Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

TreadWheel: Интервал подготовки протокола для нежно индуцированной упражнения в Drosophila melanogaster

Published: June 8, 2018 doi: 10.3791/57788
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of Alabama

Summary

TreadWheel использует вращательное движение нежно побудить упражнения в взрослых Drosophila melanogaster эксплуатируя мухи врожденный, негативные geotaxis. Это позволяет для анализа взаимодействия между упражнения и такие факторы, как генотип, секс и диеты и их воздействие на физиологические и молекулярные анализы оценить метаболически здоровье.

Abstract

Комплекс метаболических заболеваний возросло в результате широко переход к жизни увеличение потребления калорий и уровни пониженной активности. Эти многофакторных заболеваний обусловлены сочетанием генетических, экологические и поведенческие факторы. Один из таких сложных заболеваний является метаболически синдром (Мец), который является кластер метаболических расстройств, в том числе гипертонией, гипергликемией и абдоминальное ожирение. Упражнения и диетического вмешательства являются первичного лечения рекомендуется врачами для смягчения последствий ожирения и его последующее метаболических заболеваний. Осуществлять вмешательство, в частности аэробных интервал подготовки, стимулирует благоприятные изменения в общих факторов риска для сахарный диабет типа 2 (T2DM), сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) и других условий. С притоком доказательств описывая терапевтический эффект упражнения имеет на метаболические здравоохранения, создания системы, которая модели осуществлять в контролируемых условиях обеспечивает ценный инструмент для оценки последствий осуществления в контексте экспериментальных. Дрозофилы является отличным инструментом для изучения физиологических и молекулярных изменений, которые в результате осуществления вмешательства. Мухи имеют короткой продолжительности и аналогичные механизмы метаболизировать питательных веществ по сравнению с людьми. Чтобы побудить упражнения у дрозофилы, мы разработали машина называется TreadWheel, который использует мухи врожденное, негативные geotaxis тенденция нежно побудить восхождение. Это позволяет исследователям проводить эксперименты на большой когорты лучше понять взаимодействие генотип, окружающей среды, лежащие в основе воздействия упражнений на метаболические здоровья генетически разнообразны мух.

Introduction

Детство и взрослых ожирения растет эпидемий в культурах, которые потребляют высокой калорийности диеты и простаивать в течение продолжительных периодов времени, что может привести к серьезные долгосрочные последствия, включая сопротивление инсулина, хроническое воспаление и артроз 1 , 2 , 3 , 4. распространенность этих расстройств продолжает расти из-за растущего дисбаланса в калорийности и расходов обусловлено повышенным потреблением жиров и сахара и преимущественно сидячий образ жизни5. Соответственно этот дисбаланс энергии привела к увеличению числа случаев сахарный диабет типа 2 (T2DM) и сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ)5. Люди находятся на более высокий риск развития обоих расстройств, если они были диагностированы с расстройством метаболический синдром (Мец), чьи симптомы включают абдоминальное ожирение и дислипидемия2. Мец формируется сложного взаимодействия генотипа и различные экологические факторы, такие как диета и осуществлять6. Таким образом чтобы получить полное понимание основных механизмов этого сложного заболевания, все эти факторы должны рассматриваться.

Когда дело доходит до борьбы с Мец, врачи рекомендуют сначала, претерпевает изменения образа жизни, которые включают едят здоровую, хорошо сбалансированную диету и физической активности2,,78. Поскольку эффективные препараты ограничены и желудочного шунтирования является дорогостоящим и требует непрерывного медицинского контроля, фармакологические и хирургические вмешательства рекомендуется только для тяжелых случаях и только в сочетании с этими изменениями образа жизни3 ,,78. В то время как образ жизни мероприятий, таких как упражнения и диеты, создавать и поддерживать долгосрочные цели потери веса, ли эти меры по исправлению положения могут полностью смягчить негативные последствия, связанные с Мец требует дальнейшего изучения7, 8.

Мышь модели были использованы для изучения последствий осуществления метаболических заболеваний лет; Однако введение упражнения летать исследований на Мец является сравнительно недавно стремиться9,10,,1112. Мухи обеспечивают идеальный автомобиль для изучения упражнения в контролируемых лабораторных условиях, так как они легко манипулировать, имеют короткий срок действия, являются недорогой для поддержания и связанные с энергетикой метаболических высоко сохраняются между дрозофила и люди13. D. melanogaster геномов характеризуются хорошо, и есть богатство генетики инструменты доступны для использования в дрозофилы , который может обеспечить понимание различных генотипов и взаимодействия генотипа, окружающей среды, которые могут модулировать влияние физических упражнений на научные здоровье14.

Нынешние методы осуществления дрозофилы ссылаться на лету врожденное, негативные geotaxis тенденция, поведенческих инстинкт подниматься вверх, чтобы стимулировать восхождение в взрослых в пределах их корпуса11,12,15 . Башня власти, одним из методов стимулирования упражнения в мух, систематически повышает летать корпуса вертикально и затем падает их обратно к поверхности скамьи, эффективно стучать мух в нижней части флакона, таким образом вызывая их инстинктивная отрицательный geotaxis 12 , 16. эксперименты с помощью этой машины показали, что упражнения — это мощный защитный фактор против многих заболеваний, связанных с возрастом, в том числе CVD и T2DM и способствует здоровой старости12,17,18 . В частности они продемонстрировали, что упражнение может снизить начала возрастных мобильности снижение мух и повысить несколько связанных с возрастом симптомы, такие как сердечной деятельности и подчеркнуть ответ17,18. Однако управления мухи, никогда не помещается на башне, показали высокие восхождение баллы, чем те, которые испытывают машины, предполагая, что силы повторяющихся капель может быть ранив мух и затрагивающих мобильность12. Это свидетельствует о том, что альтернативный способ заставить упражнение, которое является менее сильный и избегает, причиняя физические травмы будет полезным, взаимодополняющих метода Power Tower протокола16.

Аккуратно побудить упражнения у дрозофилы, мы разработали осуществлять машины под названием TreadWheel (рис. 1). В (далее сокращенно TW) TreadWheel вращательное движение вызывает мух врожденное, негативные geotaxis тенденция, постоянно переосмысление гравитационного верхней части флаконов, который, в свою очередь, стимулирует восхождение в мух. В отличие от других методов вращательное движение TW изначально нежный, которая минимизирует количество дополнительных раздражители, которые могут возникнуть и влияют на результаты. Таким образом машина обеспечивает средства, чтобы побудить упражнения в большое количество мух не вызывая стресс, который позволит исследователей для изучения последствий осуществления метаболических здравоохранения (рис. 2), старение, сна и многие другие темы11.

Наш метод следует обратное пирамидальной, интервал подготовки протокола, который главным образом включает в себя аспекты аэробных интервал подготовки (AIT) с некоторыми выносливость осуществлять обучение. Стандартный режим МТА изменяется в этом протоколе постепенно увеличивать продолжительность каждого интервала в течение пяти дней для содействия выносливость. МТА был особенно полезным в предотвращении Мец по сравнению с другими методами вмешательства и был более эффективным в деле обращения вспять метаболический синдром общих факторов риска, чем непрерывное умеренные упражнения19,20. Однако недостаток TW относительно мощности башня, что летит быстрее приучать к вращая движение, таким образом различия в врожденная склонность к приучать среди мухи может усложнить толкование преимуществ упражнений. 11 элегантное решение это ограничение описано Ватанабэ и загадка15 и их дополнительной статьи21.

Protocol

1. TreadWheel Установка и эксплуатация

Примечание: Смотрите Дополнительные рисунок 1 для схемы на TW осуществлять строительные машины. Части, необходимые, перечислены в Таблице материалов. Фразы «TW», «TreadWheel», «тренажеры» и «машина» используются как взаимозаменяемые во всем протокол.

  1. Калибровку двигателя с помощью выключателя питания, таким образом, что период полного вращения составляет 15 s (4 мин). Калибровка скорости вращения машины перед укладкой летать флаконов в обеспеченных зажимы, придают для вращающихся оружия.
    1. Отрегулируйте скорость, используя стандартный секундомер и неподвижный объект временно прикомандировать к машине, как небольшой кистью, приклеенный к крышке двигателя с помощью кисти, просто Касаясь одного из вращающейся скобки. Время количество оборотов в минуту, используя неподвижный объект в качестве точки отсчета и отрегулировать скорость для достижения период вращения 15 s (4 мин).

2. летать коллекции и техническое обслуживание

Примечание: Все мухи поддерживаются в 25 ° C-инкубатор с влажностью 50% и 12 h свет/темно цикла между benchtop манипуляции, описанные ниже. Мухи являются откармливаются Стандартный кукурузной муки меласса лаборатории если не указано иное.

  1. Подготовьте кладки камер для каждого генотипа интерес, используя плиты агара яблочный сок, падение дрожжей пасты на пластину, и 6 oz. пластиковые бутылки собирать яйца, которые будут люк в личинок.
    1. Готовить яблочный сок плиты агара, залейте 3% агар 35 мм x 10 мм Петри ¾-полный растворенных в магазин купил яблочный сок. Храните затвердевших пластины в холодильник до использования.
    2. В 50 мл конические пластиковых пробирок объединить покупное активных сухих дрожжей с дистиллированной водой в соотношении 2 мл воды для каждого грамм дрожжей. Дрожжи в смесь с водой, чтобы создать пасты с консистенцией кетчуп с использованием стекла помешивая стержня. Отрегулируйте пропорции дрожжей и воды, необходимы для достижения желаемой консистенции.
    3. Хранить дрожжи вставить в холодильник между использованиями. Держите крышку трубки свободно, чтобы позволить дегазации.
    4. Используйте острые иглы или нож пробивать небольшие отверстия в 6 oz. площади дна бутылок (полипропилен) как вентиляционные отверстия для укладки камер.
    5. Тыкать небольшое пятно дрожжей пасты (~ 3 мм в диаметре) на каждой пластине агар яблочный сок.
  2. Место взрослых мух желаемого генотипа в 6 oz. бутылка и крышка бутылка с пластиной агар яблочный сок. Закрепите пластину к бутылке с резинками. Инвертировать и место в инкубаторе разрешить взрослых откладывают яйца.
  3. Изменить плиты агара яблочный сок на камере укладка два раза в день (утром и вечером). Отпуск используются пластины в инкубаторе для другого 12 – 24 h разрешить первый Инстар личинки люк.
  4. Сбор первых Инстар личинки, с помощью тонкой кисточки или коллекции забрать (гибкие тонкой иглой придает ручкой). Место 50 первых Инстар личинки конкретный генотип на питание флакон желаемый экспериментальной питания типа разработать и завершить метаморфозы в то время как в инкубатор (рисA).
  5. Собирайте взрослых для осуществления лечения (рисA).
    1. Окукливание собирать куколки с небольшой, влажной кистью и место в пустые флаконы до eclosion чтобы предотвратить подвергается личиночной рацион взрослых мух.
    2. Передавать взрослых мух продовольствия флаконов стандартных лабораторных диета как они Эклоз. Один-пять дней после eclosion, отделить мухи по признаку пола.
  6. Назначают половину собранных взрослых каждой экспериментальной и контрольными группами. Поддерживать мух в флаконах стандартных лабораторных диета в концентрации 50 мух на флакон.
  7. Передавать взрослых свежих продуктов флаконов каждые два дня для предотвращения их от застревания во время физических упражнений. Добавьте несколько зерен дополнительного живых дрожжей в новой пищи непосредственно перед представляя мух.
    Примечание: Хотя это возможность поддерживать мух без дополнения живых дрожжей, мы обнаружили, что взрослых мух работать лучше с добавками. Живые дрожжи добавки — переменная, которая может быть изменена с учетом исследователя экспериментальных целей.

3. осуществлять протокол

  1. В первый день упражнения (1 день) толкать флакон вилки оставить 1 места во флаконах управления и 6 см пространства между продовольственной и вилку в упражнения флаконов (рис. 1 c).
    Примечание: Флаконы управления будет иметь ограниченное пространство для мух для перемещения на тренажер и таким образом мух будет заниматься гораздо меньше движение чем во флаконах упражнения.
  2. Флаконов в зажимы и затем дать мух 10 мин, чтобы акклиматизироваться на машине (рис. 1Б).
    Примечание: Альтернативного управления заключается в поддержании неосуществленный мух на benchtop рядом тренажер с 6 см пространства (во флаконе) для перемещения обычно. Аналогичные результаты по сравнению с «1 см на TreadWheel» и «6 см на benchtop» управления нашли11.
  3. Лечить оба управления и осуществлять мух для ротации на машине при постоянной температуре 5 дней подряд в неделю с чередующимися приступы вращения и отдыха (рис. 1D).
    Примечание: Чтобы избежать накладывающееся воздействие температуры на уровнях деятельности необходима постоянная температура. Для температуры манипуляции исследований место TW внутри инкубатором для изменения температуры лечения во время тренировки упражнения.
    1. Запустите машину для четырех 15 мин схватки упражнения на 1 день. Чередовать эти приступы с периодами отдыха, 5 мин.
    2. Каждый из следующих дней, добавить 5 минут физических упражнений в один из существующих приступы упражнения. Например на 2 день, сделать первый бой упражнения 20 мин долго, но сохранить остальные поединки на 15 мин.
    3. На 3 день осуществлять мухи на 20 мин в ходе двух первых схватках и 15 минут для следующих двух схватках.
    4. На 4 день используйте 20 мин схватки упражнения для всех за исключением окончательного бой, который должен быть только 15 мин.
    5. На 5 день держите все упражнения приступы 20 мин.
      Примечание: Во время периодов отдыха, флаконы, содержащие мухи должны оставаться надежно зажимается на TW. Ориентация флаконов в эти периоды не важна, потому что гравитационной силы, сталкиваются все мухи будут приходить с того же направления.
  4. После завершения лечения упражнения на данный день, вернуть их нормальных флакон вилки питания и вернуть их инкубаторы мух до следующего дня.
  5. После завершения полного осуществления режима анестезировать мух с помощью стандартных летать CO2 методы анестезии. Затем перенесите мух новой пищи ампул или microcentrifuge трубы для оценки фенотипические характеристики интерес.
    Примечание: Пример фенотипов включают лазание способность (еда флаконе), триглицеридов хранения (пробки microcentrifuge) или экспрессии генов (пробки microcentrifuge). Протокол может быть приостановлена здесь с образцами хранятся надлежащим образом, в зависимости от оценки должны быть выполнены. Анализов, с участием живых мух нужно будет проводиться оперативно в соответствии с конкретными целями фенотипического анализа.

4. восхождение оценки

  1. После одного дня отдыха после завершения осуществления протокола, тест общего летать, восхождение производительности с помощью быстрого итеративного негативные geotaxis (кольцо)-как отрицательный geotaxis восхождение пробирного22.
    1. Место группы 10 мух в пустые флаконы с использованием CO2 анестезии (или нажатие непосредственно из флаконов пищи, если уже отсортированы) и печать с парафином пленкой для предотвращения побега мух. Дать мух по крайней мере 10 минут, чтобы акклиматизироваться к новый флакон. Чтобы предотвратить флаконы от опрокидывания, лента ~ 5 см диаметр cardstock круг в нижней части флакона предоставлять дополнительную площадь.
      Примечание: Флакон вилки не должны использоваться потому, что они препятствуют части флакона, используемый для определения высоты поднялся.
    2. Место флаконы 20 см перед сетке 1 см x 1 см в полном представлении навесные, стационарные камеры со встроенным таймером (смарт-телефон с таймер камеры приложения хорошо работает).
    3. Аккуратно нажмите флаконов на счетчик три раза, чтобы выбить всех мух до нижней части флакона. После прослушивания флакон вниз третий раз, сразу же начать 4 s таймер камеры для захвата изображения для определения высоты, взобрался на каждом летать.
      Примечание: Нажатие должно быть сделано в постоянной интенсивности и исследователем же в каждом осуществлять контроль контрастности для сведения к минимуму различия в ответах летит из-за разговоров.
    4. Повторите шаг 4.1.3 дважды, с по крайней мере 1 мин отдыха между испытаниями, производить в общей сложности три испытания на флакон.
  2. Для сохранения мух для других анализов, сразу после завершения восхождение assay, вспышки заморозить мух методом погружения в жидком азоте.
    1. Используйте мелкие, открытым верхом Дьюара, заполнены на глубине ~ 5 см с жидким азотом.
    2. Передача мух для малых microcentrifuge трубы с использованием CO2 анестезии и затем поместите трубки в Дьюара с жидким азотом. В качестве альтернативы если будущие анализы требуют предотвращения CO2, оснастки заморозить мух прямо в их восхождение флаконов, осторожно нажав мух в нижней части их флакон нижней погружен в жидком азоте, а затем передать замороженных мух для Microcentrifuge трубы с помощью щипцов.
      Примечание: Жидкий азот криогенных и должен использоваться только с надлежащего защитного оборудования и обслуживание вентиляции.
  3. Обработка изображений с помощью ImageJ23 многоточечный инструмент «Выделение».
    1. Откройте изображение для обработки в пределах ImageJ.
    2. Задание масштаба 1 см, основанный на фоновой бумаге сетки для вычисления расстояния, поднялся по каждой индивидуальной летать. Инструмент «Линия» на панели инструментов в одну сторону на 1 см2 площади трассировки от фона сетки бумаги. Нажмите на вкладку «Анализировать» и выберите «Задать шкалу». Установите «Известный расстояние» как «1.00» и «Единица длины» как «см», убедитесь, что «Глобальный» снят и нажмите кнопку «ОК».
    3. Выберите значок «Выбор нескольких точек» на панели инструментов и увеличение на нижней части флакона в изображении. Задайте первую точку как самой нижней части флакона, нажав на самой низкой части флакона.
    4. Нажмите на центр каждого fly в пузырек, чтобы пометить его как точки данных. Принять к сведению, что есть в общей сложности 11 очков за флакон, маркировка в нижней части флакона один и один для каждого летать.
    5. Нажмите на вкладку «Анализировать» и выберите «Мера» для создания таблицы измеренных значений. Сохраните таблицу в виде файла csv.
    6. Откройте CSV-файл в программе электронных таблиц и вычислить точное расстояние, поднялся по каждой мухи путем вычитания y значений пунктов 2-11 от точки 1 в таблице измерений.
    7. Повторите шаги 4.3.1 через 4.3.6 для каждого изображения.

5. триглицеридов хранения Assay

Примечание: Образцы, стандарты, стандартный раствор глицерина и triglycerol рабочего раствора используется во всем assay должны храниться на льду в течение протокола и должен храниться в холодильнике когда не в пользе.

  1. Подготовка стандартов с использованием глицерол стандартным решением.
    1. Сделать пустой (B) путем добавления 1000 мкл буфера гомогенизации microcentrifuge трубки помечены б.
    2. Сделайте Стандартный 1 (S1), 2,5 мг/мл в колодец, путем добавления 1000 мкл стандартного раствора глицерина microcentrifuge трубки помечены S1.
    3. Сделайте Стандартный 2 (S2), 1,25 мг/мл в колодец, путем добавления 500 мкл стандартного раствора глицерина 500 мкл diH2O в microcentrifuge трубки помечены S2.
    4. Сделайте стандартный 3 (S3), 0,625 мг/мл в колодец, путем добавления 250 мкл стандартного раствора глицерина 750 мкл diH2O в microcentrifuge трубки помечены S3.
    5. Сделайте Стандартный 4 (S4), 0.3125 мг/мл в колодец, путем добавления 125 мкл стандартного раствора глицерина 875 мкл diH20 в трубке microcentrifuge помечены S4.
  2. Подготовка triglycerol рабочий раствор из комплекта определение триглицеридов сыворотки.
    1. Добавить 40 мл diH2O реагент свободного глицерина из комплекта и перемешать путем переворачивать бутылку.
    2. Добавьте 10 мл diH2O триглицеридов решение из комплекта и смешивать, переворачивать бутылку.
    3. Объединить реагента и триглицеридов раствор глицерина и смешивать, инвертирование подготовить рабочий раствор triglycerol.
      Примечание: Рабочий раствор triglycerol хорошо в течение 60 дней и может завершить четыре пластины 96-луночных анализов за комплект, с помощью протокола ниже. Томах, используемых масштабируются пропорционально от официального определения триглицеридов сыворотки комплект для использования в формате 96-луночных пластины.
  3. Проверьте пустой и стандартов, тщательно закупорить 5 мкл каждого стандарта в 96-луночных с плоским дном, ясно Гонав в трех экземплярах (или составленном для пустой).
    1. Мкл ровно 125 Triglycerol работы решения для каждой хорошо содержащих стандартом. Разрешить решения реагировать на 30 мин.
    2. 96-луночных пластины в спектрофотометр и читать поглощения на 540 Нм. Использование измерений оптической плотности для создания стандартной кривой и проверки точности стандартов вычисляя значение R2 . Если R2 для стандартов является менее 0,98, заново, более тщательно Подготовьте стандарты.
  4. Начать день 1 из assay для триглицеридов хранения14 с помощью microcentrifuge пробирки, содержащие 10 замороженные летает каждый.
    Примечание: Повторить или многоканальные пипетки следует никогда не использоваться в этот шаг потому, что количество каждого реагент, используемый в assay должны быть очень точной и последовательной, чтобы получить воспроизводимые результаты. По нашему опыту повторить и многоканальные пипетки не имеют этой степени точности и последовательности. Каждый Алиготе от одноканальный дозатор может быть визуально подтверждена экспериментатор для контроля качества и любой Одноканальные Пипетки конкретных предубеждения будут испытывать все образцы в такой же степени.
    1. Подготовка 200 мл бульона гомогенизации буфера путем объединения 0,272 г х2PO4, 400 мкл ЭДТА 0,5 М и 199,6 мл diH2O в стеклянной бутылке.
    2. Добавьте ровно 100 мкл буфера гомогенизации в каждой из 40 microcentrifuge пробирки, содержащие 10 взрослых заморожены после восхождения assay. Затем, Центрифугуйте образцы для 30 s на 18,000 g.
    3. Молоть мух с помощью моторизованных точильщика и пестик (или другой формы ткани гомогенизации) приготовить молочный раствор. Убедитесь, что свежий пестик используется для каждого образца. Затем Центрифугуйте образцы на 2 мин на 18,000 g.
    4. Пипетка только топ 75 мкл супернатанта жидкости из пробирки в новые microcentrifuge трубы. Убедитесь, что не летать биты из гранул, передаются. Поместите новые трубы в холодильник на ночь.
  5. Начать день 2 из триглицеридов протокола путем удаления образцов 1 день из холодильника.
    Примечание: Шаг 5.5 может производиться в тот же день 5.4, но мы нашли сигнал для концентрации триглицеридов, чтобы быть более надежные после ночи в холодильнике. Однако время между шаги 5.4 и 5.5 не должна превышать 36 часов.
    1. (Необязательно) Вихревой первой трубки с супернатанта жидкости для 10 s и Пипетка 5 мкл в чистой microcentrifuge трубку. 95 мкл 0,15 М NaCl, в новые пробки microcentrifuge. Храните эти проб в морозильной камере-20 ° C для более поздних assay протеина, при желании.
      Примечание: Эти образцы супернатант добавлен раствором NaCl может использоваться для определения содержания белка, с использованием предпочтительного пробирного исследователя. Мы используем метод Брэдфорд24. Содержание белка является одним из способов для стандартизации мерой содержания триглицеридов, но исследователь также должны быть осторожны в толковании эти соотношения с упражнения и диета также может влиять на хранение белка.
    2. Для оригинального супернатанта флаконов вихревой первой трубки с супернатанта жидкости для 10 s, а затем пипеткой 5 мкл в два отдельных скважин 96-луночных микропланшетов производить технические реплицирует. Обязательно обратите внимание какие скважин используются для каждого образца. Повторите этот шаг для 39 других труб.
    3. Пипетка точно 5 мкл заготовки в четыре скважины микроплиты, а для остальных скважин, Пипетка ровно 5 мкл каждого стандарта в трех экземплярах.
    4. Добавить triglycerol ровно 125 мкл рабочего раствора для каждой скважины и позволяют решение реагировать на 30 мин.
    5. 96-луночных пластины в спектрофотометр и читать поглощения на 540 Нм.
    6. Преобразование значений поглощения в концентрации (мг/мл) с использованием стандартной кривой, исходя из стандартов.

Representative Results

Мы особенно заинтересованы в выявлении факторов, которые способствуют общей метаболической здоровья индивидуума. Ранее было установлено, что взаимодействия генотипа, диета существенно способствовать населения уровня различия в метаболических черты14. Это означает, что каждый генотипа реагирует на экологические различия на основе уникальных и сложных. Чтобы расширить нашу работу по воздействию генотип по окружающей среде включить физические упражнения, мы разработали TreadWheel, которая способна к подвергая большое количество генотипов в аэробных интервал подготовки (АТИ) в духе высокой пропускной способности.

Чтобы установить, влияет ли упражнения на TW на метаболические черты, мы измерили триглицеридов хранения в Орегон-R (Орер) и y1w1 мухи, общей wildtype мух (рис. 2B-C) и нормализации этих ценностей против мух концентрация белка, как первоначально сообщили в Мендес и др. 11. Мы проанализировали данные на многомерный дисперсионный анализ (MANOVA) учета генотипа, секс, осуществлять лечение (и их взаимодействия), и экспериментальной блок эффектов, таких как время реплицирует и продовольствия флакон и обнаружил, что существует значительный генотип, осуществлять взаимодействие (p = 0,0017) затрагивающих триглицеридов хранения. Существовал значительный эффект сексуальной диморфных между мужчинами и женщинами, с самцами, хранение более триглицеридов, чем женщины (p < 0.0001). Мы увидели, что у женщин, осуществляется мух были значительно ниже уровня триглицеридов, чем их коллеги-неосуществленный (рис. 2B, p < 0.0001). В мужчины в то время как снижение триглицеридов хранения наблюдается в Орегон-R осуществили мух (по сравнению с элементов управления) не была статистически значимой, было отмечено существенное различие в триглицеридов хранения между две отдельные линии (Рисунок 2C, p < 0.0001). Обратите внимание, что хотя стандартизации концентрации триглицеридов против концентрации протеина дает представление о целом летать тела состав коэффициенты, сравнение прямых концентрации триглицеридов или белка между различными группами мух может также предоставить конкретную информацию о влиянии тренировки на эти фенотипы индивидуально.

Так как переменные, как взрослый упражнения, секс, и показано, что генотип влияет на триглицеридов хранения, ожидалось, что эти факторы также влияют другие фенотипы и взаимодействовать с диеты. Мы подняли личинок от представителя wildtype дрозофила генетических ссылку панели линии (DGRP 153)25 высоким содержанием жира или нормальной диете и индуцированных упражнения в взрослых мух на одну неделю (рисA). Впоследствии мы провели пробирного кольцо как отрицательный geotaxis для измерения восхождение способности. Альпинистские assay используется отличается от стандартного анализа кольцо; Вместо того, чтобы кольцо аппарата флаконы с парафином пленку отверстия были использованы для дома мух assay. Другие аспекты оригинальной assay кольцо, такие как время между выстукивать мух в нижней части флакона и принимая Фото, были сохранить22.

Все процедуры были повторены три отдельных раз с минимальными 59 отдельных летит за время репликации и лечения. Данные были проанализированы путем учета MANOVA для диеты, генотип, секс, осуществлять лечение (и их взаимодействия), а также экспериментальных блок эффектов время репликации, пробирного флакона и флакон пробирного реплицировать. Мы обнаружили, что осуществляется самок поднялся значительно выше (p < 0,005) когда выращенные на высоких жиров, чем любой из других женщин лечения (рис. 2D). Для мужчины было замечено, что упражнения только улучшилось, восхождение, когда мужчины были подняты на нормальной диете, и те подняли на высоких жиров, показал никаких существенных изменений (рис. 2E). Мы также обнаружили значительные сексуально диморфных эффектов (p < 0,0001) в восхождение с самцами, поднимаясь выше, чем среди женщин. Неожиданный результат снижение восхождение производительности, после тренировки для женщин от линии DGRP 153 (Рисунок 2D) для женщин, потребляющих нормальной диете (p < 0.0001) является примером того, как этот тип тренировки не может быть равномерно позитивного вмешательства для всех генотипов и могут зависеть от других факторов окружающей среды. В Мендес и др. 11, женщины из четырех других генетических линий, проверены на их восхождение производительности после подняв на нормальной диеты все показали расширенной восхождение способность осуществлять подготовку. Это говорит о том, что ответ, наблюдается в DGRP 153 генотип конкретные и не общие свойства лечения упражнения TW. Изменчивость в ответ через секс, диета и упражнения лечение групп показывает, что значимых взаимодействий секс, диеты, упражнения, которые влияет на восхождение способность линии (p < 0.0001).

Взятые вместе, результаты показывают, что влияние физических упражнений на здоровье взрослых летать метаболических может быть функцией его пола, генотипа и личинок диеты. Фенотипические различия наблюдаются в ответ на генотип, переменные среды (например, диета и физические упражнения) и секс также наблюдается в других исследованиях11,12,14,15. Таким образом TW и дрозофилы может быть мощной стратегией для выяснения генетические и экологические факторы, формирующие метаболически здоровье.

Figure 1
Рисунок 1 : Машина тренировки TreadWheel. (A) машина держит 48 ампул и имеет функцию регулируемой скоростью. Здесь были проведены эксперименты на 4 об/мин. (B) индивидуального продовольственного флаконах, содержащих экспериментальной мух были дал осечку в скобки, прилагается к вращающейся оси. (C) расстояние между флакон plug и еда был 6 см для упражнения флаконов и 1 см для контроля ампул. Флаконы были затем размещены на машину для упражнения. (D) осуществление обратной пирамиды 5 день режим был использован для осуществления взрослых мух. Каждый день, еще пять минут было добавлено к одному из приступы упражнения для наращивания интенсивности упражнений, постепенно, который моделирует выносливость, интервал подготовки. Эта цифра была изменена от Мендес и др. 11. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Визуальные методы и представитель результаты. (A) методы для тестирования личиночной диеты и эффектов взаимодействия взрослого упражнения. Личинки были подняты на диете высокого жира или нормальной лабораторной и переключился на нормальную еду на eclosion. Взрослых мух были разделены по признаку пола, помещены в экспериментальной группы и осуществили пять дней подряд. Впоследствии кольцо как отрицательный geotaxis восхождение пробирного был проведен, и мухи были заморожены для измерения триглицеридов. Представитель триглицеридов данные приведены для двух генетических линий, Орегон R и y1w1 для мужчины (C) и (B). Все мухи были выращены на нормальную диету и в зрелом возрасте. Уровни с разными буквами значительно отличаются (p < 0,05) с помощью студентом пост Специального t-теста. Эта цифра содержит подмножество данных, сообщаемых в Мендес и др. 11. Представитель восхождение данные приведены для линии DGRP 153 для мужчины (E) и (D). Каждая точка представляет усредненной восхождение производительность 232 или более лиц через три независимых время точки. Планки погрешностей указывают одна стандартная ошибка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Supplemental Figure 1
Дополнительные рисунок 1: Подробная схема TreadWheel. (A) схема структуры двойной флакон зажим используется для присоединения флаконов на машину. (B) внутренний вид машины вращения привода системы. (C) Параллельная проекция из передней панели компьютера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительного кода файл: TreadWheel.skp Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Discussion

Протокол упражнения, описанные здесь было показано, что успешно стимулировать нежный упражнения в дрозофилы и может использоваться для имитации выносливость упражнения в управляемой лаборатории, установив11. Следует отметить, что, когда первоначально разработка концепции TreadWheel, мы рассматривали коммерческих продуктов, которые могут быть изменены аналогичным образом выполнять (например, лаборатории вертел). Однако мы в конечном итоге отверг этот подход, выбор заказных дизайн, потому что торговое оборудование не имеет достаточно низкий вращения (4 мин) и не хватало достаточного потенциала флакон для поколения высок объём образца.

Сам протокол TW может корректироваться охватывают широкий спектр тем научных исследований. Например регулируя частоту и продолжительность мух Упражнение режимов может изменить интенсивность работы аутов, которые они получают. Путем расширения протокола, больше, чем за одну неделю или на другие возрастные группы, можно было бы изучить последствия осуществления на старение и различных заболеваний, связанных с возрастом. Мы рекомендуем, что если реализован расширенный упражнения подход, по крайней мере один выходной день в неделю следует добавить для восстановления. Производительности и улучшение было показано выше в режимах, которые включены в день восстановления чем те режимы, используемые подряд ежедневных упражнений12. Кроме того мы хотели бы предостеречь против расширения упражнения схватки длины последние 30 мин после привыкания к вращательное движение может произойти после длительного непрерывного осуществления11. Мы также отмечаем генетические вариации в мух мотивация для поддержания их уровня активности на TW11. Таким образом если больше приступов, рассмотрим мониторинг уровней активности мух, представленный Ватанабэ и загадка15,21 описанием их модификация TW концепции. Другие факторы, которые могут быть изменены включают температуры и сна бодрствования моделей, которые показываются также влияют на лету движения26,27.

Существует множество доступных анализов во время и после завершения протокола по борьбе с последствиями упражнения на физиологические, поведенческие и молекулярном уровне, а также потенциал для разгадать эпигенетические последствия упражнения. Дополнительные метаболической анализов (например, глюкоза, гликоген и белков), сердечной деятельности и воспалительной реакции меры могут быть использованы для дальнейшего изучения эффект упражнения имеет на лету физиологии и телом композиция12,14 ,24,28. Различные поведенческие изменения, связанные с индукции упражнения, такие как изменения в питании поведение, двигательной активности и сна, также может быть измерена с помощью инструментов, как кафе пробирного29 или деятельности, мониторинга устройств12,15 ,30. Изменения в экспрессии генов и клеточного дыхания, приписываемых осуществление также могут быть количественно с помощью методов как qRT-PCR11 и respirometry31. Наконец дрозофилы имеют ценные генетические доступных ресурсов, например панели ссылки генетики дрозофилы 2 и дрозофилы синтетических населения ресурсов, обеспечить исследователей платформу для выполнения количественные исследования генетических25,32. Эти инструменты позволяют сопоставления экспериментов, включая картирование генома всей ассоциации исследований и количественная черта локусов, для выявления кандидат локусов, связанные с упражнения и диета.

Исследования, выполненного с помощью TreadWheel продемонстрировал, что, в среднем, упражнение уменьшается вес тела, Общая триглицеридов хранения и гликогена, при одновременном повышении содержания белка и восхождение производительность11. Кроме того были переменной ответы на осуществление различных полов и генотипов для веса тела, а также триглицеридов, белка, гликогена, глюкозы и уровни активности11,15. В то время как изменчивость реагирования проявлять и диета разных генотипов и секс может быть сложно интерпретировать, и, порой, нелогичным, он отражает источники реальных биологических изменения, наблюдаемые в природных популяциях. Поскольку мы стремимся понять разнообразие базовых факторов, способствующих высокой ставки Мец, инструменты, которые облегчают распутывание относительную роль различных факторов путем тестирования этих факторов в модельных организмов будет иметь решающее значение для нашей способности Разработка персональной мероприятий по профилактике и лечению. Чтобы полностью оценить эффективность упражнений, каждый из этих факторов и их взаимодействия должны рассматриваться при проведении экспериментов и формулирования выводов.

TW, как большинство других летать тренажеры, ограничен в его способность количественно лету движение. Недавно Ватанабэ и загадка разработали вращающихся упражнения количественной системы (REQS), TW позвоночника, изменение с активностью мониторинга (LAM25H) от системы мониторинга дрозофилы серии15,21. Как TW эта система использует вращательного движения нежно побудить упражнения при использовании LAM25H руку, чтобы отслеживать и количественно летать деятельности, но он имеет меньшее количество флаконов (32 флаконов) чем TW15. Для высокой пропускной способности осуществлять исследования если деятельность количественная оценка не является необходимым или желаемого, TW позволяет для большего числа образцов. TW дизайн также могут быть изменены из его текущей формы, чтобы вместить большее количество флаконов. Эта система, наряду с другими существующими методами упражнения, помогли установить, что упражнения не только достижимые в дрозофилы , но также могут быть изучены для определения воздействия физической активности на различные физиологические и молекулярных реакций 11,12,15. Таким образом TW, как проверенный метод вызывая нежный упражнения в мух, может использоваться для зонда большое разнообразие биологических вопросов.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить Джули Jarnigan, Meredith Owens, Рэйчел Хилл, Брэндон Moye, Лаура Mafla, Оливия рыбы и остальная часть Reed лаборатории за их помощь с лету животноводства и обработки изображений. Шон Mendez построен оригинальный TreadWheel при содействии ЗАО механический цех. Для этого исследования финансировались НИЗ-R01 GM 098856 LKR и творчества студентов и научных исследований Академии в университете Алабамы КЕЛЬ и BJW.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials for TreadWheel Construction:
Heavy Duty Vibration-Damping leveling Mount McMaster-Carr 60855K71 Quantity: 4
Stainless Steel Ball Bearing McMaster-Carr 57155K306 Quantity: 8
Plug-in Voltage Transformer (500MA, 120VAC input, 24 VAC output) McMaster-Carr 70235K16 Quantity: 1
Compact Square-Face DC Gear motor McMaster-Carr 6409K23 Quantity: 1
Tool Holder (clamps) McMaster-Carr 1723A22 Quantity: 5 (10x)
12L14 Carbon Steel Tight-Tolerance Rod McMaster-Carr 5227T24 Quantity: 1
Set Screw Shaft Collar McMaster-Carr 6432K13 Quantity: 8
Round-Belt Pulley McMaster-Carr 6284K51 Quantity: 5
Dart Controls – 25 Max RPM, Electric AC DC Motor McMaster-Carr 13DV 1A Quantity: 1
Materials for Fly Maintenace and Husbandry
6 oz Square Bottom Bottles (polypropylene) Genesee Scientific 32-130 Quantity: 1
35x10mm Petri Dishes VWR 82050-536 Quantity: 1
Narrow Drosophila vials Genesee Scientific 32-116 Quantity: 1
Flystuff Flypad Genesee Scientific 59-114 Quantity: 1
Blowgun, Mini Genesee Scientific 54-104 Quantity: 1
Materials for RING-like Assay:
ImageJ software NIH https://imagej.nih.gov/ij/ Quantity: 1
1 cM graph paper or drawn grid (at least 20 cM by 30 cM) various Quantity: 1
digital camera with timer or smart phone with camera timer app various Quantity: 1
Materials for Triglyceride Assay:
Dewar Flask VWR 14200-960 Quantity: 1
Serum Triglyceride Determination Kit Sigma Aldrich TRO100 Quantity: 1
Cordless Pestle Motor VWR 47747-370 Quantity: 1
Pestles VWR 47747-358 Quantity: 1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yanovski, J. A. Pediatric obesity. An introduction. Appetite. 93, 3-12 (2015).
  2. Alberti, K. G. M. M., Zimmet, P., Shaw, J. Metabolic syndrome-a new world-wide definition. A Consensus Statement from the International Diabetes Federation. Diabetic Medicine. 23, 469-480 (2006).
  3. American Diabetes Association. 6. Obesity Management for the Treatment of Type 2 Diabetes. Diabetes Care. 39, Suppl 1 47-51 (2016).
  4. Bliddal, H., Leeds, A. R., Christensen, R. Osteoarthritis, obesity and weight loss: evidence, hypotheses and horizons - a scoping review. Obesity Reviews. 15, 578-586 (2014).
  5. Bray, G. A. The epidemic of obesity and changes in food intake: the Fluoride Hypothesis. Physiol. Behav. 82, 115-121 (2004).
  6. O'Rahilly, S., Farooqi, I. S. Genetics of obesity. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 361, 1095-1105 (2006).
  7. Kenkre, J., Tan, T., Bloom, S. Treating the obese diabetic. Expert Rev Clin Pharmacol. 6, 171-183 (2013).
  8. Fiuza-Luces, C., Garatachea, N., Berger, N. A., Lucia, A. Exercise is the Real Polypill. Physiology. 28, 330-358 (2013).
  9. Matos, A., et al. Acute exercise reverses TRB3 expression in the skeletal muscle and ameliorates whole body insulin sensitivity in diabetic mice. Acta Physiologica. 198, 61-69 (2010).
  10. Mercken, E. M., Carboneau, B. A., Krzysik-Walker, S. M., de Cabo, R. Of mice and men: The benefits of caloric restriction, exercise, and mimetics. Ageing Research Reviews. 11, 390-398 (2012).
  11. Mendez, S., et al. The TreadWheel: A Novel Apparatus to Measure Genetic Variation in Response to Gently Induced Exercise for Drosophila. PLoS ONE. 11, 0164706 (2016).
  12. Piazza, N., Gosangi, B., Devilla, S., Arking, R., Wessells, R. Exercise-Training in Young Drosophila melanogaster Reduces Age-Related Decline in Mobility and Cardiac Performance. PLoS ONE. 4, 5886-5911 (2009).
  13. Graham, P., Pick, L. Drosophila as a Model for Diabetes and Diseases of Insulin Resistance. Fly Models of Human Diseases. 121, 397-419 (2017).
  14. Reed, L. K., et al. Genotype-by-Diet Interactions Drive Metabolic Phenotype Variation in Drosophila melanogaster. Genetics. 185, 1009-1019 (2010).
  15. Watanabe, L. P., Riddle, N. C. Characterization of the Rotating Exercise Quantification System (REQS), a novel Drosophila exercise quantification apparatus. PLoS ONE. 12, 0185090 (2017).
  16. Tinkerhess, M. J., Ginzberg, S., Piazza, N., Wessells, R. J. Endurance training protocol and longitudinal performance assays for Drosophila melanogaster. J Vis Exp. , (2012).
  17. Tinkerhess, M. J., et al. The Drosophila PGC-1α Homolog spargel Modulates the Physiological Effects of Endurance Exercise. PLoS ONE. 7, 31633 (2012).
  18. Sujkowski, A., Bazzell, B., Carpenter, K., Arking, R., Wessells, R. J. Endurance exercise and selective breeding for longevity extend Drosophila healthspan by overlapping mechanisms. Aging. 7, 535-552 (2015).
  19. Tjønna, A. E., et al. Aerobic Interval Training Versus Continuous Moderate Exercise as a Treatment for the Metabolic Syndrome: A Pilot Study. Circulation. 118, 346-354 (2008).
  20. Ciolac, E. G., et al. Effects of high-intensity aerobic interval training vs. moderate exercise on hemodynamic, metabolic and neuro-humoral abnormalities of young normotensive women at high familial risk for hypertension. Hypertension Research 2010 33:8. 33, 836-843 (2010).
  21. Watanabe, L. P., Riddle, N. C. Measuring exercise levels in Drosophila melanogaster using the Rotating Exercise Quantification System (REQS). J Vis Exp. , (2018).
  22. Gargano, J., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental Gerontology. 40, 386-395 (2005).
  23. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods 2012 9:7. 9, 671-675 (2012).
  24. Hammond, J. B. W., Kruger, N. J. New Protein Techniques. 3, 25-32 (1988).
  25. Mackay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482, 173-178 (2012).
  26. Miquel, J., Lundgren, P. R., Bensch, K. G., Atlan, H. Effects of temperature on the life span, vitality and fine structure of Drosophila melanogaster. Mechanisms of Ageing and Development. 5, 347-370 (1975).
  27. Berlandi, J., et al. Swing Boat: Inducing and Recording Locomotor Activity in a Drosophila melanogaster Model of Alzheimer's Disease. Front Behav Neurosci. 11, 159 (2017).
  28. Leng, S. X., et al. ELISA and Multiplex Technologies for Cytokine Measurement in Inflammation and Aging Research. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 63, 879-884 (2008).
  29. Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 8253-8256 (2007).
  30. Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. Assaying locomotor activity to study circadian rhythms and sleep parameters in Drosophila. J Vis Exp. , (2010).
  31. MÖlich, A. B., FÖrster, T. D., Lighton, J. R. B. Hyperthermic Overdrive: Oxygen Delivery does Not Limit Thermal Tolerance in Drosophila melanogaster. Journal of Insect Science. 12, 1-7 (2012).
  32. Long, A. D., Macdonald, S. J., King, E. G. Dissecting complex traits using the Drosophila Synthetic Population Resource. Trends in Genetics. 30, 488-495 (2014).

Tags

Генетика выпуск 136 физические упражнения дрозофилы аэробные интервал подготовки (МТА) метаболический синдром ожирение триглицеридов хранения негативные geotaxis взаимодействия генотипа по окружающей среде
TreadWheel: Интервал подготовки протокола для нежно индуцированной упражнения в <em>Drosophila melanogaster</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lowman, K. E., Wyatt, B. J.,… More

Lowman, K. E., Wyatt, B. J., Cunneely, O. P., Reed, L. K. The TreadWheel: Interval Training Protocol for Gently Induced Exercise in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (136), e57788, doi:10.3791/57788 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter