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Genetics

La rueda: Protocolo de entrenamiento de intervalo para suavemente inducida por ejercicio en Drosophila melanogaster

Published: June 8, 2018 doi: 10.3791/57788
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Alabama

Summary

La rueda utiliza el movimiento de rotación para inducir suavemente el ejercicio en adultos de Drosophila melanogaster explotando geotaxis negativa, innata de moscas. Permite análisis de las interacciones entre ejercicio y factores como el genotipo, sexo, dieta y su efecto en ensayos fisiológicos y moleculares para evaluar salud metabólica.

Abstract

La incidencia de enfermedades metabólicas complejas ha aumentado como resultado de una transición generalizada hacia estilos de vida de aumento en la ingesta calórico y los niveles de actividad baja. Estas enfermedades multifactoriales se presentan de una combinación de factores genéticos, ambientales y conductuales. Una de esas enfermedades compleja es síndrome metabólico (MetS), que es un grupo de trastornos metabólicos, incluyendo hipertensión, hiperglucemia y obesidad abdominal. Ejercicio e intervención dietética son los tratamientos primarios recomendados por los médicos para mitigar la obesidad y sus enfermedades metabólicas subsiguientes. Intervención de ejercicios, entrenamiento, en especial aeróbico interválico estimula cambios favorables en los factores comunes de riesgo para Diabetes Mellitus de tipo 2 (T2DM), Enfermedad Cardiovascular (ECV) y otras condiciones. Con la llegada de pruebas describiendo el ejercicio efecto terapéutico tiene en la salud metabólica, establecer un sistema de modelos de ejercen en un ambiente controlado proporciona una valiosa herramienta para evaluar los efectos del ejercicio en un contexto experimental. Drosophila melanogaster es una gran herramienta para la investigación de los cambios fisiológicos y moleculares que resultan de la intervención de ejercicios. Las moscas tienen vida corta y mecanismos similares de metabolizar nutrientes en comparación con los seres humanos. Para inducir el ejercicio en Drosophila, se desarrolló una máquina llamada la rueda, que utiliza la tendencia de geotaxis negativa, innata de la mosca para inducir suavemente a subir. Esto permite a los investigadores a realizar experimentos en grandes cohortes de moscas genéticamente diversas para comprender mejor las interacciones genotipo por ambiente subyacente a los efectos del ejercicio sobre la salud metabólica.

Introduction

Infancia y obesidad adultos están creciendo las epidemias en las culturas que consumen dietas altas en calorías y permanecen inactivo durante largos períodos de tiempo, que puede conducir a graves consecuencias a largo plazo, incluyendo resistencia a la insulina, la inflamación crónica y osteoartritis 1 , 2 , 3 , 4. la prevalencia de estos trastornos sigue aumentando debido al creciente desequilibrio en la ingesta calórica y el gasto atribuido al elevado consumo de grasas y azúcares y un sedentarismo principalmente5. En consecuencia, este desequilibrio de la energía ha llevado a un aumento en casos de Diabetes Mellitus de tipo 2 (T2DM) y Enfermedad Cardiovascular (ECV)5. Los individuos están en un riesgo mayor de desarrollar ambas patologías si ha sido diagnosticados con el trastorno, el síndrome metabólico (MetS), cuyos síntomas incluyen obesidad abdominal y dislipidemia2. MetS se forma por las complejas interacciones entre el genotipo y diversos factores ambientales, como dieta y ejercicio6. Por lo tanto, para obtener un completo entendimiento de los mecanismos subyacentes de esta compleja enfermedad, todos estos factores deben considerarse.

Cuando se trata de la lucha contra los MetS, los doctores recomiendan primero experimentando cambios de estilo de vida que incluyen comer una dieta sana y equilibrada y actividad física2,7,8. Desde medicamentos eficaces son limitados y la cirugía de bypass gástrico es costosa y requiere supervisión médica permanente, intervención farmacológica y quirúrgica sólo se recomienda para los casos graves y sólo en combinación con estos cambios de estilo de vida3 ,7,8. Mientras que las intervenciones de estilo de vida, tales como ejercicio y dieta, pueden producir y mantener objetivos de pérdida de peso a largo plazo, o no estas medidas correctoras pueden mejorar completamente los efectos negativos asociados con MetS necesita más estudio de7, 8.

Modelos de ratón han sido utilizados para examinar los efectos del ejercicio en enfermedades metabólicas durante años; sin embargo, la introducción del ejercicio volar investigación en MetS es un esfuerzo relativamente reciente9,10,11,12. Moscas de proporcionan el vehículo perfecto para estudiar el ejercicio en un entorno de laboratorio controlado, ya que son fácilmente manipulados, tienen una vida corta, son barato de mantener y rutas metabólicas energéticas están muy conservadas entre Drosophila y los seres humanos13. Genoma de D. melanogaster está bien caracterizada, y existe una amplia variedad de herramientas de genética para su uso en Drosophila que puede proporcionar la penetración en diferentes genotipos y las interacciones genotipo por ambiente que podrían modular la efecto del ejercicio sobre la salud14.

Los métodos actuales de ejercicio de Drosophila invocan tendencia de geotaxis negativa, innata de la mosca, el instinto de comportamiento para escalar hacia arriba, para estimular la escalada en adultos dentro de sus recintos11,12,15 . La torre de la energía, un método para estimular el ejercicio de moscas, plantea sistemáticamente los recintos volarás verticalmente y luego cae les detrás a la superficie del Banco, efectivamente golpeando las moscas en el fondo del frasco, así induciendo su instintiva geotaxis negativa 12 , 16. experimentos realizados utilizando esta máquina mostraron que el ejercicio es un poderoso factor protector contra muchas enfermedades relacionadas con la edad, incluyendo enfermedades cardiovasculares y el T2DM y promueve un envejecimiento saludable12,17,18 . En concreto, demostró que ejercicio puede reducir la aparición de la movilidad relacionada con la edad disminución de moscas y mejorar síntomas múltiples relacionados con la edad, tales como el desempeño cardíaco y tensión respuesta17,18. Sin embargo, control vuela nunca colocado en la torre mostraron puntuaciones más altas de escalada que experimenta la máquina, lo que sugiere la fuerza de las caídas repetitivas puede herir a las moscas y que afectan a la movilidad12. Esto sugiere que un método alternativo de inducir el ejercicio que es menos vigorosa y evita causar trauma físico sería un método útil, complementario a la torre de la energía protocolo16.

Para inducir suavemente ejercicio en Drosophila, hemos desarrollado una máquina de ejercicio llamada la rueda (figura 1). La rueda de (en adelante abreviado como TW) movimiento de rotación provoca tendencia geotaxis negativa, innata de las moscas, redefiniendo constantemente arriba gravitacional de los viales, que a su vez, estimula la escalada en las moscas. A diferencia de otros métodos, el movimiento de rotación del TW es inherentemente apacible, que reduce al mínimo el número de estresores adicionales que pueden surgir y afectar los resultados. Así, la máquina proporciona los medios para inducir el ejercicio en gran número de moscas sin provocar estrés, lo que permitirá a los investigadores a estudiar los efectos del ejercicio sobre la salud metabólica (figura 2), envejecimiento, sueño y muchos otros temas11.

Nuestro método sigue un inverso piramidal, el protocolo de entrenamiento de intervalo, que en gran medida incorpora aspectos del aeróbico intervalo entrenamiento (AIT) con alguna resistencia de entrenamiento del ejercicio. El régimen estándar de AIT se altera en este protocolo para aumentar gradualmente la duración de cada intervalo durante un período de cinco días para promover la resistencia. AIT ha sido particularmente útil en la prevención de MetS en comparación con otros métodos de intervención y fue más efectiva en la reversión de factores de riesgo comunes de síndrome metabólico de continuo ejercicio moderado19,20. Sin embargo, una desventaja de la TW en relación con la torre de la energía es que vuela más rápidamente habituarse al movimiento de rotación, así la variación en la tendencia innata a habituar entre las moscas puede complicar la interpretación de los beneficios del ejercicio. 11 una solución elegante a esta limitación es descrita por Watanabe y enigma15 y sus complementarios artículo21.

Protocol

1. rueda de configuración y operación

Nota: Ver figura 1 complementaria para esquemas en TW ejercicio de construcción de la máquina. Las piezas se enumeran en la Tabla de materiales. Las frases "TW", "Rueda", "máquina de ejercicio" y "la máquina" se usa indistintamente en el protocolo.

  1. Calibración del motor con interruptor de corriente tales que un período completo de rotación 15 s (4 rpm). Calibrar velocidad de rotación de la máquina antes de colocar la mosca viales en abrazaderas aseguradas atadas brazos giratorios.
    1. Ajustar la velocidad usando un cronómetro estándar y un objeto inmóvil temporalmente conectado a la máquina, como un pequeño pincel pegado a la tapa del motor con el pincel apenas tocando uno de los soportes giratorios. Tiempo el número de rotaciones en un minuto usando el objeto inmóvil como un punto de referencia y ajustar la velocidad para lograr un período rotatorio de s 15 (4 rpm).

2. mosca colección y mantenimiento

Nota: Todas moscas se mantienen en una incubadora de 25 ° C con 50% de humedad y un ciclo de luz/oscuridad de 12 h entre manipulaciones del benchtop que se describe a continuación. Moscas son alimentadas con una dieta de laboratorio estándar de harina de maíz-melaza a menos que se indique lo contrario.

  1. Preparar la colocación de cámaras para cada genotipo de interés utilizando placas de agar jugo de manzana, una gota de levadura pasta por placa y 6 onzas, botellas de plástico para recoger los huevos que eclosionan en larvas.
    1. Para preparar jugo de manzana las placas de agar, llenar platos de Petri de 35 x 10 mm ¾-completo con agar al 3% disuelto en jugo de manzana comprada. Almacenar placas solidificadas en un refrigerador hasta su uso.
    2. En un tubo de centrífuga cónico de 50 mL, combinar comprada levadura seca activa con agua destilada en una proporción de 2 mL de agua por cada gramo de levadura. Mezcla la levadura con agua para crear una pasta con la consistencia de la salsa de tomate usando un vidrio varilla de agitación. Ajustar proporciones de levadura y agua según sea necesario para lograr la consistencia deseada.
    3. Guarde la pasta de levadura en el frigorífico entre aplicaciones. Mantenga la tapa del tubo floja para permitir que el gasear.
    4. Utilizar una aguja o cuchillo para perforar pequeños agujeros en 6 onzas botellas Plaza de fondo (polipropileno) como los orificios de ventilación de las cámaras de colocación.
    5. Frote una pequeña mancha de pasta de levadura (~ 3 mm de diámetro) en cada placa de agar jugo de manzana.
  2. Lugar de moscas adultas del genotipo deseado en la botella de 6 oz y la botella de tapa con la placa de agar jugo de manzana. Fije la placa a la botella con bandas de goma. Invierta y coloque en una incubadora para permitir que los adultos ponen huevos.
  3. Cambiar las placas de agar jugo de manzana en una cámara de puesta dos veces al día (mañana y noche). Licencia utilizada placas en la incubadora para otro 12 – 24 h permitir que el primer instar las larvas al eclosionar.
  4. Recoger primero instar las larvas con un fino pincel o colección pick (aguja fina flexible unido a un mango). Lugar 50 primer instar larvas de un genotipo específico en un frasco de comida del tipo de comidas experimentales a desarrollar y metamorfosis completa, mientras que el ubicado en la incubadora (figura 2A).
  5. Recoger a los adultos para el tratamiento de ejercicio (figura 2A).
    1. Pupación, recolectar pupas con un pincel pequeño y húmedo y colocar en frascos vacíos antes de la eclosión para evitar moscas adultas de exponerse a la dieta larvaria.
    2. Transferencia de moscas adultas a frascos de comida de dieta estándar de laboratorio como eclose. Uno a cinco días después de la eclosión, separar moscas basadas en el sexo.
  6. Designado mitad de los adultos recolectados cada a experimental y grupos de control. Mantener moscas en viales de dieta estándar de laboratorio a una concentración de 50 moscas por frasco.
  7. Transferencia de adultos a frascos de alimento fresco cada dos días para evitar quedarse atascados durante el ejercicio. Añadir varios granos de levadura vivo suplementario a la nueva comida inmediatamente antes de introducir las moscas.
    Nota: Si bien es posible mantener moscas sin un suplemento de levadura viva, hemos encontrado que las moscas adultas realizan mejor con la suplementación. La suplementación de levadura viva es una variable que podría ser modificada para adaptarse a objetivos experimentales del investigador.

3. Protocolo del ejercicio

  1. En el primer día del ejercicio (día 1), frasco de empuje tapones para dejar 1 cm de espacio en las ampollas de control y 6 cm de espacio entre la alimentación y el enchufe en viales de ejercicio (figura 1).
    Nota: Los frascos de control habrá un espacio limitado para moscas para moverse mientras que en la máquina de ejercicio y así vuela participarán en mucho menos movimiento que en ejercicio de viales.
  2. Colocar los frascos en las pinzas y luego darle las moscas 10 min para aclimatar en la máquina (figura 1B).
    Nota: Un control alternativo es mantener las moscas unexercised en la mesa adyacente a la máquina de ejercicio con 6 cm de espacio (en frasco) para mover normalmente. Se han encontrado11resultados similares de ejercicio en relación con el "1 cm en la rueda" y los controles "a 6 cm sobre la mesa".
  3. Tratar tanto control y ejercicio vuela a la rotación de la máquina a temperatura constante durante 5 días consecutivos por semana con alternancia de períodos de rotación y el resto (figura 1D).
    Nota: Se necesita una temperatura constante para evitar los efectos de confusión de la temperatura en los niveles de actividad. Para estudios de manipulación de temperatura, coloque el TW dentro de una incubadora para modificar tratamientos de temperatura durante el entrenamiento.
    1. Funcionar la máquina de cuatro episodios de 15 minutos de ejercicio el día 1. Alternan estas peleas con períodos de descanso de 5 minutos.
    2. Cada uno de los siguientes días, añadir 5 minutos de ejercicio a uno de los episodios de ejercicio preexistente. Por ejemplo, el día 2, hacer el primer combate de ejercicio 20 minutos de largo, pero mantienen el resto de los combates a 15 minutos de largo.
    3. El día 3, ejercicio vuela durante 20 minutos durante los dos primeros episodios y 15 min para los siguientes dos episodios.
    4. En el día 4, 20 min de uso ejercicio peleas para todos excepto la pelea final, que debe ser sólo 15 minutos de largo.
    5. En el día 5, mantener todos los combates de ejercicio 20 minutos de largo.
      Nota: Durante los períodos de descanso, los frascos de las moscas deben permanecer firmemente afianzada con abrazadera en el TW. La orientación de los frascos durante estos períodos no es relevante porque la fuerza gravitacional experimentada por todas moscas provendrán de la misma dirección.
  4. Después de completar el ejercicio tratamiento para un día volver los alimentos vial tapones a sus posiciones normales y vuelta vuela sus incubadoras hasta el día siguiente.
  5. Después de la terminación del régimen de ejercicio completo, anestesiar a moscas utilizando métodos de anestesia estándar MOSCA CO2 . Entonces transferencia vuela a nuevos alimentos viales o tubos de microcentrífuga para la evaluación de características fenotípicas de interés.
    Nota: Fenotipos del ejemplo incluyen escalada capacidad (frasco de alimento), almacenamiento de triglicéridos (tubo de microcentrífuga) o expresión génica (tubo de microcentrífuga). El protocolo puede hacer una pausa aquí con las muestras almacenadas apropiadamente dependiendo de las evaluaciones a realizar. Ensayos, que estar moscas deberá realizarse puntualmente conforme a los objetivos específicos de la prueba fenotípica.

4. evaluación de escalada

  1. Después de un día de descanso tras la finalización del Protocolo de ejercicio, prueba general mosca escalada desempeño usando una geotaxis negativa iterativo rápido (anillo)-como geotaxis negativa escalada ensayo22.
    1. Colocar grupos de 10 moscas en frascos vacíos con CO2 anestesia (o tapping directamente en frascos de comida si ya ordenados) y sellar con la película de parafina para evitar que las moscas escapan. Dar la vuela al menos 10 min para aclimatarse al nuevo vial. Para evitar que los frascos de vuelco, pegue un círculo de cartulina ~ 5 cm de diámetro en el fondo del frasco para proporcionar más superficie.
      Nota: Enchufes de Vial no deberían utilizarse porque impiden parte del frasco para determinar altura de escalado.
    2. Colocar frascos 20 cm delante de una cuadrícula de 1 cm x 1 cm a la vista de una cámara estacionaria montada con un contador de tiempo incorporado (un teléfono inteligente con un temporizador cámara aplicación funciona bien).
    3. Golpear los frascos suavemente el contador tres veces para golpear todas las moscas hasta el fondo del frasco. Después de golpear ligeramente el frasco por tercera vez, inmediatamente iniciar el temporizador de cámara de s 4 para capturar una imagen para determinar la altura ascendida por cada mosca.
      Nota: Tapping debe realizarse a una intensidad constante y por el mismo investigador en cada cambio de ejercicio de control para minimizar la variación en las respuestas de las moscas debido a golpecitos.
    4. Repita el paso 4.1.3 dos veces, con al menos 1 min descanso entre ensayos, para producir un total de tres pruebas por vial.
  2. Para conservar las moscas para otros análisis, inmediatamente después de finalizado el ensayo escalado, flash congele las moscas por inmersión en nitrógeno líquido.
    1. Puede utilizarse un matraz dewar poco profundas, abrir-rematado llenado de nitrógeno líquido a una profundidad de ~ 5 cm.
    2. Moscas de transferencia a tubos de microcentrífuga pequeña CO2 anestesia y luego colocar tubos en el frasco de dewar con nitrógeno líquido. Alternativamente, si futuros análisis requieren evitación de CO2, snap congelar las moscas directamente en sus viales escaladas golpeando suavemente vuela a la parte inferior de su frasco mientras que la parte inferior se sumerge en nitrógeno líquido y luego se transfieren las moscas congeladas a tubos de microcentrífuga con unas pinzas.
      Nota: Nitrógeno líquido es criogénico y debe usarse únicamente con ventilación adecuada de equipos y sala de protección.
  3. Process imágenes con la herramienta de selección de múltiples puntos de23 ImageJ.
    1. Abrir una imagen en la gestión de ImageJ.
    2. Establecer una escala de 1 cm en el papel de rejilla de fondo para calcular la distancia por cada mosca individual base. Utilice la "herramienta de línea" de la barra de herramientas a un lado del rastro de un cuadrado de 1 cm2 del papel de rejilla de fondo. Haga clic en la pestaña de "Analizar" y seleccione "Establecer escala". Ajuste la "distancia conocida" como '1.00' y «Unidad de longitud» como 'cm', asegúrese de que "Global" está desactivada y haga clic en "Aceptar".
    3. Seleccione el icono de "Selección de múltiples puntos" en la barra de herramientas y ampliar en la parte inferior de la cubeta en la imagen. Establecer el primer punto como la parte inferior del frasco haciendo clic en la parte inferior del frasco.
    4. Haga clic en el centro de cada mosca en el frasco para marcar como un punto de datos. Tenga en cuenta que hay un total de 11 puntos por vial, marcando la parte inferior de la cubeta y para cada vuelo.
    5. Haga clic en la pestaña de "Analizar" y seleccione "Medida" para generar una tabla de valores medidos. Guardar la tabla como un archivo csv.
    6. Abra el archivo csv en un programa de hoja de cálculo y calcular la distancia exacta subida por cada mosca restando los valores de los puntos 2-11 del punto 1 de la tabla de valores medidos.
    7. Repita los pasos del 4.3.1 a través 4.3.6 para cada imagen.

5. triglicéridos almacenamiento ensayo

Nota: Las muestras, normas, solución estándar de glicerol y solución de trabajo de triglycerol utilizados en el ensayo se deben tener en el hielo para la duración del protocolo y deben almacenarse en el refrigerador cuando no esté en uso.

  1. Preparar estándares usando la solución estándar de glicerol.
    1. Hacer el espacio en blanco (B) agregando 1000 μl de buffer de homogenización a un tubo de microcentrífuga con la etiqueta B.
    2. Hacer estándar 1 (S1), 2,5 mg/mL por pozo, agregando 1000 μl de la solución estándar de glicerol a un tubo de microcentrífuga etiquetado S1.
    3. Hacer estándar 2 (S2), 1,25 mg/mL por pocillo, Añadir 500 μl de la solución estándar de glicerol a 500 μl del diH2O en un tubo de microcentrífuga etiquetado S2.
    4. Hacer estándar 3 (S3), 0,625 mg/mL por pozo, mediante la adición de 250 μl de la solución estándar de glicerol a 750 μl de diH2O en un tubo de microcentrífuga etiquetado S3.
    5. Hacer estándar 4 (S4), 0,3125 mg/mL por pozo, añadiendo 125 μl de la solución estándar de glicerol a 875 μl de diH20 en un tubo de microcentrífuga etiquetado S4.
  2. Preparar solución de trabajo de triglycerol desde el Kit de determinación de triglicérido de suero.
    1. Añadir 40 mL de diH2O el reactivo de glicerol libre del kit y mezclar invirtiendo la botella.
    2. Añadir 10 mL de diH2O a la solución de triglicéridos del kit y mezclar invirtiendo la botella.
    3. Solución de reactivo y triglicéridos de glicerol de combinar y mezclar por inversión para preparar la solución de trabajo de triglycerol.
      Nota: La solución de trabajo de triglycerol es válida por 60 días y podrá realizar cuatro ensayos de placa de 96 pocillos por kit mediante el protocolo siguiente. Los volúmenes utilizados se redujo proporcionalmente del kit oficial de determinación de triglicérido de suero para su uso en el formato de la placa de 96 pocillos.
  3. Verificar en blanco y estándares mediante pipeteo cuidadosamente 5 μl de cada norma en un plano de 96 pozos fondo claro microplacas en triplicado (o cuadruplicado para el espacio en blanco).
    1. Añadir exactamente 125 μl de solución de Triglycerol a cada bien que contenga un estándar. Permiten soluciones reaccionar durante 30 minutos.
    2. Coloque una placa de 96 pocillos en un espectrofotómetro y leer la absorbancia a 540 nm. Uso de las mediciones de absorbancia para crear una curva estándar y verificar la exactitud de las normas al evaluar el valor de R2 . Si R2 para los estándares es inferior a 0,98, volver a preparar más cuidadosamente las normas.
  4. Comenzar el día 1 del ensayo para triglicéridos almacenamiento14 usando tubos de microcentrífuga con 10 congelados moscas cada uno.
    Nota: Una pipeta de repetición o de varios canal no debe usarse nunca en este paso porque las cantidades de cada reactivo utilizado en el ensayo deben ser muy precisa y constante para obtener resultados reproducibles. En nuestra experiencia, pipetas de repetición y varios canales no tienen este grado de precisión y consistencia. Cada alícuota de una pipeta monocanal puede confirmarse visualmente por el experimentador para control de calidad y cualquier sesgos de específicos de pipeta monocanal serán experimentados por todas las muestras en el mismo grado.
    1. Preparar un stock de 200 mL de Buffer de homogenización mediante la combinación 0,272 g de KH2PO4, 400 μL de EDTA de 0,5 M y mL 199,6 de diH2O en una botella de vidrio.
    2. Añadir exactamente 100 μl de buffer de homogenización a cada uno de los 40 tubos de microcentrífuga con 10 adultos congelados después de la prueba de escalada. Luego, centrifugar las muestras durante 30 s a 18.000 g.
    3. Rutina de moscas utilizando un molino motorizado y maja (u otra forma de homogeneización de tejido) para preparar una solución lechosa. Asegúrese de que un mortero fresco se utiliza para cada muestra. Luego, centrifugar las muestras durante 2 min a 18.000 g.
    4. Pipetee sólo el top 75 μl de sobrenadante de cada tubo en nuevos tubos de microcentrífuga. Asegúrese de que ningún bit fly de la pelotilla es transferido a través. Colocar tubos de nuevo en el refrigerador durante la noche.
  5. Comenzar el día 2 del Protocolo de triglicéridos mediante la eliminación de las muestras del día 1 de la nevera.
    Nota: Paso 5.5 puede realizarse el mismo día que el 5.4 pero hemos encontrado la señal para la concentración de triglicéridos sea más robusto después de una noche en el refrigerador. Sin embargo, el tiempo entre los pasos 5.4 y 5.5 no debe exceder de 36 h.
    1. (Opcional) Vórtice del primer tubo con líquido sobrenadante para 10 s y pipeta de 5 μL en un tubo de microcentrífuga limpio. Agregar 95 μl de NaCl 0,15 M en el nuevo tubo de microcentrífuga. Almacenar estas submuestras en el congelador de-20 ° C para un posterior análisis de proteína si se desea.
      Nota: Estas muestras del sobrenadante con la solución de NaCl agregada pueden utilizarse para determinar el contenido de proteína usando análisis preferido del investigador. Utilizamos el método de Bradford24. El contenido de proteína es una forma de estandarizar la medida del contenido de triglicéridos, pero el investigador también debe ser cauteloso en la interpretación de esas relaciones desde ejercicio y dieta también puede afectar el almacenamiento de proteínas.
    2. Para los frascos originales de sobrenadante, vórtice del primer tubo con líquido sobrenadante por 10 s, después la pipeta de 5 μL en dos pocillos distintos de una microplaca de 96 pozos para producir técnicos Replica. Asegúrese de nota que pozos se utilizan para cada muestra. Repita este paso para los 39 tubos.
    3. Pipetear exactamente 5 μl del espacio en blanco en cuatro pozos de la microplaca, y para los pozos restantes, pipetear exactamente 5 μl de cada estándar por triplicado.
    4. Añadir solución de trabajo de triglycerol exactamente 125 μl a cada pocillo y deje que la solución reaccionar durante 30 minutos.
    5. Colocar la placa de 96 pocillos en un espectrofotómetro y leer la absorbancia a 540 nm.
    6. Convertir valores de absorbancia en concentración (mg/mL) usando la curva estándar calculada a partir de las normas.

Representative Results

Estamos especialmente interesados en la identificación de los factores que contribuyen a la salud global metabólica de un individuo. Anteriormente se encontró que las interacciones genotipo por dieta contribuyen sustancialmente a la variación de nivel de población en rasgos metabólicos14. Esto significa que cada genotipo responde a las diferencias ambientales de una manera única y compleja. Para extender nuestro trabajo sobre los efectos del genotipo por ambiente para incluir ejercicio físico, se desarrolló la rueda, que es capaz de exponer la gran cantidad de genotipos aeróbico intervalo entrenamiento (AIT) en forma de alto rendimiento.

Para establecer si el ejercicio en el TW influenciado rasgos metabólicos, medimos el almacenamiento de triglicéridos en Oregon-R (OreR) y y1w1 moscas, moscas comunes de tipo salvaje (figura 2B – C) y normalizado los valores contra las moscas concentración de la proteína, tal como se informó en Méndez et al. 11. analizamos los datos por análisis multivariado de varianza (MANOVA) contabilidad para genotipo, sexo, ejercicio de tratamiento (y sus interacciones), y efectos de bloque experimental como tiempo repeticiones y alimentos vial y encontraron que había una significativa interacción genotipo por ejercicio (p = 0,0017) que afectan el almacenamiento de triglicéridos. Hubo un efecto significativo de dimorfismo sexual entre machos y hembras, con machos almacenar triglicéridos más que las hembras (p < 0.0001). Vimos que en las hembras, ejercitadas moscas tenían niveles de triglicéridos significativamente más bajos que sus contrapartes de unexercised (figura 2B, p < 0.0001). En los varones, mientras que la disminución en el almacenamiento de triglicéridos observada en Oregon-R ejercitó moscas (en comparación con los controles) no fue estadísticamente significativa, se observó una diferencia significativa en el almacenamiento de triglicéridos entre las dos líneas separadas (figura 2C, p < 0.0001). Tenga en cuenta que mientras que la normalización de la concentración de triglicéridos contra la concentración de proteína proporciona visión general mosca cuerpo relaciones de composición, comparación de la concentración de triglicéridos o proteína directa entre los diferentes grupos de moscas también puede proporcionar información específica sobre el efecto del ejercicio en estos fenotipos individualmente.

Ya que variables como ejercicio de adultos, sexo, genotipo han demostrado afectar el almacenamiento de triglicéridos, se esperaba que estos factores también afectan otros fenotipos e interactúan con dieta. Nos planteamos las larvas de un tipo salvaje representante Drosophila genética Panel de referencia línea (DGRP 153)25 en un alto grado en grasas o un dieta normal y ejercicio inducido en moscas adultas durante una semana (figura 2A). Posteriormente, se realizó un ensayo de anillo geotaxis negativa para medir capacidad. Los análisis de escalada utilizados difieren de un ensayo de anillo estándar; en lugar de un aparato de anillo, frascos con película de parafina que cubre las aberturas fueron utilizados para moscas domésticas durante el ensayo. Otros aspectos del ensayo de anillo original, como el tiempo entre la golpeando las moscas hasta el fondo del frasco y la foto, fueron retenidas22.

Todos los tratamientos se repitieron tres veces separadas con un mínimo de 59 moscas individuales por tratamiento y repetición del tiempo. Los datos fueron analizados por contabilidad de MANOVA para dieta, genotipo, sexo, ejercicio tratamiento (y sus interacciones), así como efectos de bloque experimental del tiempo de repetición, análisis vial y vial ensayo repetición. Encontramos que las hembras ejercitadas subieron significativamente superior (p < 0.005) cuando se crían en la dieta alta en grasas que cualquiera de los otros tratamientos femeninos (figura 2D). Para los varones, se observó que sólo ejercicio mejorado escalada cuando los hombres fueron levantados en la dieta normal, y los criados en la dieta alta en grasas no mostró cambios significativos (figura 2E). También se encontró efecto significativo dimorfismo sexual (p < 0.0001) en escalada con los varones suben más que las hembras. El sorprendente resultado de una disminución en el rendimiento después del ejercicio para las hembras de la línea 153 de la DGRP (figura 2D) para las mujeres que consumen una dieta normal que sube (p < 0.0001) es un ejemplo de cómo este tipo de ejercicio no puede ser un intervención uniformemente positiva para todos los genotipos y puede depender de otros factores ambientales. En Méndez et al. 11, hembras de cuatro otras líneas genéticas probadas para su rendimiento sube después de haber surgido en un normal dieta todos mostraron mayor capacidad con entrenamiento. Esto sugiere que la respuesta observada en 153 DGRP es genotipo específica y no una propiedad general del tratamiento de ejercicio TW. La variabilidad en la respuesta a través de sexo, dieta y ejercicio tratamiento grupos indica que hay interacciones significativas de sexo-por-dieta-por-ejercicio que afecta a la capacidad de la línea (p < 0.0001).

Tomados en conjunto, los resultados indican que el impacto del ejercicio sobre la salud metabólica de una mosca adulta puede ser una función de su sexo, genotipo y dieta larvaria. La variación fenotípica observada en respuesta a genotipos, variables de entorno (p. ej., dieta y ejercicio) y el sexo también observado en otros estudios11,12,14,15. Así, el TW y Drosophila pueden ser una estrategia poderosa para dilucidar los factores genéticos y ambientales que forma salud metabólica.

Figure 1
Figura 1 : Máquina de ejercicio de la rueda. (A) la máquina tiene 48 frascos y tiene una función de velocidad regulable. Aquí se realizaron experimentos a 4 rpm. (B) las moscas experimentales frascos individuales de alimentos fueron trabados en soportes colocados en un eje giratorio. Alimentación y (C) la distancia entre frasco tapón era 6 cm para los frascos del ejercicio y 1 cm para los frascos de control. Los frascos se colocan en la máquina para ejercicio. (D) el ejercicio de pirámide inversa 5 días régimen solía ejercer de moscas adultas. Cada día, otros cinco minutos ha sido añadido a uno de los combates del ejercicio a la rampa encima de la intensidad del ejercicio progresivamente, que modelos de resistencia, entrenamiento a intervalos. Esta figura ha sido modificada desde Mendez et al. 11. por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Métodos visuales y representativas resultados. (A) métodos de prueba de dieta larvaria y adulta ejercicio efectos de interacción. Las larvas fueron criadas en dieta de alta grasa o normal laboratorio y conectadas a la alimentación normal tras eclosión. Moscas adultas eran separados por sexo, coloca en grupos experimentales y durante cinco días consecutivos. Luego, se llevó a cabo una geotaxis negativa anillo escalada ensayo y moscas fueron congeladas para las mediciones de triglicéridos. Datos de triglicéridos representativos se muestran dos líneas genéticas, Oregon R y y1w1 para hombres (C) y (B). Todas moscas fueron criados en una dieta normal y ejercitados en la edad adulta. Niveles con diferentes letras son significativamente diferentes (p < 0,05) usando un post hoc estudiante t-pruebas. Esta figura contiene un subconjunto de datos que en Méndez et al. 11. se muestran datos representativos de escalada para línea 153 DGRP para hombres (E) y (D). Cada punto representa el rendimiento escalar promedio de 232 o más individuos a través de tres momentos independientes. Barras de error indican un error de estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Supplemental Figure 1
Suplementario Figura 1: un esquema detallado de la rueda. (A) diagrama de la estructura de abrazadera doble vial sirve para conectar los frascos a la máquina. (B) Vista Interior del sistema de arrastre rotacional de la máquina. (C) proyección paralela de cara frontal de la máquina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo de código suplementario: TreadWheel.skp Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discussion

El protocolo de ejercicio detallado aquí se ha demostrado para estimular con éxito el ejercicio suave en Drosophila y puede utilizarse para simular el ejercicio de resistencia en un laboratorio controlado ajuste11. Cabe señalar que inicialmente en el desarrollo del concepto de la rueda, se consideraron productos comerciales que pueden ser modificados para realizar del mismo modo (p. ej., un asador de laboratorio). Sin embargo, en última instancia, rechazamos este enfoque, elegir un diseño a la medida porque el equipo comercial no tenía suficientemente baja velocidad rotacional (rpm 4) y carecía de capacidad vial suficiente para la generación de alto rendimiento de muestra.

El propio protocolo TW puede ajustarse para abarcar una amplia gama de temas de investigación. Por ejemplo, ajuste de la frecuencia y duración de los regímenes de ejercicio de las moscas puede alterar las intensidades de los ejercicios que reciben. Al extender el protocolo más de una semana o a otros grupos de edad, es posible estudiar los efectos del ejercicio en el envejecimiento y diversas enfermedades relacionadas con la edad. Se recomienda que si se aplica un enfoque de ejercicio prolongado, entonces al menos un descanso a la semana debe añadirse para permitir la recuperación. Rendimiento y la mejora fue demostrado para ser mayor en los regímenes que incluyeron un día de recuperación que aquellos regímenes que utilizan consecutivo diario ejercicio12. También, advertimos contra ampliar la longitud de la pelea de ejercicio pasado 30 min desde habituación para el movimiento de rotación puede ocurrir después de largos períodos de continuo ejercen11. También hemos observado variaciones genéticas en la motivación de moscas para mantener sus niveles de actividad en el TW11. Así, si se desean más combates, considerar monitoreo de niveles de actividad de las moscas, presentada por Watanabe y enigma15,21 describe su modificación del concepto TW. Otros factores que podrían variar son temperatura y dormir-despierte los patrones, que se ha demostrado que también afectan los movimientos mosca26,27.

Hay una plétora de análisis disponibles durante y después de la terminación de protocolo para abordar los efectos del ejercicio en el nivel fisiológico, conductual y molecular, así como la posibilidad de desentrañar los efectos epigenéticos del ejercicio. Análisis metabólicos adicionales (p. ej., glucosa, glucógeno y proteínas), rendimiento cardiaco y respuesta inflamatoria medidas pueden utilizarse para profundizar en el ejercicio del efecto tiene en mosca cuerpo y fisiología composición12,14 ,24,28. Varios cambios de comportamiento asociados con la inducción de ejercicio, como cambios en el comportamiento, la actividad locomotriz y el sueño, la alimentación también pueden ser medidos utilizando herramientas como el CAFE ensayo29 actividad monitoreo dispositivos12,15 ,30. Cambios en la expresión génica y atribuido para el ejercicio de la respiración celular se pueden cuantificar utilizando métodos como qRT-PCR11 y respirometría31. Por último, Drosophila tienen valiosos recursos genéticos disponibles, tales como el Panel de referencia de Drosophila genética 2 y de los recursos de la población sintética de Drosophila que proporcionan a los investigadores la plataforma para realizar estudios genéticos cuantitativos25,32. Estas herramientas permiten experimentos de asignación, como asignación de estudios de Asociación de genoma completo y los Loci de rasgos cuantitativos, para identificar los loci candidatos asociados con dieta y ejercicio.

Estudios realizados utilizando la rueda demostraron que, en promedio, ejercicio disminuye el peso corporal, almacenamiento total de triglicéridos y glucógeno, contenido de proteína y rendimiento11de escalada. Además, hubo respuestas variables a ejercer a través de sexos y genotipos para peso corporal, así como los triglicéridos, proteínas, glucógeno, glucosa y actividad niveles11,15. Mientras que la variabilidad de la respuesta al ejercicio y la dieta a través de genotipos y el sexo puede ser difícil de interpretar y, a veces, contrario a la intuición, refleja las fuentes de variación real biológica observada en las poblaciones naturales. Nos esforzamos por entender la diversidad de factores subyacentes que contribuyen a los altos índices de MetS, herramientas que facilitan desenmarañar el papel relativo de los diversos factores que contribuyen analizando estos factores en organismos modelo será crucial para nuestra capacidad de desarrollar intervenciones de prevención y tratamiento personalizadas. Para evaluar plenamente la eficacia del ejercicio, cada uno de estos factores y cómo interactúan debe considerarse cuando la realización de experimentos y formular conclusiones.

El TW, como la mayoría de las otras máquinas mosca, está limitado en su capacidad para cuantificar el movimiento fly. Recientemente, Watanabe y enigma desarrollaron la rotación ejercicio cuantificación sistema (requisitos), una columna vertebral TW modificada con una actividad de control de unidad (LAM25H) del sistema de monitoreo de Drosophila serie15,21. Como el TW, este sistema utiliza el movimiento de rotación para inducir suavemente ejercicio mientras usa el brazo LAM25H rastrear y cuantificar la actividad de la mosca, pero tiene un menor número de viales (frascos de 32) que las TW15. Para estudios de ejercicio de alto rendimiento, si la cuantificación de la actividad no es necesario o deseado, el TW permite un mayor número de muestra. El diseño TW también podría ser modificado desde su forma actual para dar cabida a un mayor número de frascos. Este sistema, junto con otros métodos de ejercicio existentes, ayuda a establecer que el ejercicio no sólo es factible en Drosophila pero también puede ser estudiada para determinar el efecto de la actividad física en una variedad de respuestas fisiológicas y moleculares 11,12,15. Así, el TW, como un método de inducir ejercicio suave en moscas, puede utilizarse para una gran variedad de cuestiones biológicas.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Nos gustaría agradecer a Julie Jarnigan, Meredith Owens, Rachel Hill, Brandon Moye, Laura Mafla, Olivia Fish y el resto del laboratorio de Reed por su ayuda con la cría de mosca y procesamiento de imágenes. Sean Méndez construyó la rueda original con la ayuda de la tienda de máquina de la UAB. Financiamiento para este estudio fue proporcionado por NIH R01 GM 098856 LKR y creatividad grado y Academia de investigación de la Universidad de Alabama a KEL y BJW.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials for TreadWheel Construction:
Heavy Duty Vibration-Damping leveling Mount McMaster-Carr 60855K71 Quantity: 4
Stainless Steel Ball Bearing McMaster-Carr 57155K306 Quantity: 8
Plug-in Voltage Transformer (500MA, 120VAC input, 24 VAC output) McMaster-Carr 70235K16 Quantity: 1
Compact Square-Face DC Gear motor McMaster-Carr 6409K23 Quantity: 1
Tool Holder (clamps) McMaster-Carr 1723A22 Quantity: 5 (10x)
12L14 Carbon Steel Tight-Tolerance Rod McMaster-Carr 5227T24 Quantity: 1
Set Screw Shaft Collar McMaster-Carr 6432K13 Quantity: 8
Round-Belt Pulley McMaster-Carr 6284K51 Quantity: 5
Dart Controls – 25 Max RPM, Electric AC DC Motor McMaster-Carr 13DV 1A Quantity: 1
Materials for Fly Maintenace and Husbandry
6 oz Square Bottom Bottles (polypropylene) Genesee Scientific 32-130 Quantity: 1
35x10mm Petri Dishes VWR 82050-536 Quantity: 1
Narrow Drosophila vials Genesee Scientific 32-116 Quantity: 1
Flystuff Flypad Genesee Scientific 59-114 Quantity: 1
Blowgun, Mini Genesee Scientific 54-104 Quantity: 1
Materials for RING-like Assay:
ImageJ software NIH https://imagej.nih.gov/ij/ Quantity: 1
1 cM graph paper or drawn grid (at least 20 cM by 30 cM) various Quantity: 1
digital camera with timer or smart phone with camera timer app various Quantity: 1
Materials for Triglyceride Assay:
Dewar Flask VWR 14200-960 Quantity: 1
Serum Triglyceride Determination Kit Sigma Aldrich TRO100 Quantity: 1
Cordless Pestle Motor VWR 47747-370 Quantity: 1
Pestles VWR 47747-358 Quantity: 1

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References

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Genética número 136 ejercicio Drosophila aeróbico intervalo entrenamiento (AIT) síndrome metabólico obesidad almacenamiento de triglicéridos geotaxis negativa interacción genotipo por ambiente
La rueda: Protocolo de entrenamiento de intervalo para suavemente inducida por ejercicio en <em>Drosophila melanogaster</em>
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Lowman, K. E., Wyatt, B. J.,… More

Lowman, K. E., Wyatt, B. J., Cunneely, O. P., Reed, L. K. The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (136), e57788, doi:10.3791/57788 (2018).

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