しない必要があります。我々 の経験で繰り返し、マルチ チャンネル ピペットはこのレベルの精度と一貫性を持っていません。品質管理の実験者によってシングル チャンネル ピペットから各因数を視覚的に確認できるし、同じ程度にすべてのサンプルは、シングル チャンネル ピペット固有バイアスが経験されます。- KH2PO40.272 g、0.5 M の EDTA の 400 μ L と式行先方向2O は、ガラス瓶の 199.6 mL を組み合わせることにより均質化バッファーの 200 mL のストックを準備します。
- 大人 10 名の登山試験後冷凍を含む 40 のマイクロ遠心チューブ用のそれぞれに均質化バッファーの正確に 100 μ L を追加します。その後、遠心分離機のサンプル 30 18,000 g で s。
- 挽く飛ぶ乳白色溶液を調製する電動グラインダーと杵 (または組織の均質化の別のフォーム) を使用します。各サンプルに対して新鮮な乳棒を使用していることを確認します。18,000 g で 2 分間試料を遠心分離します。
- 新しい遠心管にピペットの各管から液の上澄みのトップ 75 μ L のみ。上ペレットからフライのビットが転送されていないことを確認します。一晩冷蔵庫で新しいチューブを配置します。
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冷蔵庫から 1 日のサンプルを取除くことによってトリグリセリド プロトコルの 2 日目を開始します。
注: 手順 5.5 は、5.4 と同じ日を実行することが、我々 はより堅牢な夜の後にする冷蔵庫の中トリグリセリド濃度の信号を発見しました。ただし、手順 5.4 と 5.5 の間の時間は 36 時間を超えない。- (省略可能)渦最初 10 s とピペットの上澄み液管きれいな遠心管に 5 μ L。新しい遠心チューブに 0.15 M 塩化ナトリウム 95 μ L を追加します。必要な場合は、蛋白質の後で試金のための-20 ° C のフリーザーでこれらのサブサンプルを格納します。
注: 追加の NaCl 水溶液で上澄みのこれらのサンプルは、研究員の最寄りのアッセイを用いた蛋白質内容を決定し使用できます。ブラッドフォード方法24を使用します。タンパク質含有量は、トリグリセライドの測定を標準化する方法の 1 つが、研究者は運動以来これらの比率の解釈に慎重にする必要があり、食事もタンパク質のストレージに影響を与えます。 - 元の培養上清中瓶用渦最初 10 秒、その後、技術を生成する 96 ウェル マイクロ プレートの 2 つの井戸にピペット 5 μ L の培養上清液管をレプリケートします。必ずどの井戸が各サンプルに使用される注意してください。39 その他の管のためには、この手順を繰り返します。
- マイクロ プレートの 4 つの井戸にダミーの丁度 5 μ L をピペットし、残りの井戸の 3 通の各標準の正確に 5 μ L のピペットです。
- 丁度 125 μ L triglycerol 作業ソリューションを各ウェルに追加およびソリューションで 30 分間反応をします。
- 分光光度計の 96 ウェル プレートを置き、540 で吸光度を読み nm。
- 基準から計算した標準曲線を用いて吸光度値濃度 (mg/mL) に変換します。
- (省略可能)渦最初 10 s とピペットの上澄み液管きれいな遠心管に 5 μ L。新しい遠心チューブに 0.15 M 塩化ナトリウム 95 μ L を追加します。必要な場合は、蛋白質の後で試金のための-20 ° C のフリーザーでこれらのサブサンプルを格納します。
Representative Results
個人の全体的な代謝の健康に寄与する要因を識別するに特に興味を持っております。以前、遺伝子型によって食の相互作用が代謝の特徴14の人口レベルの変動に大幅に貢献することが分かった。これは、各遺伝子型の応答ユニークで複雑な方法で環境の違いを意味します。物理的な練習を含めて遺伝子型と環境によって効果に私たちの仕事を拡張するため、されてを開発した、高スループット方法訓練 (AIT) 好気性の間隔に遺伝子型の大規模な番号を公開することが可能であります。
代謝の特徴かどうか、TW の運動に影響するには、トリグリセリドのストレージを測定したオレゴン-R (動体) と y1w1ハエ、一般的な野生型のハエ (図 2B-C) とハエのに対してこれらの値を正規化当初メンデスらに報告された蛋白質の集中11. 多変量分散分析 (実質的) 会計遺伝子型、セックス、運動治療 (とその相互作用) および時間の複製や食品など実験的ブロック効果バイアルおよび重要があったことが判明して、データ分析を行った遺伝子型によって運動の相互作用 (p = 0.0017) トリグリセリドのストレージに影響を与えます。男性と女性 (p < 0.0001) よりもより多くのトリグリセリドを格納する男性と女性の間に性的に二形の影響があった。私たちは女性で行使ハエでの未行使の同等より大幅に低いトリグリセリドのレベルがあったことを見た (図 2B、 p < 0.0001)。男性、オレゴン-R にみられるトリグリセリドのストレージの減少を行使 (コントロール) と比較するとハエはなかった統計的に有意な 2 つの別々 の行 (図間トリグリセリドのストレージに有意差は認め2C、 p < 0.0001)。組成比全体的なハエの体内の洞察力は、タンパク質濃度に対するトリグリセリド濃度を標準化、ハエの異なるグループ間で直接中性脂肪やタンパク質濃度の比較することができます提供も注意してください。これらの表現型の練習の効果について個別に。
セックス、アダルト運動のような変数およびトリグリセリドのストレージに影響を与える遺伝子が表示されます、ので、これらの要因はまた他の表現型に影響を与えるし、ダイエットとの対話が必要です。我々 は 1 週間 (図 2A) の代表的な野生型のショウジョウバエの遺伝的参照パネル ライン (DGRP 153)25が高脂肪または通常の食事と大人のハエの誘導運動から幼虫を発生します。その後、クライミング能力を計測するリングのような否定的な走アッセイを行った。登山のアッセイに使用異なっていたリングの標準的な試金;リング装置の代わりにバイアルの開口部を覆っているパラフィン フィルムは家のハエ分析中に使用されました。オリジナル リング アッセイ、バイアルの底にハエをタップし、写真を撮るまでの時間などの他の側面は、剰余金22でした。
すべての治療は時間の複製と治療につき 59 個々 のはえの最小値と別々 に 3 回を繰り返した。データ ダイエット、遺伝子型、セックスの実質的会計によって分析された、時間複製、試金瓶とバイアル アッセイ複製の実験的ブロック効果だけでなく、治療 (とその相互作用) を行使します。行使女性が有意に高く登ったことがわかった (p < 0.005) 女性治療 (図 2D) のどれよりも高脂肪食で飼育した場合。男性は、運動は、通常国会で提起された男性と有意に亢進 (図 2E) 高脂肪の食事で育った人を登山のみ改善された見られました。また重要な性的に二形の効果がわかった (p < 0.0001) で男性が女性よりも高い登山とクライミングします。登坂能力は、通常の食事を消費する女性のための DGRP 153 行 (図 2D) から次の女性のための運動の低下の意外な結果 (p < 0.0001) のこのタイプの練習ができない場合がありますどのように例です、すべての遺伝子型の一様に肯定的な介入および他の環境要因に依存することができます。メンデスらに11、通常提起されている後の上昇性能をテスト 4 の他の遺伝子のラインから女性はダイエット運動トレーニングで強化された登山能力を示したすべてです。これは DGRP 153 の観測は遺伝子多型と TW 運動治療の全般的なプロパティではなく、示唆しています。セックス、ダイエット、運動治療群、応答の可変性は、線の登坂力に影響を与えるセックスでダイエットで運動の交互作用が有意があることを示す (p < 0.0001)。
一緒に取られて、結果は大人のフライのメタボリック健康の運動の影響がセックス、遺伝子型、幼虫の食の機能をすることができますを示します。遺伝子への応答において表現型の変化を観測 (例えば食事と運動)、環境変数とセックスもで観察されている他研究11,12,14,15。したがって、TW とショウジョウバエはメタボリック健康を形成遺伝と環境の要因を解明するための強力な戦略をすることができます。
図 1:、されてエクササイズ マシン。(A) 機械 48 バイアルを保持し、変速機能を持っています。ここで 4 回転で実験を行った。実験のハエを含む (B) 個々 の食品容器は回転車軸に取り付けブラケットにスナップされました。バイアルの間の距離 (C) プラグと食品運動バイアルおよび制御瓶用 1 cm 6 cm であった。バイアルは、運動のマシンに配置されました。(D) 5 日間逆ピラミッド運動政権は、成虫を行使する使用されました。毎日、追加 5 分追加されたモデルは持久力、運動強度を徐々 にランプに運動発作の 1 つにインターバル トレーニング。この図は、メンデスらから変更されています。11.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 視覚的方法と代表的な結果。(A) 幼虫食事と大人の運動の相互作用をテストする方法。幼虫は高脂肪または通常所ダイエットで発生され、羽化時に通常の食品に切り替え。成虫がセックスで区切られ、実験グループに配置、5 日連続の行使。その後、アッセイを登ってリングのような否定的な走を行った、ハエが中性脂肪測定用凍結されました。代表的なトリグリセリドのデータが表示されます 2 つの遺伝子のライン、オレゴン州 R および y1w1 (B) と (C) の男性。すべてのハエは、普通の食事で飼育され、成人で行使。別の文字のレベルが大幅に異なる (p < 0.05)ホックを投稿スチューデントのtを使用して-をテストします。この図は、メンデスらで報告されるデータのサブセットを含む11. DGRP 153 行女性 (D) と (E) 男性の代表的な登山データが表示されます。各ポイントは、3 つの独立した時間点にわたって 232 以上の個人の平均登坂性能を表します。誤差範囲は、1 つの標準エラーを示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足図 1: されての詳細な概略図。(A) 構造の図、デュアル バイアル クランプ バイアルをマシンに接続するために使用します。(B) 回転駆動装置の内部ビュー。(C) マシンの前面の平行投影。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
補足コード ファイル: TreadWheel.skpこのファイルをダウンロードするここをクリックしてください。
Discussion
ここで詳細な運動プロトコルはショウジョウバエの穏やかな運動を正常に刺激することが示されているし、11の設定に制御室における耐久性運動をシミュレートするために使用することができます。最初されて概念を開発するとき我々 は同様に実行する変更可能性がある商品を考慮することに注意してください (例えば、研究室ロティサリー)。しかし、我々 最終的に拒否このアプローチは、業務用機器が十分に低い回転速度 (4 回転) を持っていなかったし、高スループット サンプルの生成のための十分なバイアル容量に欠けていたので特注デザインの選択。
TW のプロトコル自体は、研究のトピックの広い範囲を網羅する調整できます。たとえば、頻度とハエの運動体制の期間の調整を受けるワークアウトの強度を変更できます。長い 1 週間以上または他の年齢層のプロトコルを拡張すると、高齢化と様々 な加齢に伴う疾患の運動の効果を研究することが可能なります。拡張運動アプローチが実装されている場合、週に少なくとも 1 つの残りの日する必要がありますに追加することにより回復するをお勧めします。連続して毎日運動12を使用するそれらの政体より回復日が含まれて政権で増加するパフォーマンスと改善が示されました。また、回転運動に慣れ、長時間連続の練習問題11後に発生するので練習試合の長さ過去 30 分の延長に反対注意して欲しい。我々 はまた、TW11の活動レベルを維持するためにハエのモチベーションの遺伝の変化を観察しました。したがって、長い発作が必要な場合は、TW の概念の彼らの変更を記述する渡辺と謎の15,21によって表されるハエの活動レベルを監視することを検討してください。様々 なことができる他の要因で、温度と睡眠・覚醒パターンも飛ぶ動きの26,27に影響する示されています。
中と運動の後成的変化を解明する可能性と同様、生理学的な行動、および分子レベルでの運動の効果に対処するためのプロトコル完了後利用可能な解析の茄多があります。さらに運動効果を探索するメジャーを使用できます追加代謝アッセイ (例えばブドウ糖、グリコーゲン、蛋白質)、心機能、炎症反応は、飛ぶ生理・体組成12,14 ,24,28。カフェ アッセイ29またはアクティビティ監視デバイス12,15 のようなツールを使用して、運動の誘導、食行動、自発運動と睡眠の変化などに関連付けられているさまざまな行動の変化を測定できます。 ,30。における遺伝子発現と細胞呼吸運動に起因する変更はまた qRT PCR11と呼吸の31のようなメソッドを使用して定量化することができます。最後に、ショウジョウバエはあるショウジョウバエ遺伝学参照パネル 2 と研究者を実行するプラットフォームを提供するショウジョウバエの合成人口リソースなどの貴重な遺伝資源量的な遺伝学研究25,32。これらのツールは、運動と食事に関連する候補遺伝子を識別するために、ゲノムワイド関連研究と量的形質遺伝子座のマッピングなどのマッピング実験を有効にします。
されてを使用して完了の研究は、平均して、運動減少する体重、合計トリグリセリドのストレージ、およびグリコーゲン、蛋白質含有量の増加とパフォーマンス11を登山中を示した。さらに、性別や体重と同様、トリグリセリド、タンパク質、グリコーゲン、グルコースおよび活動レベル11,15遺伝子型間で行使する変数の回答でした。運動し、食事の遺伝子型と性別間での応答の変動を解釈するために挑戦できるし、時、直感的、それを反映している自然集団で観測された実際の生体変化の源。モデル有機体のこれらの要因をテストすることによって様々 な貢献の要因の相対的な役割を disentangling を容易にするツールを我々 の能力に重要になります、メッツの率が高いに貢献する要因の多様性を理解することを目指していきますパーソナライズされた予防と治療介入を開発。運動の効果を評価するには、これらの要素とやり取りする方法の各は、実験を行うとの結論を導き考慮されなければなりません。
TW は、他のほとんどのフライ運動マシンのようなフライの動きを数値化する能力が制限されます。最近では、渡辺と謎は、回転運動の定量化システム (リクエスト)、監視ユニット (LAM25H) ショウジョウバエ監視システム シリーズ15,21からアクティビティに変更 TW バックボーンを開発しました。TW のようなこのシステムは、LAM25H アームを使用して追跡し、飛ぶ活動を定量化しながら運動を優しく誘導する回転運動を使用しますが、TW15よりバイアル (32 本) のより小さい数を保持しています。高スループット運動研究活動定量化が必要か、必要でない場合、TW は大きいサンプル番号に対してできます。TW のデザインは、バイアルの大きい数を収容する、現在のフォームから変更でした。運動はショウジョウバエの達成だけでなく生理・分子反応の様々 な身体活動の効果を決定する研究もできる、確立を助けた他の既存の行使の方法と共に、このシステム11,12,15。したがって、TW、ハエ、穏やかな運動を誘導する実績のあるメソッドとして使用できます多種多様な生物の質問を調査します。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
ジュリー Jarnigan、メレディス ・ オーエンス、レイチェルの丘、ブランドン ・ モイエ ・、ローラ Mafla、オリビア魚とフライの飼育および画像処理のリード ラボの残りの部分に感謝したいと思います。ショーン ・ メンデスは、UAB のマシン ショップからの支援を受けて元されてを構築しました。この研究のための資金は、スリランカ ルピーと学部創造ケルと bjw 認定するアラバマの大学で研究院 NIH R01 GM 098856 によって提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials for TreadWheel Construction: | |||
| Heavy Duty Vibration-Damping leveling Mount | McMaster-Carr | 60855K71 | Quantity: 4 |
| Stainless Steel Ball Bearing | McMaster-Carr | 57155K306 | Quantity: 8 |
| Plug-in Voltage Transformer (500MA, 120VAC input, 24 VAC output) | McMaster-Carr | 70235K16 | Quantity: 1 |
| Compact Square-Face DC Gear motor | McMaster-Carr | 6409K23 | Quantity: 1 |
| Tool Holder (clamps) | McMaster-Carr | 1723A22 | Quantity: 5 (10x) |
| 12L14 Carbon Steel Tight-Tolerance Rod | McMaster-Carr | 5227T24 | Quantity: 1 |
| Set Screw Shaft Collar | McMaster-Carr | 6432K13 | Quantity: 8 |
| Round-Belt Pulley | McMaster-Carr | 6284K51 | Quantity: 5 |
| Dart Controls – 25 Max RPM, Electric AC DC Motor | McMaster-Carr | 13DV 1A | Quantity: 1 |
| Materials for Fly Maintenace and Husbandry | |||
| 6 oz Square Bottom Bottles (polypropylene) | Genesee Scientific | 32-130 | Quantity: 1 |
| 35x10mm Petri Dishes | VWR | 82050-536 | Quantity: 1 |
| Narrow Drosophila vials | Genesee Scientific | 32-116 | Quantity: 1 |
| Flystuff Flypad | Genesee Scientific | 59-114 | Quantity: 1 |
| Blowgun, Mini | Genesee Scientific | 54-104 | Quantity: 1 |
| Materials for RING-like Assay: | |||
| ImageJ software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | Quantity: 1 |
| 1 cM graph paper or drawn grid (at least 20 cM by 30 cM) | various | Quantity: 1 | |
| digital camera with timer or smart phone with camera timer app | various | Quantity: 1 | |
| Materials for Triglyceride Assay: | |||
| Dewar Flask | VWR | 14200-960 | Quantity: 1 |
| Serum Triglyceride Determination Kit | Sigma Aldrich | TRO100 | Quantity: 1 |
| Cordless Pestle Motor | VWR | 47747-370 | Quantity: 1 |
| Pestles | VWR | 47747-358 | Quantity: 1 |
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