Droplet יחיד שרשרת התגובה פולימראז דיגיטלי עבור זיהוי מקיף, בו זמנית של מוטציות באזורים חמה
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכמת במדויק מספר שינויים גנטיים של אזור היעד בתגובה יחיד באמצעות מסירה ddPCR וזוג הידרוליזה הגששים ייחודי.
Abstract
Droplet דיגיטלי תגובת שרשרת פולימראזית (ddPCR) היא שיטה תגובת שרשרת (PCR) רגישה מאוד פולימראז כמותי המבוסס על מדגם fractionation לאלפי בגודל ננו תגובות בודדות מים בתוך שמן. לאחרונה, ddPCR הפך להיות אחד הכלים הכי מדויק ורגיש עבור מחזור הגידול זיהוי ה-DNA (ctDNA). אחת המגבלות הגדולות של הטכניקה ddPCR רגיל הוא מספר מוגבל של מוטציות יכולים להיות מוקרן לכל תגובה, כנדרש הגששים הידרוליזה ספציפי לזהות כל גירסה allelic אפשרי. מתודולוגיה חלופיים, ddPCR מסירה, מגדיל את התפוקה, מכיוון שהיא דורשת רק זוג אחד של הגששים כדי לזהות ולכמת באופן פוטנציאלי כל שינויים גנטיים באזור ממוקד. מסירה ddPCR מציג רגישות דומה ddPCR קונבנציונאלי מבחני עם היתרון של זיהוי מספר רב יותר של מוטציות בתגובה אחת. שזה חסכוני, חוסך חומר מדגם היקר, יכול לשמש גם ככלי גילוי כאשר מוטציות לא ידועים א-פריורי.
Introduction
אלפי סומאטית מוטציות הקשורות להתפתחות סרטן כבר דווח על1. בין אלה, כמה סמנים חזוי יעילות של טיפול ממוקד 2,3 , גנטית ההקרנה של מוטציות אלו היא עכשיו שגרתית הקלינית. הטכנולוגיה הדיגיטלית droplet PCR (ddPCR) יכול לשמש כדי לפקח על הנוכחות או העדר של מוטציות עם דיוק זיהוי גבוהה והוא מאוד תואם עם ביופסיות נוזלי לא פולשנית4,5. עם זאת, מבחני ddPCR הנוכחי נועדו בעיקר כדי לזהות מוטציות ידוע א-פריורי. קשות, זה מגביל את השימוש ddPCR ככלי גילוי כאשר המוטציה לא ידוע. אכן, עיצוב ddPCR המקובלת, בדיקה הידרוליזה להכרת אלל פראי-סוג (WT העצמית) מתחרה עם בדיקה ספציפית להכרת אלל mutant (בדיקה MUT) (איור 1 א’). החללית עם זיקה גבוהה יותר hybridizes על תבנית ומשחרר שלה fluorophore, המציין את אופי אלל המתאימים. ניתן לאבחן את נתוני קרינה פלואורסצנטית השיג עבור כל droplet בחלקה פיזור המייצג את קרינה פלואורסצנטית הנפלטת את הגששים WT ו MUT בממדים שונים. ייצוג סכמטי של תוצאה אופיינית עבור assay ddPCR המקובלת מוצג איור 1A. בדוגמה זו, הענן הכחול מקביל טיפות המכילות אללים WT המזוהה על-ידי החללית WT, ואילו הענן האדום מקביל טיפות בו אלל MUT יש כבר מוגבר, מזוהה על ידי החללית MUT. תלוי בכמות הדנ א שטעון התגובה, טיפות חיובית כפולה המכילה amplicons WT והן MUT יכולים להופיע (ענן ירוק). ענן אפור בהיר מקביל טיפות ריק.
מאז רוב פלטפורמות לאפשר הגילוי של מספר מוגבל של fluorophores (בדרך כלל 2, אבל עד 5), התפוקה של ddPCR המקובלת היא מוגבלת. לכן, מיקוד באזורים בעלי מוטציות סמוכים מרובים דורשת תכנון טכנית מאתגר מבחני ddPCR מולטיפלקס או השימוש של מספר תגובות מיקוד כל מוטציה במקביל. האסטרטגיה ddPCR מסירה, מתגבר על מגבלה זו, כפי שעשוי להיות ניתן לזהות כל שינוי גנטי בתוך אזור היעד באמצעות זוג ייחודי של WT הידרוליזה הגששים. הכריכה בדיקה (בדיקה 1) הראשון שרצף שאינו משתנה, סמוך לאזור היעד המכשיר השני (המכשיר 2) הוא משלים הרצף WT של אזור היעד שבו מוטציות הם צפויים (איור 1B). בעוד החללית הראשונה מכמת את הסכום הכולל של המולקולות amplifiable של התגובה, המכשיר השני מפלה אללים WT ו MUT על ידי הכלאה תת אופטימלית כדי mutant רצפי. בדיקה 2 ניתן לזהות מספר סוגים של מוטציות בהיעד אזור (נוקלאוטיד בודד או מספר החלפות, מחיקה וכו ‘)6. כמו ddPCR רגיל, ענן אפור בהיר מקביל טיפות המכילה מולקולות DNA אין. חשוב לזכור כי בסוג זה של assay, ההפרדה אופטימלית של עננים WT ו MUT הוא תלוי כמות ה-DNA שטעון התגובה, שכן לא ניתן להבחין בין טיפות המכילות WT והן MUT אללים היעד של טיפות המכיל רק את WT טופס. לכן, וזמינותו זו דורשת רוב טיפות יכיל לא יותר מעותק אחד של הגן יישוב.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי לעצב assay ddPCR יעילה מסירה, אופטימיזציה הוא מכריע, הפרוטוקול צריך להתבצע בזהירות. כל שילוב של צבעי יסוד וזונדים יש יעילות התגובה הייחודי של ה-PCR. לפיכך, וזמינותו הפרט חייב לאשר בקפידה על דגימות הבקרה לפני בשימוש על ערך הבדיקה דוגמאות. אופטימיזציה ובדיקת חשובים לאשר את שיא אות זיהוי והערכת ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מכון קירי SiRIC (גרנט האינקה-DGOS-4654). המחברים רוצים גם להודות קרוליין Hego על תרומתה הווידאו.
Materials
| K2EDTA tube (color code : lavender) | BD | 367863 | EDTA tubes are used to obtain a whole blood or EDTA plasma sample |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (manual protocol) | Qiagen | 55114 | For isolation of free-circulating DNA from human plasma |
| QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (automated protocol) | Qiagen | 937556 | For isolation of free-circulating DNA from human plasma |
| QIAsymphony SP system | Qiagen | 9001297 | fully integrated and automated system for cfDNA, DNA or RNA purification |
| QIAvac 24 Plus | Qiagen | 19413 | For purification of up to 24 cfDNAs simultaneously |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q33226 | The Qubit fluorometer is a benchtop fluorometer for the quantitation of DNA |
| QX100 or QX200 reader | Bio-Rad | 186-3003 or186-4003, respectively | The reader measures fluorescence intensity of each droplet and detects the size and shape as droplets pass the detector |
| QX100 or QX200 droplet generator | Bio-Rad | 186-3002 or 186-4002, respectively | Instrument used for droplet generation |
| C1000 thermal cycler | Bio-Rad | 1851196 | Modular thermal cycler platform, includes C1000 Touch thermal cycler chassis, 96-well fast reaction module |
| Plate sealer | Bio-Rad | 181-4000 | PX1™ PCR plate sealer |
| DG8 cartridge holder | Bio-Rad | 186-3051 | Positions and holds the DG8 cartridge in the instrument for droplet generation |
| Droplet generator cartridges and gaskets | Bio-Rad | 186-4007 | Microfluidic DG8 cartridge used to mix sample and oil to generate droplets; DG8 gaskets seal the cartridge to prevent evaporation and apply the pressure required for droplet formation |
| PCR supermix | Bio-Rad | 186-3010 | ddPCR supermix for probes (no dUTP) |
| 96-well PCR plates | Eppendorf | 951020362 | 96-well semi-skirted plates |
| Foil seal | Bio-Rad | 181-4040 | Pierceable foil heat seal |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio-Rad | 186-3004 | oil used in the read |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio-Rad | 186-3005 | oil for droplet generation |
| DNA loBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 0030 108.051 | Eppendorf LoBind Tubes maximize sample recovery by significantly reducing sample-to-surface binding |
| Multiplex I cfDNA Reference Standard Set | HORIZON | HD780 | The Multiplex I cfDNA Reference Standards are highly-characterized, biologically-relevant reference materials used to assess the performance of cfDNA assays that detect somatic mutations |
| QUBIT DSDNA HS ASSAY KIT, 500 | Life Technologies | Q32854 | The HS assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL |
| Qubit Assay Tubes | Life Technologies | Q32856 | Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer |
References
- Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).
- Amado, R. G., Wolf, M., et al. Wild-Type KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients With Metastatic Colorectal Cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (10), 1626-1634 (2008).
- Karapetis, C. S., Khambata-Ford, S., et al. K-ras mutations and benefit from cetuximab in advanced colorectal cancer. New England Journal of Medicine. 359 (17), 1757-1765 (2008).
- Postel, M., Roosen, A., Laurent-Puig, P., Taly, V., Wang-Renault, S. -. F. Droplet-based digital PCR and next generation sequencing for monitoring circulating tumor DNA: a cancer diagnostic perspective. Expert Review of Molecular Diagnostics. 18 (1), 7-17 (2018).
- Saliou, A., Bidard, F. -. C., et al. Circulating tumor DNA for triple-negative breast cancer diagnosis and treatment decisions. Expert Review of Molecular Diagnostics. 16 (1), 39-50 (2015).
- Decraene, C., Silveira, A. B., et al. Multiple Hotspot Mutations Scanning by Single Droplet Digital PCR. Clinical chemistry. 64 (2), 317-328 (2018).
- Untergasser, A., Cutcutache, I., et al. Primer3–new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research. 40 (15), e115 (2012).
- Snyder, M. W., Kircher, M., Hill, A. J., Daza, R. M., Shendure, J. Cell-free DNA Comprises an In Vivo Nucleosome Footprint that Informs Its Tissues-Of-Origin. Cell. 164 (1-2), 57-68 (2016).
- Bidshahri, R., Attali, D., et al. Quantitative Detection and Resolution of BRAF V600 Status in Colorectal Cancer Using Droplet Digital PCR and a Novel Wild-Type Negative Assay. The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 190-204 (2016).
- Attali, D., Bidshahri, R., Haynes, C., Bryan, J. ddpcr: an R package and web application for analysis of droplet digital PCR data. F1000Research. 5, (2016).
- Forbes, S. A., Beare, D., et al. COSMIC: somatic cancer genetics at high-resolution. Nucleic Acids Research. 45 (D1), D777-D783 (2017).
