Summary

Enkelt dråbe Digital Polymerase Chain Reaction for omfattende og samtidige påvisning af mutationer i Hotspot regioner

Published: September 25, 2018
doi:

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at nøjagtigt kvantificere flere genetiske ændringer af et målområde i en enkelt reaktion ved hjælp af drop-off ddPCR og et unikt par hydrolyse sonder.

Abstract

Droplet digital polymerase kædereaktion (ddPCR) er en meget følsomme kvantitative polymerase kædereaktion (PCR) metoden baseret på prøve fraktionering i tusindvis af nano-størrelse vand-i-olie individuelle reaktioner. For nylig, er ddPCR blevet et af de mest nøjagtige og følsomme værktøjer for cirkulerende tumor DNA (ctDNA) registrering. En af de store begrænsninger i standard ddPCR teknik er det begrænsede antal mutationer, der kan blive screenet pr. reaktion, som specifikke hydrolyse sonder anerkende hver muligt allel version er påkrævet. En alternativ metode, drop-off ddPCR, øger overførselshastighed, da det kræver kun et enkelt par sonder til at detektere og kvantificere potentielt alle genetiske ændringer i den målrettede region. Drop-off ddPCR viser sammenlignelige følsomhed for konventionelle ddPCR assays med fordelen ved påvisning af et større antal mutationer i en enkelt reaktion. Det er omkostningseffektiv, sparer dyrebare prøvemateriale og kan også bruges som en opdagelse værktøj, når mutationer ikke er kendt på forhånd.

Introduction

Tusindvis af somatiske mutationer relateret til udviklingen af kræft har været rapporteret1. Blandt disse, nogle få er forprogrammeret markører for effekten af målrettede terapi 2,3 og genetisk screening af disse mutationer er nu rutinemæssig klinisk praksis. Droplet digital PCR (ddPCR) teknologi kan bruges til at overvåge tilstedeværelsen eller fraværet af mutationer med lang opdagelse nøjagtighed og er yderst kompatibel med non-invasiv likvide biopsier4,5. Nuværende ddPCR assays er dog primært beregnet til at påvise mutationer kendt på forhånd. Dette begrænser i høj grad brug af ddPCR som en opdagelse værktøj når mutationen er ukendt. Faktisk, i konventionelle ddPCR design, en hydrolyse sonde anerkende vildtypeallelen (WT sonde) konkurrerer med en bestemt probe anerkende den mutante allel (MUT sonde) (figur 1A). Sonden med højere affinitet hybridiserer til skabelonen og frigiver sin fluorophore, med angivelse af arten af den tilsvarende allel. Fluorescens oplysningerne for hver dråbe kan visualiseres i en scatter plot der repræsenterer fluorescens udledes af WT og MUT sonderne i forskellige dimensioner. En skematisk fremstilling af en typisk resultat for en konventionel ddPCR assay er præsenteret i figur 1A. I dette eksempel svarer blue sky til dråber indeholdende WT alleler identificeret ved WT sonden, mens den røde Sky svarer til dråber som MUT allel er blevet forstærket og identificeret af MUT sonden. Afhængigt af mængden af DNA indlæst i reaktionen, kan dobbelt positive dråber indeholdende både WT og MUT amplikoner vises (grøn Sky). Lys grå Sky svarer til tomme dråber.

Da de fleste platforme giver mulighed for påvisning af et begrænset antal fluorophores (normalt 2, men op til 5), er overførsel af konventionelle ddPCR begrænset. Derfor kræver rette sig mod regioner med flere tilstødende mutationer design af teknisk udfordrende multiplex ddPCR assays eller brug af flere reaktioner rettet mod hver enkelt mutation i parallel. Drop-off ddPCR strategi, overvinder denne begrænsning, som det kan potentielt afsløre genetiske ændring inden for et målområde ved hjælp af en unik WT hydrolyse sonder. De første sonde (sonde 1) dækker en ikke-variable sekvens, støder op til regionen mål og den anden sonde (sonde 2) er et supplement til WT sekvens af regionen mål hvor mutationer er forventet (figur 1B). Mens den første sonde kvantificerer det samlede beløb for amplifiable molekyler i reaktionen, diskriminerer den anden sonde WT og MUT alleler af sub-optimale hybridisering til mutant sekvenser. Sonden 2 kan identificere flere typer af mutationer i target region (enkelt eller flere nukleotid erstatninger, sletning, etc.)6. Som i konventionelle ddPCR svarer lys grå sky til dråber indeholder ingen DNA molekyler. Det er vigtigt at erindre, at i denne type analyse, optimal adskillelse af WT og MUT skyer er afhængig af mængden af DNA indlæst i reaktionen, da dråber indeholdende både WT og MUT target alleler ikke kan skelnes fra dråber indeholder kun WT form. Denne analyse kræver derfor, at de fleste dråber indeholder mere end én kopi af målrettede genet.

Protocol

Protokollen præsenteres her følger de etiske retningslinjer for Institut Curie. Alle menneskelige prøver blev indhentet fra patienter tilmeldt, efter informeret samtykke, i undersøgelser, der er godkendt af den institutionelle Review Board på Institut Curie. 1. blod samling, Plasma opbevaring og celle-gratis DNA-ekstraktion Bemærk: DNA ekstraheret fra enhver form for “væv” kan bruges (fx friske eller formaldehyd-fast paraffin indlejret (FFPE) væv, cel…

Representative Results

I en proof of concept undersøgelse undersøgte Kommissionen KRAS exon 2 mutationer (kodon 12 og 13) og EGFR exon 19 sletninger i FFPE væv og plasmaprøver fra patienter bruger drop-off ddPCR strategi6. KRAS drop-off sonden afhørt en 16 bp regionen omfatter flere mutationer i exon 2 af KRAS -genet, som havnen mere end 95% af de kendte KRAS mutationer i mennes…

Discussion

For at designe en effektiv drop-off ddPCR analyse, optimering er afgørende, og protokollen skal følges nøje. Hver kombination af primere og sonder har en unik PCR reaktion effektivitet. Således har en individuel analyse skal valideres omhyggeligt på kontrolprøver inden det anvendes på værdifulde prøveemner. Optimering og validering er vigtigt at certificere peak signal detection og vurdere specificiteten og følsomheden. Som beskrevet i protokollen, kan alle mutationer i et målområde, er omfattet af “sonde 2” …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af Institut Curie SiRIC (grant Inka-DGOS-4654). Forfatterne ønsker også at takke Caroline Hego for hendes bidrag til videoen.

Materials

K2EDTA tube (color code : lavender) BD 367863 EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol) Qiagen 55114 For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol) Qiagen 937556 For isolation of free-circulating DNA from human plasma
QIAsymphony SP system Qiagen 9001297 fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification
QIAvac 24 Plus Qiagen 19413 For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously
Qubit fluorometer Invitrogen Q33226 The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA
QX100 or QX200 reader Bio-Rad 186-3003 or186-4003, respectively The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector
QX100 or QX200 droplet generator Bio-Rad 186-3002 or 186-4002, respectively Instrument used for droplet generation
C1000 thermal cycler Bio-Rad 1851196 Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module
Plate sealer Bio-Rad 181-4000 PX1™ PCR plate sealer
DG8 cartridge holder Bio-Rad 186-3051 Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation
Droplet generator cartridges and gaskets Bio-Rad 186-4007 Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation
PCR supermix Bio-Rad 186-3010 ddPCR supermix for probes (no dUTP)
96-well PCR plates Eppendorf 951020362 96-well semi-skirted plates
Foil seal Bio-Rad 181-4040 Pierceable foil heat seal
ddPCR Droplet Reader Oil Bio-Rad 186-3004 oil used in the read
Droplet Generation Oil for Probes Bio-Rad 186-3005 oil for droplet generation
DNA loBind Tube 1.5 mL Eppendorf 0030 108.051 Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding
Multiplex I cfDNA Reference Standard Set HORIZON HD780 The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations
QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500 Life Technologies Q32854 The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL
Qubit Assay Tubes Life Technologies Q32856 Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer

References

  1. Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).
  2. Amado, R. G., Wolf, M., et al. Wild-Type KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients With Metastatic Colorectal Cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (10), 1626-1634 (2008).
  3. Karapetis, C. S., Khambata-Ford, S., et al. K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer. New England Journal of Medicine. 359 (17), 1757-1765 (2008).
  4. Postel, M., Roosen, A., Laurent-Puig, P., Taly, V., Wang-Renault, S. -. F. Droplet-based digital PCR and next generation sequencing for monitoring circulating tumor DNA: a cancer diagnostic perspective. Expert Review of Molecular Diagnostics. 18 (1), 7-17 (2018).
  5. Saliou, A., Bidard, F. -. C., et al. Circulating tumor DNA for triple-negative breast cancer diagnosis and treatment decisions. Expert Review of Molecular Diagnostics. 16 (1), 39-50 (2015).
  6. Decraene, C., Silveira, A. B., et al. Multiple Hotspot Mutations Scanning by Single Droplet Digital PCR. Clinical chemistry. 64 (2), 317-328 (2018).
  7. Untergasser, A., Cutcutache, I., et al. Primer3–new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), e115 (2012).
  8. Snyder, M. W., Kircher, M., Hill, A. J., Daza, R. M., Shendure, J. Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin. Cell. 164 (1-2), 57-68 (2016).
  9. Bidshahri, R., Attali, D., et al. Quantitative Detection and Resolution of BRAF V600 Status in Colorectal Cancer Using Droplet Digital PCR and a Novel Wild-Type Negative Assay. The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 190-204 (2016).
  10. Attali, D., Bidshahri, R., Haynes, C., Bryan, J. ddpcr: an R package and web application for analysis of droplet digital PCR data. F1000Research. 5, (2016).
  11. Forbes, S. A., Beare, D., et al. COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution. Nucleic Acids Research. 45 (D1), D777-D783 (2017).
check_url/58051?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Decraene, C., Bortolini Silveira, A., Michel, M., Bidard, F., Pierga, J., Stern, M., Proudhon, C. Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions. J. Vis. Exp. (139), e58051, doi:10.3791/58051 (2018).

View Video